糖尿病對老鼠肺泡巨噬細胞吞噬能力及防禦肺炎克雷伯氏菌能力之改變; Diabetes alters the Phagocytic Capacity and the Lung Defense against Klebsiella pneumoniae Infection by Alveolar Macrophages
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(2) 中文摘要. 糖尿病為慢性的新陳代謝疾病，病人除了有慢性血糖升高的情況，並且 時常伴隨著長期併發症，也比較容易受到感染。糖尿病也被認為是下呼吸道 感染的一種獨立危險因子，之前研究顯示，同樣罹患敗血症時，糖尿病人反 而比非糖尿病人較不容易進入更嚴重的病程，例如成人呼吸窘迫症。 在特殊感染方面，肺炎克雷伯氏菌特別好發於台灣的糖尿病人，其引起 的原發性肺炎，病程進展快速，多數伴隨敗血症症狀，導致了高死亡率。肺 臟中常駐的肺泡巨噬細胞，具有吞噬及殺菌能力，並且調節下呼吸道免疫系 統的功能，是肺臟中抵抗外來微生物的第一道防線。為了研究糖尿病對於肺 泡巨噬細胞功能的影響，本篇實驗先以 STZ 分別誘發 6 週齡及 30 週齡小鼠糖 尿病，並持續飼養到第 33 週齡，使其分別成為慢性及急性糖尿病小鼠後，利 用支氣管灌流術分離出小鼠的肺泡巨噬細胞，將肺泡巨噬細胞與標定螢光的 小球或大腸桿菌在體外培養 2 小時後，以流式細胞儀分析肺泡巨噬細胞之吞 噬能力。在糖尿病容易遭受肺炎克雷伯氏菌感染之研究方面，本篇實驗從小 鼠支氣管注射克雷伯氏菌，造成糖尿病小鼠下呼吸道感染 20 小時後，取出小 鼠的左肺和血漿分別塗抹於培養基上培養 18 小時，之後計算左肺和血漿中的 克雷伯氏菌含量。結果顯示，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞吞噬能力與正 常小鼠相當，而慢性糖尿病小鼠在遭受克雷伯氏菌感染後，其左肺中的克雷. 2.
(3) 伯氏菌含量明顯的較正常小鼠多出 21 倍，但其血漿中的克雷伯氏菌含量與 正常小鼠並無差異。至於急性糖尿病小鼠不論在左肺和血漿中克雷伯氏菌含 量，均與正常小鼠和慢性糖尿病小鼠沒有差異。本研究顯示台灣糖尿病人對 於克雷伯氏菌引起肺炎特殊的易感受性，可能是與糖尿病人肺泡巨噬細胞對 於克雷伯氏菌殺菌能力變差有關。經由本篇實驗，可以引導出研究糖尿病下 呼吸道免疫機轉的新方向。. 3.
(4) 目錄 誌 謝 --------------------------------------------------------------------------------------1. 中文摘要 -----------------------------------------------------------------------------------2. 目 錄 --------------------------------------------------------------------------------------3. 表目錄 --------------------------------------------------------------------------------------6. 圖目錄 --------------------------------------------------------------------------------------7. 符號與縮寫 --------------------------------------------------------------------------------9. 第一章 緒論 -----------------------------------------------------------------------------11. 壹 糖尿病之概論 -----------------------------------------------------------------11. 第一節 糖尿病的定義--------------------------------------------------------11. 第二節 糖尿病的分類--------------------------------------------------------11. 第三節 糖尿病的流行病學--------------------------------------------------13. 第四節 糖尿病之實驗動物模型--------------------------------------------15. 貳 糖尿病與感染 -----------------------------------------------------------------15. 第一節 糖尿病對感染之感受性 -----------------------------------------15. 第二節 糖尿病與免疫系統 -----------------------------------------------16. 參 肺泡巨噬細胞 -----------------------------------------------------------------19. 第一節 肺泡巨噬細胞簡介 -----------------------------------------------19. 第二節 來源及動力學 -----------------------------------------------------20. 第三節 外型特徵 -----------------------------------------------------------21. 第四節 代謝特性 -----------------------------------------------------------21. 第五節 抗微生物之機轉 --------------------------------------------------22. 肆 肺炎克雷伯氏菌 --------------------------------------------------------------24. 第一節 肺炎克雷伯氏菌簡介 --------------------------------------------24. 第二節 肺炎克雷伯氏菌機轉 --------------------------------------------25. 第三節 肺炎克雷伯氏菌之流行病學 -----------------------------------26. 伍 研究目的 -----------------------------------------------------------------------27. 4.
(5) 第一節 慢性糖尿病小鼠肺泡巨噬細胞吞噬能力 -------------------27. 第二節 慢性糖尿病小鼠肺泡巨噬細胞吞噬對於肺炎克雷伯氏菌之 殺菌能力 ----------------------------------------------------------27. 第二章 材料與方法 -------------------------------------------------------------------- 31. 壹. 糖尿病動物模型之誘發 ----------------------------------------------------31. 第一節 檸檬酸緩衝溶液的製備 ----------------------------------------31. 第二節 實驗動物之品管 -------------------------------------------------32. 第三節 糖尿病的誘發 ----------------------------------------------------33. 第四節 小鼠血糖測量 ----------------------------------------------------33.. 貳 小鼠肺泡巨噬細胞及血液之取得 ----------------------------------------34. 第一節 小鼠支氣管灌流數及血液採集 -------------------------------34. 第二節 細胞計數 ----------------------------------------------------------35. 第三節 細胞型態 ----------------------------------------------------------36. 參 小鼠肺泡巨噬細胞之吞噬能力 -------------------------------------------38. 第一節 小鼠新鮮血清的製備 -------------------------------------------38. 第二節 螢光小球的製備 -------------------------------------------------38. 第三節 肺泡巨噬細胞吞噬螢光小球 ----------------------------------39. 第四節 肺泡巨噬細胞吞噬螢光 E. coli. -------------------------------41. 肆 小鼠肺泡巨噬細胞清除 Klebsiella pneumoniae 的能力 ------------ 42. 第一節 定量 Klebsiella pneumoniae 菌液濃度 ----------------------42. 第二節 小鼠肺部感染 Klebsiella pneumoniae ----------------------- 45. 第三節 感染後小鼠肺中及血中 Klebsiella pneumoniae 含量-----46. 伍 統計方法 ---------------------------------------------------------------------- 49. 第三章 結果 ------------------------------------------------------------------------------51. 壹. 糖尿病小鼠之生理 -----------------------------------------------------------51. 第一節 糖尿病小鼠之血糖值 --------------------------------------------51. 第二節 糖尿病小鼠之體重 -----------------------------------------------53.. 貳 糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞 -----------------------------------------------54. 第一節 肺泡巨噬細胞之型態和比例 -----------------------------------54. 5.
(6) 第二節 肺泡巨噬細胞之數目 --------------------------------------------54. 第三節 肺泡巨噬細胞之吞噬能力 --------------------------------------55. 第四節 肺泡巨噬細胞對於 Klebsiella pneumoniae 的殺菌能力-- 60. 第四章 討論 ------------------------------------------------------------------------------75. 第五章 結論 ------------------------------------------------------------------------------85. 第六章 參考文獻 ------------------------------------------------------------------------86. 英文摘要 ---------------------------------------------------------------------------------- 96. 作者簡歷 -----------------------------------------------------------------------------------98.. 表目錄 表一： 慢性糖尿病小鼠之體重紀錄 -------------------------------------------------66. ( The body weight of the chronic DM mice). 6.
