第二章 材料與方法
C.) 老鼠肺中及血液中 Klebsiella pneumoniae 含量
三、 肺泡巨噬細胞之吞噬能力
(1) 以小鼠肺泡巨噬細胞在體外吞噬螢光小球的實驗，觀察糖尿病 小鼠的肺泡巨噬細胞對於非生物性物質 (nonbiological) 的吞噬能力，
結果分三方面來評估鼠肺泡巨噬細胞吞噬能力，第一：有吞噬螢光小 球的肺泡巨噬細胞佔全部肺泡巨噬細胞數目的百分比 (gated %)，第 二：有吞噬螢光小球的肺泡巨噬細胞，其細胞所吞噬的螢光強度 (FL-Mean)，相當於每一個有吞噬作用發生的肺泡巨噬細胞，其平均所 吞的螢光小球數量，第三：參照 Gina 等人的方法 (Gina et al, 2000)，
以經過計算的吞噬指標 (Phagocytosisi Index; PI = mean × gated %)，來 表示肺泡巨噬細胞的吞噬能力。此外，為了考量小鼠巨噬細胞本身的 背景值，每隻老鼠還作了一項肺泡巨噬細胞未加螢光小球的 no beads 組，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 6.67 ± 3.27 %，其控制組小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 4.31 ± 2.64 %，結果顯示慢性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量比正 常小鼠多， p＜ 0.05 （圖八），第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控 制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。而控 制組小鼠的 no beads 組為 0.81 ± 0.59%，慢性糖尿病小鼠 no beads 組 為 0.81 ± 0.18 %，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組，沒有統
計差異， p = 0.19，並且不論控制組和慢性糖尿病組的有 beads 組和 其 no beads 組相較，彼此間也都沒有統計差異。慢性糖尿病小鼠之肺 泡巨噬細胞其細胞所吞噬的螢光強度 (FL-Mean) 為 376.6 ± 221.1，
控制組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度 369 ± 210.1，以慢性糖尿病 小鼠和控制組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.42，所以 兩組吞噬的螢光強度並沒有差異（圖九），第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n
= 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表 示。而控制小鼠的 no beads 組螢光強度為 141.1 ± 56.8，慢性糖尿病 小鼠 no beads 組為 165.3 ± 69.5 ，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組螢光強度，沒有統計差異， p = 0.21，並且不論控制組和慢性 糖尿病組的有 beads 組和其 no beads 組相較，彼此間也都沒有統計 差異。經過運算後吞噬指標 (PI) 結果，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細 胞吞噬指標 (PI) 為 36.32 ± 32.01，控制組之肺泡巨噬細胞的吞噬指 標 (PI) 為 25.12 ± 23.53，以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨噬細 胞的吞噬指標 (PI) 比較， p = 0.15，所以兩組肺泡巨噬細胞吞噬指標 並沒有差異，而控制組小鼠的 no beads 組為 1.365 ± 0.99，慢性糖尿 病小鼠 no beads 組為 1.53 ± 0.75 ，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組，沒有統計差異， p = 0.372，並且不論控制組和慢性糖尿病 組的有 beads 組和其 no beads 組相較，彼此間都沒有統計差異，第
33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，
結果以 Mean ± SEM 表示。
(2) 以小鼠肺泡巨噬細胞在體外吞噬螢光 E. coli 的實驗，觀 察糖尿病小鼠的肺泡巨噬細胞對於生物性物質 (biological) ，尤其是細 菌的 LPS 的吞噬能力，結果也是由三方面來評估鼠肺泡巨噬細胞吞噬 能力： gated%， FL-Mean 和 PI，此外，此項實驗除了考量小鼠巨噬 細胞本身的背景值還考慮了螢光 E. coli 的干擾值，每隻老鼠還作了一 項肺泡巨噬細胞也加了螢光 E. coli， 然後將細胞和螢光 E. coli 靜置於 4℃的組別，並將 37℃組的 AMs 表現的 gated%， FL-Mean 和 PI 數 值扣除掉 4℃組的 AMs 表現的 gated%， FL-Mean 和 PI 數值，結 果顯示慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.13 ± 1.51%，其控制組之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.43 ±
1.99%，結果顯示慢性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量與正 常小鼠一樣多， p = 0.22 （圖十）。第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3；
控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。而 控制組小鼠的 4℃ E. coli 組為 3.31 ± 1.97%，慢性糖尿病小鼠 4℃ E.
