一、實驗動物
脊髓小腦萎縮症第十七型之轉殖小鼠取自於國立臺灣師範大學生命科 學系謝秀梅副教授實驗室。此FVB 品系之轉殖小鼠由該實驗室建立，轉殖 的基因為帶有 109 個重複擴增多麩醯胺酸序列人類 TATA-box 結合蛋白
（human TATA-box binding protein with 109 polyQ；hTBP）。此小鼠自行繁 殖並飼養於本系動物房，室溫維持於 25 ± 2 ℃，飼料與水讓動物可以自 由取得，日夜週期為 12-12 小時。ICR 品系之小鼠則購自國立台灣大學動 物中心，飼養環境與FVB 品系相同。所有例行性的小鼠基因型鑑定由謝秀 梅副教授實驗室協助進行（圖一），動物手術及實驗步驟皆經由國立臺灣 師範大學動物管理委員會審核通過。
二、以whole body plethysmography 記錄小鼠呼吸運動
為 測 定 清 醒 小 動 物 的 呼 吸 運 動 ， 我 們 必 須 先 建 立 whole body plethysmography 來進行呼吸活動。這個裝置包含動物室與參考室（animal and reference chambers）體積各為 250 ml，兩室之間以一小段 PE 管聯通（圖 二），由於這段PE 管細小，動物室的壓力變化不致受到影響，參考室宛如 一個緩衝空間，卻又不影響動物呼吸時的壓力變化，所以，所測量動物室 的壓力其實是這兩室之間的壓力差。實驗時，這兩室都置於恆溫水浴槽
（Water Bath B206，Firstek，Taipei，ROC）內，水溫維持在 28～29 ℃（測 量新生鼠時水溫則維持在 32～33℃，以避免動物失溫）。動物置於動物室 中，當動物就在這個密閉的動物室內呼吸，吸氣時，動物室裡的氣體溫度 較低，被吸入肺部後因為體溫使之加溫且潮濕而壓力增加；呼氣時，動物 所呼出的氣體，進入到溫度較體溫為低的動物室中，使壓力降低(Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Epstein et al., 1980)。所以，動
物室內的壓力隨著動物呼吸運動而升降，我們可利用 differential pressure transducer（model ML141 Spirometer, ADInstruments, Castle Hill, Australia）
偵測動物室壓力的變化並與參考室做比較，也可以說是兩室之間的壓力 差，即可得到呼吸運動的壓力變化曲線。我們也同時記錄實驗時的氣壓，
以便計算呼吸體積時，作為校正之用。將所記錄的呼吸運動曲線資料經由 PowerLab system（ADInstruments, Castle Hill, Australia），將類比的訊號轉 為數位的訊號後，儲存在個人電腦的硬碟裡，以實驗完成後進行 off-line 分析。得到的數值包含了壓力變化高低、呼吸週期、吸氣時間與呼氣時間。
每次實驗前後利用針筒給予0.1 ml 之氣體，作為動物室的壓力校正之用，
如此即可利用下列公式利用壓力變化來求得潮氣容積(Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Onodera et al., 1997)。
上式中的符號分別是：
V
T
= 潮氣容積V
K
= 校正時注入動物室的體積（0.1ml）P
T
= 潮氣容積的壓力變化P
K
= 校正時注入一定量氣體體積時的壓力變化 TR
= 動物的體溫T
C
= 動物室的溫度 PB
= 大氣壓P
R
= 在體溫37℃時的水蒸氣壓力約為 6.27 kpa PC
= 動物室29℃時的水蒸氣壓力約為4.00 kpa所有利用whole body plethysmography 進行測量的實驗皆在下午 1 時至
5 時之間進行，該時間處於動物的光週期。實驗開始前將小鼠在持續給予 新鮮空氣的情況下先於動物室內適應30 分鐘以上，然後才開始進行實驗。