(7) 圖目錄. 圖一： 肺泡巨噬細胞在光學和電子顯微鏡下的外觀呈現 ----------------------29. (The morphology of alveolar macrophage under the microscopy) 圖二： 肺泡巨噬細胞消化外來微生物之代謝途徑 -------------------------------30. (Metabolic concomitants of particle ingestion by macrophages) 圖三： 慢性糖尿病小鼠血糖值 -------------------------------------------------------63. (Blood sugar value of chronic DM vs. control mice) 圖四： 急性糖尿病小鼠血糖值 -------------------------------------------------------64. (Blood sugar value of acute DM vs. control mice) 圖五： 慢性糖尿病小鼠體重紀錄 ---------------------------------------------------65. (Body weight of chronic DM vs. control mice) 圖六： 急性糖尿病小鼠體重紀錄 ---------------------------------------------------67. (Body weight of acute DM vs. control mice) 圖七： 慢性和急性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞數目 ---------------------------68. (Number of AMs from acute and chronic DM vs. control mice) 圖八： 慢性和急性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞數目 ---------------------------69. (Number of AMs from acute and chronic DM vs. control mice) 圖九： 慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度 ------------------70. (Beads fluorescent strength in AMs from chronic DM vs. control mice) 圖十： 有吞噬螢光小球的肺泡巨噬細胞佔全部肺泡巨噬細胞數目的百分比 ------------------------------------------------------------------------------------71. 7.
(8) (% of AMs from chronic and acute DM vs. control mice phagocytizing beads) 圖十一： 糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度 ---------------------72. (Beads fluorescent strength in AMs from chronic and acute DM vs. control mice) 圖十二： 糖尿病小鼠左肺均質液的 K. Pneumonia 菌落數 -------------------73. (Bactericidal ability of left lung to K. Pneumonia from chronic and acute DM vs. control mice.) 圖十三： 糖尿病小鼠血漿中的 K. Pneumonia 菌落數 --------------------------74. (Bactericidal ability of plasma to K. Pneumonia from chronic and acute DM vs. control mice). 8.
(9) 符號與縮寫. 6-PG：6-phosphogluconate 葡萄糖 6 磷酸 AMs：Alveolar Macrophage 肺泡巨噬細胞 BAL：Bronchoalveolar Lavage Fluid 支氣管灌流術 DM：Diabetes Mellitus 糖尿病 FBS：Fetal Bovine Serum. 胎兒牛血清. G-6-P：Glucose-6-Phosphate 葡萄糖-6-磷酸 G-6-PD：Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase 葡萄糖-6-磷酸脫氫? GSH：Reduced Glutathione. 還原型麩氨基硫. GSSG：Oxidized Glutathione 氧化型麩氨基硫 HLA：Human Leukocyte Antigen. 人類白血球抗源. HMPS：Hexose Monophosphate Shunt 己糖-磷酸分路. IDDM：Insulin-Dependent Diabetes Mellitus 胰島素依賴型糖尿病 IL-2：Interleukin-2. 間白素 2. K.p.：Klebsiella pneumoniae 肺炎克雷伯氏菌 LPS：Lipopolysaccharide 脂多醣體 NADPH：Reduced Nicotine Adenine Dinucleotide Phosphate 菸醯胺腺嘌呤二核? 酸磷酸之還原態. 9.
(10) NADP+：Oxidized Nicotine Adenine Dinucleotide Phosphate 菸鹼醯胺腺嘌呤二核? 酸磷酸之氧化態 NIDDM：Noninsulin-Dependent Diabetes Mellitus. 非胰島素依賴型糖尿病. PBS：Phosphate Buffer Saline 磷酸鹽緩衝溶液 PMNs：Plymorphonuclear Leukocytes 多型核白血球 PMs：Peritoneal Macrophages 腹腔巨噬細胞 STZ：Streptozotocin 鏈氮黴素. 10.
(11) 第一章. 緒論. 壹、糖尿病之概論 糖尿病(diabetes mellitus; DM)是一種最常見的內分泌疾病，本病的特點是 代謝異常，導致病人有慢性血糖升高的情況；並且時常會伴隨著長期併發症 如眼、腎、神經和血管病變等 (Wilson and Foster,1992)。. 一、 糖尿病的定義. 糖尿病為慢性的新陳代謝疾病，胰臟β細胞受到自體免疫或病毒的 破壞導致胰島素分泌不足，或是胰島素的作用有缺陷，或胰島素作用細 胞上的接受器有所缺損都有可能是致病的原因，如果胰臟蘭氏小島的β 細胞，無法分泌足量的胰島素（ Insulin），或是體內的胰島素無法發揮功 能，導致生理的代謝功能無法充分的發揮降血糖的作用時，人體所攝取 的食物，經過消化、吸收、轉化成葡萄糖之後，血中葡萄糖含量就會累 積超出了正常範圍，病人臨床症狀為血中葡萄糖濃度過高，並且有多吃、 多喝、多尿﹙三多症狀﹚、口乾、疲倦及體重減輕等症狀。. 二、糖尿病的分類. （1）第一型糖尿病（Type 1） ：為胰島素依賴型糖尿病（insulin-dependent 11.
(12) diabetes mellitus; IDDM） ，多在 40 歲前發作；特徵是逐漸失去胰臟蘭氏小島 的β細胞，最後導致循環中無胰島素存在，病因被認為是與人類白血球抗原 （human leukocyte antigen HLA）DQ、DR 最有關聯（Thorsby et al., 1993）， 此病為和抗原表現有關的遺傳性自體免疫疾病，病人有抗胰島組織抗體，引 起 T 淋巴球浸潤，最後摧毀胰島。另外曾注意到環境因素的特殊病毒感染 B 細胞有可能是造成糖尿病的原因，因為曾有不少季節性變化的相關性在此病 毒感染發生與糖尿病發病之間，但病毒理論仍未被證實。病人大多需要依賴 注射胰島素控制血糖。. （2）第二型糖尿病（Type 2）：為非胰島素依賴型糖尿病 （noninsulin-dependent diabetes mellitus; NIDDM），多發生在 40 歲以後， 此糖尿病患者多為肥胖者，血漿胰島素多為正常或偏高，其脂肪組織細胞 之胰島素受器細胞數目常減少，胰島素對葡萄糖耐量升高，病因為胰島素 抗性及相對胰島素不足，大多由於胰島素接受器的下調節造成胰島素接受 器濃度降低，或者在細胞表面接受器之後，細胞內的葡萄糖代謝有缺陷； 以上種種現象造成病患血中就算有足量的胰島素，然而胰島素仍然無法對 於細胞發揮功能。病人大多不須依賴注射胰島素，而是靠控制飲食或服用 降血糖藥物來控制病情。. 無論是哪一型的糖尿病，到最後都會因為血糖的不正常而引起一些併發. 12.
(13) 症，如視網膜病變、腎病變、血管病變、神經病變、感染、酮酸中毒等。. 三、糖尿病的流行病學. 隨著生活水準的提高，飲食及生活形態的改變，糖尿病已成為普遍分佈 全世界的慢性疾病，並且有逐漸增多的趨勢，發病率大約為 1~2% (Wilson and Foster,1992)，世界上約有 2 億人口罹患糖尿病，在已開發國家中均排名十大 主要死因之內(Fujimoto, 1966)；在台灣地區糖尿病則已連續多年在十大死亡 原因中排名高居在第五位(行政院衛生署, 2000)，患者總數約在 30~40 萬人左 右，而且人數仍然日益增加中，顯示了對於糖尿病的控制及延緩其併發症的 發展方面仍然需要改善。病患人口的分佈及常見的併發症發生率如下： 第 1 型糖尿病 (胰島素依賴型；IDDM) ：在台灣地區僅佔所有糖尿病 患者人口的 3.5﹪ (戴東原, 1996)，總數在 14,000 人。第 2 型糖尿病 (非胰 島素依賴型；NIDDM)：在台灣地區佔所有糖尿病患者人口的 96.5﹪ (戴東 原, 1996)，總數在 40 萬人，但未被診斷出的糖尿病人約佔 2/3 左右，因此 推斷台灣地區糖尿病人總數應該在 100 萬人以上 (張家禎, 1993)。 血管疾病：高血糖、高血壓、及血脂異常是造成血管病變的主要因 素，常見的有冠狀動脈心臟病、腦中風或週邊血管阻塞。在血管疾病致死 因方面，IDDM 主要為微血管病變，NIDDM 則主要為心臟血管與腦血管疾. 13.