coli 組為 6.86 ± 2.03%，控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組 ， 慢性糖尿病小鼠的背景值要比控制組小鼠來得高， p＜ 0.05，並且慢性 糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較， 37℃ E. coli 組
的有吞噬增加的情形，p＜ 0.05。以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨 噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.16，所以兩組吞噬的螢光強度並 沒有差異，而控制組小鼠的 37℃ E. coli 組 AMs 表現 FL-Mean 為 10.4
± 9.25，慢性糖尿病小鼠組則為 49.58 ± 23.93（圖十一）。第 33 週齡 慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組，沒有 統計差異， p = 0.24，並且不論控制組和慢性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，彼此間都沒有統計差異。經過運算後吞噬 指標 (PI) 結果，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞吞噬指標 (PI) 為 1.28 ± 0.48，控制組之肺泡巨噬細胞 37℃ E. coli 組的吞噬指標 (PI) 為 0.73 ± 0.71，以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨噬細胞 37℃ E.
coli 組的吞噬指標 (PI) 比較，p = 0.23，所以兩組肺泡巨噬細胞吞噬 指標慢性糖尿病小鼠與控制組沒有差異。第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。
而控制小鼠的 4℃ E. coli 組 (PI) 為 2.34 ± 1.21，慢性糖尿病小鼠 4
℃ E. coli 組為 5 ± 1.41，控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組，
也有統計差異， p＜ 0.05，慢性糖尿病小鼠的背景值要比控制組小鼠來 得高，並且慢性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，
37℃ E. coli 組的吞噬指標有上升的情形，p＜ 0.05。
急性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.18 ± 0.97 %，其控制組之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 8.61 ± 3.33
%，結果顯示急性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量與正常小 鼠，p = 0.078，及慢性糖尿病小鼠間都沒有差異，p = 0.49（圖十）。第 33 週齡急性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3；以配對測試比較；
慢性糖尿病小鼠 n = 3；以非配對測試比較；結果以 Mean ± SEM 表 示。而控制組小鼠的 4℃ E. coli 組為 2.79 ± 1.47 %，急性糖尿病小 鼠 4℃ E. coli 組為 5.7 ± 1.94 %，控制組和急性糖尿病小鼠的 4℃ E.
coli 組，急性糖尿病小鼠的背景值與控制組小鼠沒有差異， p = 0.19，
並且急性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，37℃ E.
coli 組的有吞噬增加的情形，p＜ 0.05。倘若以急性糖尿病小鼠和控制 組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.34，與慢性糖尿病小 鼠相比， p = 0.12，所以急性糖尿病小鼠和不論和控制組或慢性糖尿病 組相較吞噬的螢光強度相較並沒有差異，而控制組小鼠的 37℃ E. coli 組 AMs 表現 FL-Mean 為 12.67 ± 3.18，急性糖尿病小鼠組則為 5.16
± 4.72（圖十一）。第 33 週齡急性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3；以非配對測試 比較，結果以 Mean ± SEM 表示。控制組和急性糖尿病小鼠的 4℃ E.
coli 組，沒有統計差異， p = 0.2，並且不論控制組和急性糖尿病組的
37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，彼此間都沒有統計差異。經 過運算後吞噬指標 (PI) 結果，急性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞吞噬指 標 (PI) 為 1.27 ± 0.77，控制組之肺泡巨噬細胞 37℃ E. coli 組的吞 噬指標 (PI) 為 0.17 ± 0.15，以急糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨噬細 胞 37℃ E. coli 組的吞噬指標 (PI) 比較，p = 0.16， p = 所以兩組肺 泡巨噬細胞吞噬指標急性糖尿病小鼠與控制組沒有差異。但值得注意 的是與慢性糖尿病小鼠吞噬指標 (PI) 比較， p = 0.054，顯示吞噬指 標慢性糖尿病小鼠比急性糖尿病小鼠要高。第 33 週齡急性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，第 33 週齡慢性糖尿病 小鼠 n = 3，以非配對測試比較；結果以 Mean ± SEM 表示。
四、肺泡巨噬細胞對於 K. Pneumonia 的殺菌能力
將慢性和急性糖尿病小鼠感染 104 CFU K. pneumoniae 20 小時 後，計算小鼠左肺均質液和血漿中的 K. pneumoniea 菌落數 +1 之 後，再取 log 值 (菌量 = log (cfu+1))，來觀察小鼠肺泡巨噬細胞對於 K. pneumoniae 之殺菌能力，慢性糖尿病小鼠左肺均質液的 K.