實驗開始測量時會關閉進氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行測量 3 分鐘，取其穩定非睡眠時的連續 100 次呼吸運動作分析，並於測量結束 後進行秤重。在每次測量時，每隻動物都有其獨自的動物室，之所以如此 是因為動物不進入有味道的動物室，也為了避免動物各自的體味影響實驗 結果，結束測量後，每一個動物室都必需清洗乾淨，並以70%酒精噴灑去 除氣味，以供下一次測量時使用。
三、聲門功能評估
聲門於吸氣時外展、面積增大，呼氣時內收、面積縮小，這是受到聲 帶運動的調控，而聲帶運動是由喉返神經管制，本研究以辣椒素興奮肺部 迷走神經C 纖維引起反射，即所謂肺化學反射，聲門功能正常時，會促使 聲門關閉(Lu et al., 2005, 2006)，也就是評估喉返神經的反應，在辣椒素的 作用下，喉返神經活動增強，使聲門內收作用增強而關閉。
（一）動物手術
在建立小鼠神經胞外記錄動物模式的過程中，實驗動物年齡橫跨 2 個 月至6 個月，實驗動物體重 FVB 品系約 20-29 克，ICR 品系約 28-40 克重。
實驗前先進行肌肉注射atropine（0.5 mg/kg，Sigma，St. Louis，MO，U.S.A.）
減少呼吸道黏液分泌，避免阻礙呼吸。以 urethane 腹腔注射（1.4 g/kg，
Sigma）進行麻醉，將動物仰臥並固定在恆溫墊（Homeothermic Blanket system，Stoelting Co.，Illinois，U.S.A.）上，插入肛溫棒測量體溫，利用 系統的回饋控制將體溫恆定在36-37 ℃。接著進行氣管插管，保持呼吸道 的暢通。利用 PE30 軟管進行右頸靜脈插管以作為投予藥物的途徑。右頸 靜脈插管的管端位於右心房入口處，並於距管端 30 μl 的位置有一分支，
接有微量注射針筒（Hamilton microsyringe），欲投予的藥物（辣椒素）會 藉由微量注射針筒推入右頸靜脈插管，接著再以1 毫升針筒推入 0.05 毫升 的生理食鹽水，使藥物直接進入右心房，並經由肺循環進入肺部興奮肺迷 走C 纖維接受器。
動物的呼吸模式分為自動呼吸與人工送氣。在人工送氣的動物模式 下 ， 會 以 人 工 呼 吸 機 （Model 131 ventilator， NEMI Scientific, Inc.，
Framingham，U.S.A.）維持其呼吸功能，由頸靜脈注射 gallamine thriethiodide
（5 mg/kg）麻痺動物肌肉以排除其自發的呼吸運動。將氣管插管連接上人 工呼吸器給予純氧，送氣體積調整在0.3～0.5 毫升，送氣頻率調整在每分 鐘110～130 次，人工呼吸器呼氣端管子置入水面下 2 公分以維持功能肺餘 量 。 並 利 用 二 氧 化 碳 分 析 儀 （Micro CapnoGraph CI240 ， Columbus Instruments，Ohio，U.S.A.）分析呼氣末之二氧化碳濃度，藉由調整送氣 體積與送氣頻率使動物維持在高氧的狀態，呼氣末之二氧化碳濃度維持在 4～5％之間。
（二）神經活性的測量
本實驗同時紀錄了支配橫隔肌運動的膈神經，支配聲門運動的喉返神 經，以及支配舌肌的舌下神經的活性變化。分離膈神經的方法是先切開鎖 骨附近的皮膚及肌肉層，在鎖骨周圍的臂神經叢附近與第四頸脊神經基部 找到膈神經，特徵是平行於迷走神經，下行至胸腔，而脊神經則是走向上 臂的末端方向。將膈神經與組織分離後，剪斷神經的遠端，利用不銹鋼雙 極電極與機械臂（KITE Economy Manual Micromanipulator，World Precision Instruments，Berlin, Germany）將膈神經置於電極上進行胞外記錄。喉返神 經位於氣管的兩側，向頭側延伸至喉部。為確保足夠的長度，選取鎖骨至 甲狀腺部份的喉返神經進行紀錄。先將喉返神經游離，可見到喉返神經位 於甲狀腺的下方。將神經從氣管與組織上游離，在接近喉部的一端剪斷，
利用白金絲雙極電極（Silver wire，A-M System Inc.，Washington State，