(14) 病方面 (Marks, 1977)。腎病變：IDDM 發病 20 年後，腎病變的發生率為 30~50﹪，25 年到達高原期以後，腎病變發生率並不太增加 (Andersen, 1983)，而腎病變佔了 IDDM 患者死亡原因的 55﹪(Marks, 1977)。而 NIDDM 發病 20 年後，腎病變的發生率為 25~34﹪，25 年之後，罹患率會一直上升， 患者 35 年累積發病率可達 75﹪(Ballard et al., 1988) 而腎病變只佔了 NIDDM 患者死亡原因的 7﹪(King, 1971)，在台灣地區糖尿病為血液透析原 因的第二位 (曾芳郁, 1996)，在美國為第一位 (Mauer et al., 1985)。視網膜 病變：在美國，糖尿病是造成成人失明的主要原因 (Wilson, et al. 1992) ， 而糖尿病患者眼睛失明的機會又比一般人高出 25 倍，在發病 20 年之後， IDDM 約有 90﹪，NIDDM 約有 25.8﹪會發生視網膜病變 (郭清輝, 1998)。 神經病變：在台灣地區，糖尿病發病初期約有 7.5% 會有神經病變，發病至 25 年可達 50% (郭清輝, 1998)。在美國的調查顯示糖尿病患者神經病變的 罹患率高達 60% (Dyok, 1993)。 感染：糖尿病人常見有陰道、泌尿道的感染，皮膚黴菌感染及足部感 染等 (陳國群, 1997)，其中以足部感染的問題最為嚴重，再加上病人有血管 阻塞、神經病變、傷口不易癒合等問題，使足部容易發生潰瘍、壞死、甚至 需要截肢。根據臺大醫院 1982~1991 年間的調查，在台大接受下肢截肢的手 術的病人，糖尿病患就佔了 37.2% ，此外，在台灣，因糖尿病足部感染的 死亡率是同年齡人口死亡率的 5.95% (郭清輝, 1998)。. 14.
(15) 四、糖尿病之實驗動物模型. 糖尿病的動物模型分為 IDDM 和 NIDDM 兩種，NIDDM 型大多是 經由基因改造的方式，使老鼠體內有胰島素抗性及血糖上升的情形，常見的 有 db/db 及 ob/ob 小鼠等，而一般實驗室動物以藥物誘導產生糖尿病的方 式，則是屬於 IDDM 型，常用的藥物為 streptozotocin (STZ) 及 alloxan，兩 者的作用皆為破壞胰臟β細胞，並且造成不可逆的傷害，此結果會讓實驗動 物產生類似於人類 IDDM 的症狀，如高血糖，低胰島素，體重減輕等，這 種誘發式的糖尿病動物模型的特點在於，雖然老鼠會產生與 IDDM 相同的 生理反應，但是卻不會有人類 IDDM 的自體免疫情形發生 (Mords et al, 1985)。. 貳、糖尿病與感染. 一、糖尿病對感染之感受性. 高度感染之感受性：普遍的認為，與健康的人相較，糖尿病患者比較容 易受到感染 ( Robbins et al., 1944; Seymour et al., 1963) ，而且糖尿病也被認 為是一種獨立的危險因子，導致容易使人得到下呼吸道感染 ( Mackowaik et. 15.
(16) al., 1979)，對於糖尿病而言，有許多的因素會提昇感染及併發症的危險性， 例如：糖尿病的持久度，嚴重的非感染性併發症，血糖濃度的高低等，將在 下文中更詳細的介紹。. 二、糖尿病與免疫系統. (1) 多型核白血球 (Polymorphonuclear Leukocytes; PMNs) 功能： Ι. 移動及趨化能力： 糖尿病人的嗜中性白血球 (PMNs) 趨化能力 較正常人差——曾有研究指出，在傷口發炎反應開始的 2~4 小時內，糖尿病 人的嗜中性白血球 (PMNs) 趨化移動到發炎部位的數量較正常人少，而在體 外實驗方面，同樣地，糖尿病人的 PMNs 對於趨化物質所產生的趨化反應 能力，也比正常人低 (Mowat et al., 1971)，此外，若將正常人的 PMNs 培養 在高血糖濃度中，並不會影響正常人 PMNs 的趨化能力；反之，若將糖尿 病人的 PMNs 培養在含有胰島素的環境中，卻能改善糖尿病人 PMNs 的趨 化能力 (Brayton et al., 1970)。 Π. 吞噬能力： 糖尿病人 PMNs 的吞噬能力較正常人差——實驗報告 中，未控制血糖的糖尿病人，其有吞噬肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae) 的 PMNs 數量比正常人少，在控制血糖之後，PMNs 的吞噬能力有改善的 情形，但仍無法達到正常的吞噬能力 (Bagdade et al., 1974)，如果將正常人 的 PMNs 放在糖尿病人的血清中培養，正常人 PMNs 的吞噬能力會下 16.
(17) 降；相反地，若將糖尿病人的 PMNs 放在正常人的血清中培養，其 PMNs 的 吞噬能力就會提昇 (Bybee et al., 1964)，在 PMNs 吞噬菌量的多寡方面，不 論是金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，或是念珠菌 (Candida guilliermondii) 被吞噬的數量，糖尿病人都是比正常人少很多的，而 PMNs 吞噬菌量的多寡和培養環境的血清種類卻沒有發現有相關性 (Nolan et al., 1978; Davidson et al., 1984)。 Ⅲ. 附著能力： 血糖控制不良的糖尿病人，他們的 PMNs 附著到玻璃 管柱的能力明顯的受到傷害，然而若將病人的血糖控制住 1-2 個月之後， PMNs 的附著能力就有明顯的改善 (Peterson et al, 1977)，若觀察病人 PMNs 附著到尼龍材質管柱上的能力，也能觀察到同樣的情形，而且病人 在血糖控制後 PMNs 的附著能力能夠增加 53﹪~74﹪ (Bagdade et al., 1978, 1980)，後來更有人從生理學的方向探討發現，糖尿病人 PMNs 附著到牛的 動脈的能力比正常人下降了 60﹪，但是 PMNs 附著能力的衰弱程度卻未發 現與病人血中的 HbA1c 濃度有相關性 (Andersen et al., 1980)。 Ⅳ. 殺菌能力： 糖尿病人的 PMNs 殺菌能力較差，未控制血糖的糖尿病人， 其 PMNs 吞 噬的金黃葡萄球菌數量遠比正常人及血糖受控制的病人少得多 (Repine et al., 1980)，其後有人用綠膿桿菌測試，糖尿病人就算血糖被控制之後，他們 PMNs 殺菌能力仍然沒有改善 ( Naghibi et al., 1987)，若 PMNs 受到外來顆. 17.
(18) 粒性異物刺激後，以冷光檢測超氧離子 (superoxide anion) 或過氧化產物 (superoxide production) 的含量，糖尿病人的過氧化產物比正常人少 (Winocour et al.,1988)， 而當 PMNs 遭遇到酵散 (zymosan) 或是金黃葡萄 球菌的刺激後，糖尿病人的前列腺素 E (prostaglandin E) 和血栓素 B2 (thromboxane B2) 的產量以及對於合成或釋放白三烯素 B4 (leukotriene B4) 的能力都比正常人微弱 (Qvist et al., 1983) (Jubiz et al., 1984)。. (2) 單核球 (Monocyte) 功能： 糖尿病人循環血中的單核球數目比較少 (Geisler et al., 1982) ，而這些 單核球吞噬白色念珠菌 (Candida albicand) 或表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 的能力皆有受損，但是當吞噬乳化小球 (latex particles) 或綿羊紅血球時，糖尿病人的單核球的吞噬能力與正常人是沒有 差異的 (Glass et al., 1987; Katz et al., 1983)，此外，糖尿病人的單核球在對 付李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 時，不止吞噬能力降低，趨化能力也 出現受損情形 (Hill et al., 1983)，但是也有實驗發現，糖尿病人的單核球在 吞噬酵散 (zymosan) 時，其吞噬活動的代謝產物，如過氧化物、單磷酸己 糖含量比一般正常人高，證明糖尿病人單核球吞噬活動時有較高的代謝能力 (Kitahara et al., 1980)。. (3) 細胞調節免疫 (cell-mediate immunity)： 18.