pneumoniae 菌量平均值為 1.533 ± 0.28，其控制組小鼠為 0.32 ± 0.16，慢性糖尿病小鼠左肺的 K. pneumoniae 含菌量明顯比控制組小鼠 多，p＜ 0.05 （圖十二），第 33 週慢性糖尿病小鼠 n = 3，控制組小鼠
n = 3，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。急性糖尿病小 鼠左肺均質液的 K. pneumoniae 菌量平均值為 1.93 ± 0.96，其控制組 小鼠為 0.77 ±0.54，急性糖尿病小鼠左肺的 K. pneumoniae 含菌量與 控制組比較沒有差異，p = 0.11，（圖十二）。第 33 週急性糖尿病小鼠 n
= 3 ，控制組小鼠 n = 3，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表 示。慢性糖尿病小鼠和急性糖尿病小鼠左肺的 K. pneumoniae 含菌量比 較，p = 0.37，結果一樣沒有統計學上的差異（圖十二）。第 33 週慢性 糖尿病小鼠 n = 3，急性糖尿病小鼠 n = 3，以非配對測試比較，結果 以 Mean ± SEM 表示。慢性糖尿病小鼠血漿中的 K. pneumoniae 含 菌量平均值為 0.66 ± 0.66，其控制組小鼠為 0，慢性糖尿病小鼠血漿 中的 K. pneumoniae 含菌量和控制組小鼠之間沒有統計差異，p = 0.21
（圖十三）。第 33 週慢性糖尿病小鼠 n = 3，控制組小鼠 n = 3，以配 對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。急性糖尿病小鼠血漿中的 K.
pneumoniae 含菌量 平均值為 0.6 ± 0.6，其控制組小鼠為 0.16 ± 0.16，急性糖尿病小鼠血漿中的含菌量和控制組小鼠之間也沒有統計差 異，p = 0.21 （圖十三）。第 33 週急性糖尿病小鼠 n = 3，控制組小鼠 n = 3，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。慢性糖尿病小 鼠和急性糖尿病小鼠血漿中的 K. pneumoniae 含菌量比較，p = 0.47，
結果仍然沒有統計學上的差異（圖十三）。第 33 週慢性糖尿病小鼠 n =
3，急性糖尿病小鼠 n = 3，以非配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。
（圖三） 慢性糖尿病小鼠血糖值 (Fig. 3. Blood sugar value of chronic DM vs.
0 50 100 150 200 250 300 350
Con. Acute DM
Con.
Acute DM (mg/dl)
*
（圖四） 急性糖尿病小鼠血糖值 (Fig. 4. Blood sugar value of acute DM vs.
control mice) ：第 32 週齡控制組小鼠 (30 週齡時依體重給予 0.1 ml/g，6 天 之 citrate buffer)， n = 4，急性糖尿病組小鼠 (30 週齡時依體重給予 55 mg/kg，6 天之 STZ)， n = 4，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示，
*p＜0.05：DM vs. Con。
0 5 10 15 20 25 30 35
6 wk 10 wk 14 wk 18 wk 22 wk 26 wk 30 wk
CON.
DM.
* * * * * *
(g)
（圖五） 慢性糖尿病小鼠體重紀錄 (Fig. 5. Body weight of chronic DM vs.
control mice) ：控制組小鼠 (6 週齡時依體重給予 0.1 ml/g，6 天之 citrate buffer)，糖尿病組小鼠 (6 週齡時依體重給予 55 mg/kg，6 天之 STZ)，以非 配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示，*p＜0.05：DM vs. Con。
0 5 10 15 20 25 30 35
30 wk 33wk
Con.
Acute DM (g)
（圖六） 急性糖尿病小鼠體重紀錄 (Fig. 6. Body weight of acute DM vs.
control mice) ：控制組小鼠 (30 週齡時依體重給予 0.1 ml/g，6 天之 citrate buffer)， n = 4，急性糖尿病組小鼠 (30 週齡時依體重給予 55 mg/kg，6 天之 STZ)， n = 4，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。
0
Acute DM. Chronic DM.
Con.
0 2 4 6 8 10 12
Con. Chronic DM.
(%)
（圖八） 有吞噬螢光小球的肺泡巨噬細胞佔全部肺泡巨噬細胞數目的百分比
（圖八） 有吞噬螢光小球的肺泡巨噬細胞佔全部肺泡巨噬細胞數目的百分比