Giemsa stain

材料：

甲醇 (methanol)、 Giemsa 染液、二次水 (ddH₂O)、染盒、滴管 (droper)、

玻片染架、水盒、顯微鏡 (microscopy)。

步驟：

取出 cytospin 好的玻片，風乾，用滴管灑 1 c.c 甲醇 (methanol) 於玻片 上，固定細胞用，風乾，約 30 min. 後，玻片放入玻片架， Gimsa 使用前搖 勻，取 3 c.c. Giemsa 染液，加 dd H2O 到 90 c.c.，使 Giemsa 染液與 dd H₂O 的比例為 1：30，玻片架放入裝好染液染瓶中，稍微上下動一下，染勻，染 30 min，片架拿出，放入水盒中，用水沖 1 min，風乾，在光學顯微鏡下看片，

觀察細胞型態。若染不好，則重複步驟，從滴加甲醇開始。

參、小鼠肺泡巨噬細胞的吞噬能力

一、小鼠新鮮血清的製備

材料：

小鼠之新鮮全血、15 離心管 (15 ml centrifuge tube)、離心機、試管架。

步驟：

取 C57BL/6J 小鼠全血 6 ml 以上，等血液凝固，離心 2500 rpm , 20 min，取出上層的血清 (serum)，血清再離心 4000 rpm , 30 min，使血球和 fibrinogen 在血清中完全除去。

二、螢光小球 (FL-Beads) 的製備

材料：

RPMI Medium 1640、1×0.1 micro filtered with L-glutamin (Gibco © )，胎 兒牛血清 (fetal bovine serum; FBS)、15 離心管 (15 ml centrifuge tube)、試管 架、鋁箔紙、Fluorensbrite carboxyolate 0.85micro (Sphero^TM Microparticles，

yellow; Pharmingen)、離心機、冰桶、冰、新鮮小鼠血清、無菌通風櫥、試管 震盪器 (vortex mixer)。

步驟：

在無菌通風櫥中操作，避光，所有溶液皆置於冰桶上，加 10 ml RPMI-1640 於 15 ml 離心管中，離心管包上鋁箔紙，加 1 ml Fluoresbrite carboxyolate 0.85 micro，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640，

離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加少許 RPMI-1640 打散混合，

加 2 ~ 5 ml 新鮮小鼠血清，靜置使其發生調理作用 (opsonize)，4℃、30 min，

離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640，輕敲離心 管底，盡量將沈澱結塊物打散，離心 4000 rpm、 4℃、30 min，除去上清液，

加 10 ml RPMI-1640，輕敲離心管底，盡量將沈澱結塊物打散，離心 4000 rpm、

4℃、30 min，除去上清液，加 3 ml FBS，打散螢光小球，離心 4000 rpm、4

℃、10 min，除去上清液，加 5 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min，

除去上清液，加 5 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，

敲散沈澱在試管底部的螢光小球，加 6 ml RPMI，製備完之螢光小球儲存於 4

℃。

三、肺泡巨噬細胞吞噬螢光小球

材料：

製備完好之螢光小球、0.1﹪FBS/ 1×PBS、經滅菌及過濾的一倍磷酸鹽緩

衝溶 (1X PBS)、4﹪副福馬林 (4﹪paraformaldehyde= 4g paraformaldehyde/ 100 ml PBS)、70﹪酒精 (alcohol)、 RPMI-1640、 1000p、 200p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue tip)、 5 ml 試管 (流式細胞儀 Falcon © )、試管蓋、試管 架、電動吸取器 (electrical Pipette)、冰桶、冰、鋁箔紙、37℃ 培養箱