(19) 大量的報告都指出糖尿病體外實驗的細胞調節免疫功能受到損害；例 如當血糖控制不良的糖尿病人的淋巴球，對於植物血球凝集素 (phytohemagglutinin； PHA) 刺激所產生的轉型反應較正常人微弱 (MacCuish et al., 1974)，儘管血糖有良好控制的糖尿病人的淋巴球遭遇葡萄 球菌抗原時，轉型反應依然也較正常人低下 (Casey et al., 1987)，在酮酸中 毒的糖尿病童身上，他們的 T 淋巴球有絲分裂活動減低，一但病童代謝回 到正常，他們的 T 淋巴球有絲分裂即回復正常 (Kolterman et al., 1980)，而 IDDM 糖尿病人 T 細胞所分泌的間白素 2 (interleukin-2； IL-2) 產量也較少， IL-2 的主要功能是調控 T 細胞的增殖能力和活性 (Kaye et al., 1986)，同樣 地，IDDM 糖尿病人的自然殺手細胞 (natural kille cells； NK cells) 對於干 擾素的反應能力也比正常人減弱 (Negishi et al., 1988)。. 參、肺泡巨噬細胞. 一、 肺泡巨噬細胞簡介. 肺泡巨噬細胞 (Alveolar macrophage; AMs) 是一種在肺臟中常駐的單核 吞噬細胞，它主要的功能是作為肺臟抵抗外來病源的第一道防線，尤其是在 於對抗吸入性顆粒方面 (Cohen et al., 1975; Green et al., 1964)，自從 1961 年， Myrvik 等人從兔子的肺臟灌洗中獲得了 AMs 後， AMs 的研究方法即被普 19.
(20) 遍的應用 (Myrvik et al., 1961)。隨後這種肺泡灌洗技術就被獲准應用在研究 人類的 AMs 上 (Finley et al., 1967)，人們便可以藉由這種研究方法了解動物 或是人類的肺臟生理或病理。因為 AMs 居留在一種富含空氣的組織表面， 所以它會直接暴露在吸入性的微生物或毒性中，包括了煙塵或特殊的空氣污 染等，而在肺泡這樣的一個需氧環境下造就了 AMs 發展出特殊的代謝適應 (Simon et al., 1977)。. 二、 來源及動力學. 存在身體內各器官的巨噬細胞都是由骨髓中的先驅細胞衍生而來的 (van Furth et al., 1970; Volkman et al., 1965)， 有人更進一步證明，骨髓中的 先驅細胞衍生成循環血中的單核球，這些單核球再發育成代謝特徵和功能皆 不相同的 AMs (Bowden et al., 1969, 1972)，其中有一項最直接的證據來自 於，曾有人將女性的骨髓移植到男性病人身上，最後男性的 AMs 皆沒有帶 有 Y 染色體，證明了男性的 AMs 都是從移植後的女性骨髓而來，同樣的， 的若將男性的骨髓移植到女性病人身上，最後女性的 AMs 皆帶有 Y 染色 體，而且宿主的 AMs 最多在 100 天內都會被供給者的骨髓衍生細胞取代 (Thomas et al., 1976)。無疑的， AMs 有自我繁殖的能力 (Lin et al., 1975)， 在人類的 AMs 方面，從重氫標定的胸腺嘧啶來追蹤 AMs 複製的結果，發 現 AMs 雖然有複製繁殖的能力，但其比例只佔了約 0.35~1.25 ﹪，證明了 20.
(21) AMs 主要的來源並非由本身複製繁殖而來 (Golde et al., 1974)。. 三、 外型特徵. AMs 在光學和電子顯微鏡下的外觀呈現（圖一），肺泡巨噬細胞的大小 可有 15~50 μm，若利用 Giemsa 染色法，可以看到灰色的細胞質內包含許 多藍黑色的顆粒及細胞質空泡，細胞核與細胞質的比例通常為 1:3，有的時 候細胞質可看見很多的空泡，以及經由過碘酸-Schiff 染色法可觀察到大量的 非特異性酯? ， AMs 的胞器包含了完整的高基氏體和一些粒腺體 (Mann et al., 1971; Cohen et al., 1971) ，而內質網分布並不廣泛，大部分是粗糙型 內質網 (Harris et al., 1970) ，其他還包含了核糖體和肝糖顆粒存在 (Mann et al., 1971; Cohen et al., 1971)。 AMs 有一個很重要的特點就是擁有大量由細 胞膜所封包住的包含體，在人類的 AMs 包含體中發現有酸性磷酸? 的聚集 (Pratt et al., 1971)，在兔子的 AMs 發生吞噬作用時，這些包含體都會轉變 成吞噬性小泡，所以，很顯然的，這些包含體就是初級的溶小體 (Stossel et al., 1972; Cohn et al., 1963) ，從掃描式電子顯微鏡下可看到 AMs 膜表面皺 襞特徵（圖一），當 AMs 附著到玻璃時，它的細胞膜會延展並生出板狀和 絲狀的偽足 (Quan et al., 1977)。. 四、代謝特性 21.
(22) AMs 與其他的吞噬細胞比起來，有較高的呼吸速率，然而，在它進行吞 噬作用時，僅有少量的氧消耗增加情形 (Oren et al., 1963)，曾經有人利用抑 制糖解作用或氧化代謝的抑制劑，來觀察這些吞噬細胞在厭氧的環境下，吞 噬外來顆粒的能力有無變化，發現這樣的厭氧環境對一般的 PMNs 及腹腔 巨噬細胞 (peritoneal macrophages; PMs) 的吞噬能力毫無影響 (Sbarra et al., 1959)，卻會造成 AMs 的吞噬能力大大減低 (Cohen et al., 1971; Oren et al., 1963; Mason et al., 1973) ，因此，相對於其它吞噬細胞， AMs 在發生吞噬 作用時需要氧化及糖解的代謝。在酵素方面，相對於 PMs ， AMs 含有較 高量的細胞色素氧化? ，而乳酸激? 和果糖磷酸激? 的含量卻很少，符合了 需氧性的能量代謝途徑 (Simon et al., 1977)。. 五、抗微生物之機轉. (1) 捕捉微生物： AMs 的細胞膜上有可與 IgG 抗體的 Fc 部位結合的接受器 (Reynolds et al., 1975)，以及補體接受器 (Shurin et al., 1978)，這些接受器對 於 AMs 在接觸和消化外來顆粒的功能上扮演很重要的角色 (Mantovani et al., 1972)，若觀察兔子感染卡介菌 (Bacillus Calmette-Cuerin)之後的免疫反 應，其 AMs 細胞膜上的補體和 IgG 接受器的數量及親和力的都會上升 22.
(23) (Montarroso et al.,1978)，這項改變反映出了 AMs 的『活化』可能與對於調 理過的微生物的吞噬能力增強有關。當 AMs 接觸到外來顆粒進而被活化 後，肌動蛋白 (actin) 牽動了微絲 (micro - filaments)，再加上其他一些輔因 子的作用，導致了細胞質的收縮，這種收縮提供了形成偽足以及吸入外來顆 粒的力量 (Stossel et al., 1976)。. (2) 殺菌的機制： AMs 在一般休息狀態時就會產生過氧化氫 (H2O2)，在吞噬進行時則 會產生更多的過氧化氫 (Gee et al., 1970; Klebanoff et al., 1973)， 產生 H2O2 的過程可能是由 NADPH 氧化? (NADPH oxidase) 的反應而來，而 NADPH 氧化? 則可以刺激經由戊醣磷酸代謝 (hexose monophosphate shunt) 途徑的呼吸和活化反應，在經由 NADPH 氧化? 到 H2O2 產生的過程中， 超氧離子 (superoxide anion； O2-) 可以直接的殺菌， H2O2 最後可被觸? (catalase) 轉換成水和氧 (圖二) (Rossi et al., 1973)。. (3) AMs 的分泌： AMs 可以分泌一些細胞激素、群落刺激因子 (colony - stimulating activity)、這些由 AMs 分泌出來的物質可以誘導顆粒性白血球 (granulocyte) 和單核球幹細胞 (monocyte stem cell) 之複製 (Golde et al., 1972)，這些細胞 激素還可誘導刺激骨髓中的顆粒性白血球和單核球遷移到肺臟中 (Glode et 23.