USA）與機械臂，將神經置於雙極電極上進行記錄。舌下神經亦是將遠端 切斷之後，利用機械臂將神經掛於不銹鋼雙極電極上進行測量。但因為舌 下神經雜訊較大以及樣本數目較少等因素，在本實驗並未加以統計分析。
在實驗過程中，利用液態石蠟油（paraffin oil）維持神經的溼潤。神經訊號 以放大器（P511，Grass，MA，U.S.A.）將訊號放大及濾波（0.3-3 kHz），
神經訊號經由Power Lab system 數位化之後，利用這個系統所提供的軟體 進行積分（Time constant＝0.05 s）並儲存於電腦硬碟中。
四、實驗設計與步驟
實驗共有三個部份，第一部份實驗是利用Whole body plethysmography 來測量清醒、未拘束狀態下SCA17 轉殖小鼠與 FVB 野生型小鼠的呼吸運 動。在實驗開始前，都會先使其於動物室內適應 30 分鐘以上，待其平靜 下來才開始進行實驗。實驗開始先通氣含有20％氧氣、80％氮氣模擬空氣 成份的氣體。測量時會關閉進氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行 測量3 分鐘後，再打開進氣口與出氣口，通入 20％氧氣、80％氮氣之氣體 使其回復。取其穩定非睡眠時的連續100 次呼吸運動作分析，並於測量結 束後進行秤重。二氧化碳濃度於三分鐘末時低於 1.5％。此外，並測量以 腹腔注射較低劑量 urethane（0.6g/kg）麻醉之後的動物，觀察麻醉前後對 於呼吸變異性的影響。
第二部份為測量在提高二氧化碳濃度的情況下，SCA17 轉殖小鼠與 FVB 野生型小鼠對偵測二氧化碳的能力及其相對應的反應是否有無差 異。在提高二氧化碳濃度的實驗中，在小鼠適應穩定之後，同樣先關閉進 氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行測量3 分鐘，觀察其對空氣的 反應作為控制組。再以空氣對動物室通氣5 分鐘，確保空氣成份穩定。之
後通入 3％或是 5％的二氧化碳氣體（其餘部份為 20％的氧氣與用氮氣平 衡）於動物室，確定二氧化碳濃度是否是 3％或是 5％是利用二氧化碳分 析儀測定，在確定二氧化碳濃度正確1 分鐘後，關閉進氣與出氣口，並開 始測量3 分鐘對二氧化碳濃度增加的反應。之後打開進氣口與出氣口，通 入空氣 5 分鐘維持成份穩定。再關閉進氣口與出氣口測量對空氣的反應 3 分鐘，觀察其恢復的情形。測量結束後進行秤重，當通入 3％二氧化碳濃 度於三分鐘末時低於 4.5％，通入 5％二氧化碳濃度於三分鐘末時低於 6.8
％。經由測試，以流速 9 ml／秒通氣 30 秒內動物室可以充滿 90％以上的 目標氣體。資料的取得以其穩定非睡眠時的連續100 次呼吸運動作呼吸變 異性的統計與分析。
第三部份實驗是為了測試SCA17 轉殖小鼠的肺迷走 C 纖維功能是否正 常，藉以推測其聲門功能是否正常，觀察喉返神經對投予不同劑量之 capsaicin 的反應，並同時記錄膈神經的活動。在大鼠的研究中，由右頸靜 脈給予辣椒素刺激肺迷走C 纖維，會引起典型的肺化學反射，亦會興奮喉 返神經的呼氣活動(Lu et al., 2005)。參考了本實驗室之前的研究，選擇了 0.625 μg/kg 以及 1.25 μg/kg 之辣椒素，由頸靜脈注射進入肺循環以興奮肺 迷走 C 纖維。每劑量投予間隔為 20 分鐘，避免每次投予間的加成反應，
第三部份實驗是為了測試SCA17 轉殖小鼠的肺迷走 C 纖維功能是否正 常，藉以推測其聲門功能是否正常，觀察喉返神經對投予不同劑量之 capsaicin 的反應，並同時記錄膈神經的活動。在大鼠的研究中，由右頸靜 脈給予辣椒素刺激肺迷走C 纖維，會引起典型的肺化學反射，亦會興奮喉 返神經的呼氣活動(Lu et al., 2005)。參考了本實驗室之前的研究，選擇了 0.625 μg/kg 以及 1.25 μg/kg 之辣椒素，由頸靜脈注射進入肺循環以興奮肺 迷走 C 纖維。每劑量投予間隔為 20 分鐘，避免每次投予間的加成反應，