(incubator)、 離心機、流式細胞儀、計時器、試管震盪器 (vortex mixer)。

步驟：

開 37℃培養箱，使其達到 250 rpm，將 0.1﹪FBS、RPMI-1640、製備 好的螢光小球水浴回溫到 37℃，水浴槽加蓋使螢光小球避光，肺泡灌洗液的 cell count 完，依比例將 cell 分裝到 falcon 中，一組分裝 2 管； (1) 4℃ 完 全不加 beads (2) 加 37℃ beads，不加 beads 的細胞靜置於冰上即可，要加 beads 的細胞離心 1200 rpm、4℃、10 min，直接在離心機旁倒掉上清液，輕 輕打散細胞， falcon 包上鋁箔紙，關燈，加入 50 μl 的 0.1﹪FBS，加入 50 μl 的 RPMI-1640，螢光小球混和均勻，加入 50 μl 的螢光小球，立即置入 37℃， 250 rpm 培養箱中， 120 min，另一組輕輕搖晃後置於冰上蓋上蓋子 避光，2 hr 後加入 1 ml 4℃、4﹪paraformaldehyde，充分混和，靜置冰上，

蓋上蓋子避光， 10 min，離心 1200 rpm、4℃、10 min，除去上清液，避光，

將細胞輕輕打散，加 2 ml PBS， 輕輕搖晃，離心 1200 rpm、4℃、10 min，

除去上清液，避光，將細胞輕輕打散，加 1 ml PBS，輕輕搖晃，上機，使用

流式細胞儀 FL-1 即可，FITC 必須由 495 nm 藍光激發，並激發出 525 nm，

由細胞儀偵測接收。

四、肺泡巨噬細胞吞噬螢光 E. coli

材料：

胎兒牛血清 (fetal bovine serum; FBS)、經滅菌及過濾的一倍磷酸鹽緩 衝溶 (1X PBS)、70﹪酒精 (alcohl)、PHAGOTEST^® Kit： (1) E. coli-FITC (2) Quenching solution (3) Lysing solution (4) Washing solution (5) DNA

staining solution (Orpegen Pharma)、 1000p、 200p、 20p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue & yellow tip)、 5 ml 試管 (流式細胞儀 Falcon © )、試管 蓋、試管架、冰桶、冰、鋁箔紙、37℃水浴槽、離心機、流式細胞儀

(FACSCalibur^TM)、計時器、試管震盪器 (vortex mixer)。

步驟：

開 37℃ 水浴槽，使其達到 37℃，將 FBS 和 Lysing solution 放在 37

℃ 水浴槽，使其回溫到 25℃，肺泡灌洗液的 cell count 完，依比例將 cell 分 裝到 falcon 中，一組分裝 3 管： (1) 完全不加 E. coli (2) 4℃ 加 E. coli (2×10⁵ cells/管) (3) 37℃ 加 E. coli (2×10⁵ cells/管)，細胞離心 1100 rpm, 4℃, 5

min，直接在離心機旁倒掉上清液，輕輕打散細胞， falcon 包上鋁箔紙，關 燈，在冰上，加入 100 μl PBS，在冰上，加入 20 μl FBS，在冰上，加入 20 μl E. coli，低速 vortex 2-3 秒鐘，放入 37℃ 水浴槽，incubate 2 hr，水浴槽 加蓋避光，另一組置於冰上蓋上蓋子避光，2 hr 後在冰上加入 100μl

Quenching solution，低速 vortex，在冰上加入 3 ml Washing solution，vortex，

離心 1100 rpm、5 min、4℃，除去上清液，避光，將細胞輕輕打散，在冰上 加入 1.5 ml Washing solution，低速 vortex，離心 1100rpm、5 min、4℃，除去 上清液，避光，將細胞輕輕打散，在室溫下，加入已回溫至室溫的 2 ml Lysing solution，低速 vortex，室溫下，靜置 20 min，避光，離心 1100rpm、5 min、

4℃，除去上清液， 避光，將細胞輕輕打散，在冰上加入 3 ml Washing solution，低速 vortex，離心 1100rpm、5 min、4℃，除去上清液，避光，將細 胞輕輕打散，在冰上加入 200 μl DNA staining solution，低速 vortex，靜置 冰上 10 min，蓋上蓋子避光，加 0.5 ml PBS，低速 vortex，60 min 內上機，

FITC 必須由 488 nm 藍光激發。

肆、小鼠肺泡巨噬細胞清除 Klebsiella pneumoniae 的能力

一、定量 Klebsiella pneumoniae 菌液濃度