(24) al., 1974)。. (4) 抗原呈獻 (Antigen presenting)： 在免疫反應中，輔助型 T 細胞 (helper T cell) 的活化需要蛋白質抗 原，而負責呈現出抗原給輔助型 T 細胞的就是單核球系統 (Unanue et al., 1984)，當抗原經由巨噬細胞處理過後，巨噬細胞膜的表面就會一起呈現外 來抗原和自我抗原 (self- antigen) 給 T 細胞，供 T 細胞辨認並啟動下一步 免疫防禦 。. 肆、肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae; K.p.). 一、. 肺炎克雷伯氏菌簡介. 肺炎克雷伯氏菌 (K. pneumoniae) 屬於革蘭氏陰性 (Gram negative) 腸 內桿菌科細菌 (Enterobacteriacese)，有莢膜 (capsule) 為其主要毒力因子 (virulence factor)，大多利用檸檬酸鹽 (citrate) 和葡萄糖 (glucose) 為主要碳 源 ( carbon sources) (Podschun and Ullmann, 1998)；常常造成下呼吸道及尿道 感染，可導致肺部組織出血性壞死，也是常見的院內感染菌，雖然在所有肺 炎病例中，是 K. pneumoniae 造成的只有佔了 3﹪，但它卻可以導致非常高 的死亡率，假如 K. pneumoniae 肺炎病人沒有接受治療，其死亡率甚至可以. 24.
(25) 高達 90﹪ (Baron, 1991)。. 二、 肺炎克雷伯氏菌致病機轉. (1) 莢膜： 莢膜是 K. pneumoniae 必須的致病因子 (Cryz et al., 1992)，因為莢膜不 止可以保護 K. pneumoniae 免於被 PMNs 吞噬 (Podschun et al., 1992)，還 可以防止被人類血清之殺菌因子 (bactericidal serum factors) 殺死 (Williams et al., 1983)，而莢膜多糖體 (capsular polysaccharide; CPS) 中的甘露糖 (mannose) 含糖量的多寡，也曾被指出與致病力有關，例如較低致病力的莢 膜血清型，具有重複的 mannose-α-2/3-mannose 的結構，容易被巨噬細胞 表面的外源凝集素 (surface lectin) 辨識，進而被吞噬清除 (Athmna et al., 1991)。. (2) 血清抗性與脂多醣體 (serum resistance and lipopolysaccharide; LPS)： 細菌避開血清殺菌效應的作用稱為細菌血清抗性 (serum resistance)， K. pneumoniae 避開血清殺菌效應的方法可能有兩種：(1) CPS 掩蔽下層的 LPS，所形成的表面結構抑制了宿主細胞補體系統的活化；(2) LPS 中的 O 抗原側鏈可伸出莢膜層，暴露於外在環境中，此長鏈的 O-polysaccharide side 25.
(26) chain 會阻止補體 C3b 接近菌體表面，使宿主無法形成溶菌膜攻擊複合體 (lytic membrane attack complex； C5b-C9)，因而細菌細胞膜就不會被破壞， 細菌也不會死亡了 (Podschun and Ullmann, 1998)。. (3) 宿主因素： K. pneumoniae 的感染特別好發於小孩、老年或者免疫系統有缺陷的 人，而且正服用抗代謝藥物的治療或本身有糖尿病或酗酒者，更是高危險群 (Highsmith and Jarvis, 1985)。. 三、 肺炎克雷伯氏菌之流行病學. K. pneumoniae 是一種伺機性感染的細菌，對於住院已久，免疫力較差 的病人 (Carpenter, 1990)，或是有糖尿病或慢性肺阻塞的病人，較具攻擊 性，而且此菌所引起的肺炎，在給予抗生素治療後，仍有高達 50﹪的死亡 率 (Lorian and Topf, 1972; Graybill et al., 1973)，在國外，化膿性肝膿瘍大部 分是由多種微生物引起的 (McDonald et al., 1984)，然而在台灣則是由單一 微生物 (monomicrobial) K. pneumoniae 所造成，而且多發生在糖尿病患者 身上；在國外， K. pneumoniae 肝膿瘍佔所有化膿性肝膿瘍的 27﹪ (Goldman et al., 1978; Greenstein et al., 1984)，在台灣 K. pneumoniae 肝膿瘍 卻高佔了 80﹪ (Cheng et al., 1997)；也因為如此大的差異， K. pneumoniae 26.
(27) 遂引起了國內感染科醫師和專家學者的高度重視，. 伍、 研究目的. 一、. 慢性糖尿病小鼠肺泡巨噬細胞吞噬能力. 已知糖尿病是一種慢性的疾病，且糖尿病對於遭受下呼吸道感染而言是 一個獨立的危險因素 (Mackowiak et al., 1979)，但是若對於同樣得到敗血症 的病人作觀察，反而糖尿病人比非糖尿病人較不容易進入更嚴重的病程，例 如成人呼吸窘迫症 (acute respiratory disease syndrom; ARDS; Moss et al., 2000)，而就本文前述所了解的，無疑地，肺泡巨噬細胞在下呼吸道，是抵抗 外來微生物的主力，亦是第一線的吞噬細胞 (Dorthy et al., 2000)，所以，為 了要觀察糖尿病對於下呼吸道免疫能力的影響，最直接的方法就是以慢性糖 尿病小鼠的肺泡巨噬細胞對於外來顆粒或者大腸桿菌 (E.coli) 之吞噬能力 作為本篇的研究題材。. 二、 慢性糖尿病小鼠肺泡巨噬細胞對於肺炎克雷伯氏菌之殺菌能力. 根據文獻記錄發現，肺炎克雷伯氏菌特別好發於台灣的糖尿病人，其 引起的原發性肺炎，病程進展快速，病情嚴重，甚至出現敗血症症狀，且. 27.
(28) 伴隨高死亡率 (Cheng et al., 1991; Chen et al., 2000)，為此特殊關聯，於是 本篇實驗欲探討慢性糖尿病是否會造成小鼠的肺泡巨噬細胞消滅肺炎克雷 伯氏菌的能力降低。. 28.
(29) （圖一）：肺泡巨噬細胞在光學和電子顯微鏡下的外觀呈現. Figure 1. The morphology of alveolar macrophage under the microscopy. (J. Gen. Micro. 129:2181-2191, 1983.) 29.
(30) 30.
(31) 第二章 材料與方法. 壹、糖尿病動物模型的誘發. 一、0.05 M, PH 4.5 檸檬酸鹽緩衝溶液 (Citrate buffer) 的製備. 材料： 檸檬酸鹽(Citric Acid; C6H5Na3O7; USB)、微量天平、二次水(dd H2O)、1N & 12N 氫氧化鈉(NaOH)、1N & 12N 鹽酸 (HCl)、50 ml 離心管(50 ml centrifuge tube)、塑膠滴管 (droper)、小燒杯、拭淨紙 (wipes) 、酸鹼側定儀 (pH Vision, Jenco, Electronic; LTD)、PH 4、PH 6.8 校正液，試管震盪器 (vortex mixer)。. 方法： 加入 10 ml dd H2O，加入 2.5 mmole Citric Acid、vortex 均勻，加入 dd H2O 至 30 ml，vortex 均勻，先後以 PH 4、PH 6.8 校正酸鹼測定儀，以 dd H2O 清 洗探針，以拭鏡紙擦乾探針，測量 sodium citrate buffer 的 PH 值，太酸：慢 慢滴加 NaOH，太鹼：慢慢滴加 HCl、直到 PH＝4.5，酸鹼互換間，須以 dd H2O 清洗探針，以拭鏡紙擦乾探針，最後加入 dd H2O 至 50ml，其 PH 應為 4.5。. 二、實驗動物之品管：. 31.
(32) 1. 動物品系：C57BL/6J male mice 2. 動物來源：國家科學委員會－國家實驗動物繁殖及研究中心 3. 動物週齡：4 週 4. 飼養環境：恆溫 22℃，空調房間，相對溼度約 55﹪，12 小 時照明. 三、糖尿病的誘發. 材料： PE 飼養盒、木屑墊料、鼠用飼料、餵水用水瓶、一次水、磅秤、streptozotocin (N-(Methylnitrosocarbamoyl)-o glucosamine; Sigma)、0.05Ｍ; pH 4.5 ; 4℃的檸檬 酸緩衝溶液(citrate buffer)、吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue tip)、注射 用針 (1 c.c. syringe)、5 c.c. 試管。. 步驟： 將 PE 盒底部鋪滿墊料，蓋子上放置飼料及裝水小瓶，把小鼠放在 PE 盒 中飼養 2 weeks，任其自由進食飲水，將 6-week-old 的小鼠秤重，依小鼠的體 重酌取 0.55mg/g 的 streptozotocin 的量，注射前先將 streptozotocin 溶於 0.2 ml 的 citrate buffer，稀釋後至少 2 分鐘後再讓小鼠接受注射，小鼠接受連續 4 天 腹腔的 streptozotocin 注射，在第一次注射 streptozotocin 的 7 天後測量小鼠血 32.
(33) 糖值，血糖值必須≧300mg/dl 才視為有意義之糖尿病誘發，若血糖值未超過 300 mg/dl，則再連續給予小鼠兩天的 0.55mg/g 的 streptozotocin 注射，同樣 的，在第一次注射 streptozotocin 的 7 天後測量小鼠血糖值，血糖值必須≧ 300mg/dl，小鼠糖尿病誘發後養育 6 個月，每週秤一次體重並記錄。. 四、小鼠血糖測量. 材料： 葡萄糖分析儀 (Model 1500 sidekick glucose analyzer; YSI)、校正液 (YSI 2747 standard; YSI)、25 μl 鈍針加樣器 (YSI 1501; YSI)、膠帶、報紙、 透明小塑膠袋、麻醉用玻璃鐘罩、麻醉用小罩杯、拭淨紙 (wipes) 、乾棉球、 止血小夾、70﹪酒精棉、水、小燒杯、乙醚 (ethyl ether) 、解剖台、解剖用 剪刀、. 方法： 準備材料，鋪報紙，注入乙醚於玻璃鐘罩及麻醉小罩杯，校正儀器， 校正液值為 180 mg/dl，用水清洗 pipette 後，用拭淨紙擦乾，將小鼠放入玻 璃鐘罩中麻醉，小鼠昏迷後，將其平躺置於解剖台上，小鼠四肢以膠帶固定， 若小鼠有醒來的跡象，以麻醉小杯蓋住其口鼻，70﹪酒精棉消毒小鼠尾巴， 用剪刀剪斷一小段 mice 尾巴，擠出 5∼6 滴血（＞25μl）於透明平滑塑膠帶 33.
(34) 上，以鈍針加樣器吸取 25 μl mice 全血，將全血打入儀器測量血糖值，清洗 pipette 後，用拭鏡紙擦乾，以乾棉球及止血夾夾住尾小鼠尾巴止血，記錄血 糖值。. 貳、小鼠肺泡巨噬細胞及血液之取得. 一、 小鼠支氣管灌流術 (bronchoalveolarr lavage fluid; BAL) 及血液 採集. 材料： 糖尿病誘發 6 個月後之小鼠、乙醚 (ethyl ether)、麻醉用玻璃鐘罩、麻醉 小罩杯、解剖板、乾棉花、膠帶、棉線、解剖盤、圓頭鑷子、尖頭鑷子、尖 頭小剪刀、圓頭剪刀、70﹪噴頭酒精 (70﹪alcohol)、無菌生理食鹽水 (normal saline) 、無菌一倍磷酸鹽緩衝溶液 (1X PBS)、含肝制凝素 (heparin) 的抗凝 管、離心管 (15 ml、 50 ml centrifuge tube)、微量離心管 (1.5 ml micro centrifuge tube)、PE 管 (polyethylene tube; PE - 50)，21 號針頭 (21-gauge needle)、針筒 (1 ml syringe)、26 號針頭的 1 ml 無菌注射針，冰塊，冰桶。. 步驟： PBS 置於冰上，以 saline 製備稀釋的 heparin 於將要存血的微量離心管. 34.
(35) 中，器皿以 70﹪酒精消毒、以食鹽水沖洗殘餘酒精，器械泡於無菌食鹽水中， 乙醚麻醉小鼠，用膠帶將小鼠四肢固定在解剖板上，以 70﹪酒精噴溼消毒小 鼠全身的毛，將皮從肚子到頸部剪開，腋下稍微橫向剪開，把皮往外左右搬 開，使皮肉分離，從肚子剪開肉，剪到胸下圍時，沿著肋骨橫向剪開，剪開 約 1/3 胸骨，將胸骨提高，小心剪開橫隔膜，以 1 ml 無菌注射針從心尖插入 心臟，採集全血，將全血靜置已含有稀釋 heparin 的微量離心管中，頸部皮用 2 支鑷子剝開，找到甲狀腺和氣管，小心仔細的扯開氣管上的肉，解剖板旋轉 180°、小鼠頭朝自己，將氣管上的肌肉膜拉高並剪開，暴露出氣管後，用鑷 子將氣管撐住，鑷子夾線，從氣管下方穿線，用尖剪刀在鑷子下方、也就是 較靠近頭的地方替氣管剪一小洞，穿入 PE 管，綁線固定，用膠帶在桌上固 定 PE 管，插上已經抽好的 4℃、1 ml 的 1X PBS 的針筒，慢慢打入 PBS， 看到肺脹起來，再慢慢吸回 PBS，打入與吸回 PBS 的時間共約 2 min.，吸回 的 lavage 打入 15 ml 離心管中，離心管要置於 4℃冰上，重複灌洗 1 ml PBS， 最後總共灌出 15 ml 支氣管灌流液。. 二、細胞計數 (cell count). 材料： 15 ml 離心管 (15 ml centrifuge tube)、滅菌一倍磷酸鹽緩衝溶液 (1X PBS)、滴管 (dropper)、電動吸取器 (electrical Pipette)、無菌吸管 (5 ml 35.
(36) pipettes)、細胞計數盤 (hemacytometer; Hausser Scientific, USA)、計數器、顯 微鏡 (microscopy)、離心機。. 步驟： 15 ml 支氣管灌流液，離心 1100 rpm、4 ℃、5 min，倒掉 1X PBS，輕 輕把管子底部細胞敲散，加入 1X PBS 至 5 ml，以 5 c.c.電動 pipette 小心地 混合細胞液，這一步是為了清洗細胞，離心 1100 rpm 、4 ℃、5min，倒掉 PBS、輕輕敲散底部細胞，加入 1X PBS 至 5 ml，電動 pipette 小心均勻地混 合後，吸 20 μl 細胞液，前 2－3 滴去掉，輕輕打入已經蓋上蓋玻片的細胞 計數盤的凹槽中，看到細胞液剛好蓋滿格子即可，再顯微鏡下算取井自四周 四大格之細胞總數，再以下列公式計算細胞的總數。 公式： （四格計算細胞總數/4）× 5 ml ×104 ＝支氣管灌流液中的細胞數目。. 三、 細胞型態. A.) Cytospin. 材料： 玻片 (micro slides glass; Daco)、玻片架、滴管 (droper)、 cytospin 用固定架和 cytospin 用漏斗 (Shadon)、打洞濾紙 (190005 Filter 36.
(37) Cards; Shandon)、 cytospin 離心機 (cytospin 3; Shadon)。. 步驟： 固定架上架玻片，貼濾紙，洞對固定架的洞，放漏斗，夾住，滴 7 滴支 氣管灌洗液，開離心機 power，開蓋子，架子放對稱，蓋內蓋，壓緊，蓋外 蓋，按 set speed 300 rpm.，按 set time 5 min.，按 START。. B.) Giemsa stain. 材料： 甲醇 (methanol)、 Giemsa 染液、二次水 (ddH2O)、染盒、滴管 (droper)、 玻片染架、水盒、顯微鏡 (microscopy)。. 步驟： 取出 cytospin 好的玻片，風乾，用滴管灑 1 c.c 甲醇 (methanol) 於玻片 上，固定細胞用，風乾，約 30 min. 後，玻片放入玻片架， Gimsa 使用前搖 勻，取 3 c.c. Giemsa 染液，加 dd H2O 到 90 c.c.，使 Giemsa 染液與 dd H2O 的比例為 1：30，玻片架放入裝好染液染瓶中，稍微上下動一下，染勻，染 30 min，片架拿出，放入水盒中，用水沖 1 min，風乾，在光學顯微鏡下看片， 觀察細胞型態。若染不好，則重複步驟，從滴加甲醇開始。. 37.
(38) 參、小鼠肺泡巨噬細胞的吞噬能力. 一、小鼠新鮮血清的製備. 材料： 小鼠之新鮮全血、15 離心管 (15 ml centrifuge tube)、離心機、試管架。. 步驟： 取 C57BL/6J 小鼠全血 6 ml 以上，等血液凝固，離心 2500 rpm , 20 min，取出上層的血清 (serum)，血清再離心 4000 rpm , 30 min，使血球和 fibrinogen 在血清中完全除去。. 二、螢光小球 (FL-Beads) 的製備. 材料： RPMI Medium 1640、1×0.1 micro filtered with L-glutamin (Gibco © )，胎 兒牛血清 (fetal bovine serum; FBS)、15 離心管 (15 ml centrifuge tube)、試管 架、鋁箔紙、Fluorensbrite carboxyolate 0.85micro (Sphero TM Microparticles， yellow; Pharmingen)、離心機、冰桶、冰、新鮮小鼠血清、無菌通風櫥、試管 震盪器 (vortex mixer)。. 38.
(39) 步驟： 在無菌通風櫥中操作，避光，所有溶液皆置於冰桶上，加 10 ml RPMI-1640 於 15 ml 離心管中，離心管包上鋁箔紙，加 1 ml Fluoresbrite carboxyolate 0.85 micro，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640， 離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加少許 RPMI-1640 打散混合， 加 2 ~ 5 ml 新鮮小鼠血清，靜置使其發生調理作用 (opsonize)，4℃、30 min， 離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液，加 10 ml RPMI-1640，輕敲離心 管底，盡量將沈澱結塊物打散，離心 4000 rpm、 4℃、30 min，除去上清液， 加 10 ml RPMI-1640，輕敲離心管底，盡量將沈澱結塊物打散，離心 4000 rpm、 4℃、30 min，除去上清液，加 3 ml FBS，打散螢光小球，離心 4000 rpm、4 ℃、10 min，除去上清液，加 5 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min， 除去上清液，加 5 ml RPMI-1640，離心 4000 rpm、4℃、30 min，除去上清液， 敲散沈澱在試管底部的螢光小球，加 6 ml RPMI，製備完之螢光小球儲存於 4 ℃。. 三、肺泡巨噬細胞吞噬螢光小球. 材料： 製備完好之螢光小球、0.1﹪FBS/ 1× PBS、經滅菌及過濾的一倍磷酸鹽緩 39.
(40) 衝溶 (1X PBS)、4﹪副福馬林 (4﹪paraformaldehyde= 4g paraformaldehyde/ 100 ml PBS)、70﹪酒精 (alcohol)、 RPMI-1640、 1000p、 200p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue tip)、 5 ml 試管 (流式細胞儀 Falcon © )、試管蓋、試管 架、電動吸取器 (electrical Pipette)、冰桶、冰、鋁箔紙、37℃ 培養箱 (incubator)、 離心機、流式細胞儀、計時器、試管震盪器 (vortex mixer)。. 步驟： 開 37℃培養箱，使其達到 250 rpm，將 0.1﹪FBS、RPMI-1640、製備 好的螢光小球水浴回溫到 37℃，水浴槽加蓋使螢光小球避光，肺泡灌洗液的 cell count 完，依比例將 cell 分裝到 falcon 中，一組分裝 2 管； (1) 4℃ 完 全不加 beads. (2) 加 37℃ beads，不加 beads 的細胞靜置於冰上即可，要加. beads 的細胞離心 1200 rpm、4℃、10 min，直接在離心機旁倒掉上清液，輕 輕打散細胞， falcon 包上鋁箔紙，關燈，加入 50 μl 的 0.1﹪FBS，加入 50 μl 的 RPMI-1640，螢光小球混和均勻，加入 50 μl 的螢光小球，立即置入 37℃， 250 rpm 培養箱中， 120 min，另一組輕輕搖晃後置於冰上蓋上蓋子 避光，2 hr 後加入 1 ml 4℃、4﹪paraformaldehyde，充分混和，靜置冰上， 蓋上蓋子避光， 10 min，離心 1200 rpm、4℃、10 min，除去上清液，避光， 將細胞輕輕打散，加 2 ml PBS， 輕輕搖晃，離心 1200 rpm、4℃、10 min， 除去上清液，避光，將細胞輕輕打散，加 1 ml PBS，輕輕搖晃，上機，使用. 40.
(41) 流式細胞儀 FL-1 即可，FITC 必須由 495 nm 藍光激發，並激發出 525 nm， 由細胞儀偵測接收。. 四、肺泡巨噬細胞吞噬螢光 E. coli. 材料： 胎兒牛血清 (fetal bovine serum; FBS)、經滅菌及過濾的一倍磷酸鹽緩 衝溶 (1X PBS)、70﹪酒精 (alcohl)、PHAGOTEST® Kit： (1) E. coli-FITC Quenching solution. (3) Lysing solution. (4) Washing solution. (2). (5) DNA. staining solution (Orpegen Pharma)、 1000p、 200p、 20p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue & yellow tip)、 5 ml 試管 (流式細胞儀 Falcon © )、試管 蓋、試管架、冰桶、冰、鋁箔紙、37℃水浴槽、離心機、流式細胞儀 (FACSCaliburTM )、計時器、試管震盪器 (vortex mixer)。. 步驟： 開 37℃ 水浴槽，使其達到 37℃，將 FBS 和 Lysing solution 放在 37 ℃ 水浴槽，使其回溫到 25℃，肺泡灌洗液的 cell count 完，依比例將 cell 分 裝到 falcon 中，一組分裝 3 管： (1) 完全不加 E. coli. (2) 4℃ 加 E. coli. (2×105 cells/管) (3) 37℃ 加 E. coli (2×105 cells/管)，細胞離心 1100 rpm, 4℃, 5. 41.
(42) min，直接在離心機旁倒掉上清液，輕輕打散細胞， falcon 包上鋁箔紙，關 燈，在冰上，加入 100 μl PBS，在冰上，加入 20 μl FBS，在冰上，加入 20 μl E. coli，低速 vortex 2-3 秒鐘，放入 37℃ 水浴槽，incubate 2 hr，水浴槽 加蓋避光，另一組置於冰上蓋上蓋子避光，2 hr 後在冰上加入 100μl Quenching solution，低速 vortex，在冰上加入 3 ml Washing solution，vortex， 離心 1100 rpm、5 min、4℃，除去上清液，避光，將細胞輕輕打散，在冰上 加入 1.5 ml Washing solution，低速 vortex，離心 1100rpm、5 min、4℃，除去 上清液，避光，將細胞輕輕打散，在室溫下，加入已回溫至室溫的 2 ml Lysing solution，低速 vortex，室溫下，靜置 20 min，避光，離心 1100rpm、5 min、 4℃，除去上清液， 避光，將細胞輕輕打散，在冰上加入 3 ml Washing solution，低速 vortex，離心 1100rpm、5 min、4℃，除去上清液，避光，將細 胞輕輕打散，在冰上加入 200 μl DNA staining solution，低速 vortex，靜置 冰上 10 min，蓋上蓋子避光，加 0.5 ml PBS，低速 vortex，60 min 內上機， FITC 必須由 488 nm 藍光激發。. 肆、小鼠肺泡巨噬細胞清除 Klebsiella pneumoniae 的能力. 一、定量 Klebsiella pneumoniae 菌液濃度. A.) 稀釋菌液及培養 42.
(43) 材料： 酒精燈、70﹪噴霧酒精、擦手紙、裝 70﹪酒精的小燒杯、微量離心管 (1.5 ml micro centrifuge tube)、微量離心管放置架 (eppendorff rack)、15 ml 無菌培 養血清瓶、試管架、無菌 Tryptic Soy Broth (TSB broth; Becton Dickinson)、無 菌 LB Agar, Miller plate (Becton Dickinson)、電動吸取器(electrical Pipette)、無 菌吸管 (5 ml pipettes)、無菌的一倍磷酸鹽緩衝溶 (1X PBS)、 1000p、 200p、 20p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue & yellow tip)、白金 loop、三角玻 璃棒、廢物桶、筆、無菌通風櫥、37℃ 培養箱 (incubator)， Klebsiella pneumoniae (來源：中國醫藥學院附設醫院之原發性肺炎臨床病人分離之細 菌)。. 步驟： 以下步驟必須在無菌通風櫥中操作，用 loop 取 1 個 colony 的 K. pneumoniae ，將 K. pneumoniae 種入 5 ml TSB broth，mix ，放入 37℃培養箱， shake，overnight (18 hr) 培養，18 hr 後，取 20 μl 含 K. pneumoniae 的 broth，種入 5 ml TSB broth，mix，放入 37℃培養箱，shake，overnight 18 hr 培 養，18 hr 後，作 K. pneumoniae 菌液的 1：10 連續稀釋，準備 10 支標記號碼 的微量離心管，各加入 0.9 ml 無菌 PBS，取 100 μl 含 K. pneumoniae 的 broth 置入 0.9 ml 無菌 PBS，mix，取第一管稀釋菌液 100μl，置入下一管 0.9 43.
(44) ml 無菌 PBS，mix，重複上述步驟，共 10 次 1：10 連續稀釋，準備 10 盤標 記號碼的 LB agar plate，塗抹稀釋菌液前，先在 LB agar plate 上滴加 30 μl 無 菌 PBS，以防止菌液尚未塗勻就先乾掉，每管稀釋菌液，均勻 mix，各取 30 μ l 滴加在 LB agar plate 上，以三角玻璃棒均勻塗抹，三角玻棒泡在 70﹪酒精， 取出後陰乾，才能再塗抹下一盤，將塗抹好稀釋菌液的 LB agar plate，放入 37℃培養箱，overnight (18 hr) 培養，18 hr 後，計算並記錄 plates 上的 colony 數目，剩下的各管稀釋菌液用來測量 O.D. 值。. B.) 稀釋菌液的 O.D 值. 材料： 10 倍連續稀釋的 K. pneumoniae 菌液，光譜測定儀 (Spevtrophotometer Du® 640; Beckman Coulter)、石英管 (cuvette; Hellma)，沖洗用 70﹪酒精 (alchol)、拭淨紙 (wipes)、廢物桶、廢液桶、試管架、無菌一倍磷酸鹽緩衝溶 (1X PBS)、1000p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖(blue tips)。. 步驟： 打開光譜測定儀，設定波長為 600 nm，暖機 30 min，取 600μl 無菌 PBS 作為 blank，以 70﹪酒精沖洗石英管，拭淨紙擦乾，將稀釋菌液均勻 mix， 各取 600 μl，測量吸光值，紀錄，隔日比對相同稀釋菌液濃度在 LB Agar 上 44.
(45) 生長的菌落數目。 結果： ∵ 10-5 稀釋菌液的 colony 數目≒ 100 →. 10-3 稀釋菌液濃度應為：104 CFU / 30 μl. ∴ 以 10-3 稀釋菌液之吸光值＝ 0.0045 表示菌液濃度為 ：104 CFU / 30 μl. 二、小鼠肺部感染 Klebsiella pneumoniae. 材料： C57BL/6J 雄性小鼠、乙醚 (ethyl ether)、麻醉用玻璃鐘罩、解剖板、 無菌乾棉球、膠帶、縫線、縫針、持針器、解剖盤、麻醉小罩杯、優碘、剃 毛機、試管震盪器 (vortex mixer)、手術燈、鈍頭鑷子、尖頭鑷子、尖頭小剪 刀、圓頭剪刀、70﹪噴頭酒精、無菌生理食鹽水(normal saline)、50 μl 微量 注射針筒 (50 μl syringe)、離心管(15 ml ＆ 50 ml centrifuge tube)、微量離心 管 (1.5 ml micro - centrifuge tube) 、高速離心管中、PE 管 (polyethylene tube; PE - 50)，21 號針頭 (21-gauge needle)、針筒(1 ml syringe)、26 號針頭的 1 ml 無菌注射針，冰塊，冰桶、104 CFU /30 μl 濃度之 K. pneumoniae。. 步驟： 45.
(46) 器皿 70﹪酒精消毒，以無菌 normal saline 沖洗殘餘酒精，器械泡於無 菌 normal saline 中，微量針以無菌 normal saline 沖洗數次，再用 104 CFU /30 μl 濃度之 K. pneumoniae 菌液沖洗一次， K. pneumoniae 菌液 vortex 均 勻，以微量針抽好 30μl K. pneumoniae ，乙醚麻醉小鼠、不可麻死，用膠 帶將小鼠四肢固定在解剖板上，將小鼠門牙以線綁住，拉直小鼠頭部再用膠 帶固定，剃掉小鼠頸部的毛後，以優碘消毒小鼠頸部皮膚，將小鼠頸部皮剪 開，用鑷子將氣管上方的肉和胸腺小心撥開，將氣管上的膜拉高，剪開膜露 出氣管，暴露出氣管後，用鑷子將氣管撐住，以 21 號針頭注射入 30μl K. pneumoniae ，共 104 隻，讓小鼠直立 2 min.，將小鼠頸部的皮縫合，放回飼 養盒，使其自由進食進水，飼養 20 小時。. 三、感染後小鼠肺中及血中 Klebsiella pneumoniae含量. A.) 老鼠左肺、肺泡巨噬細胞及血液檢體的取得. 材料： 感染 K. pneumoniae 20 hr. 後之 C57BL/6J 雄性小鼠、乙醚 (ethyl ether)、麻醉用玻璃鐘罩、解剖板、無菌乾棉球、膠帶、縫線、止血鉗、解剖 盤、麻醉小罩杯、優碘、鈍頭鑷子、尖頭鑷子、尖頭小剪刀、圓頭剪刀、70 ﹪噴頭酒精、無菌生理食鹽水 (normal saline)、無菌一倍磷酸鹽緩衝溶液(1X 46.
(47) PBS)、含肝制凝素 (heparin) 的抗凝管、離心管(15 ml ＆ 50 ml centrifuge tube)、微量離心管 (1.5 ml micro - centrifuge tube)、PE 管 (polyethylene tube; PE - 50)，21 號針頭 (21-gauge needle)、針筒(1 ml syringe)、26 號針頭的 1 ml 無菌注射針，冰塊，冰桶。. 步驟： PBS 置於冰上，以無菌 normal saline 製備稀釋的 heparin 於即將存血的 微量離心管中，器皿用 70﹪酒精消毒、以無菌 normal saline 沖洗殘餘酒精， 器械泡於無菌 normal saline 中，小鼠感染後 20 小時，乙醚麻醉小鼠，以下手 術部分皆在無菌通風櫥中操作，將小鼠胸腔打開 ，以 1 c.c. 空真插入心臟， 採集 0.2 c.c.全血，↓將全血靜置已含 0.1 c.c. 稀釋 heparin 的微量離心管中， 全血靜置於冰上，將胸骨完全剪開，以止血鉗將肋骨往左右扳開固定，頸部 皮用 2 隻尖鑷子剝開，找到甲狀腺、氣管，小心仔細的扯開氣管上的肉，將 氣管上的膜拉高，剪開露出氣管，暴露出氣管後，用鑷子將氣管撐住，鑷子 夾線，從氣管下方穿線，將小鼠心臟拉高剪去，將其左肺以鈍端鑷子拉出後， 可看到左支氣管，用止血鉗把左肺拉出固定住，左支氣管用縫線綁兩個死結， 剪下左肺，放入含有 3 ml PBS 的高速離心管中，將左肺靜置於冰上，用尖剪 刀在鑷子下方（較靠近頭的地方）替氣管剪一小洞，穿入 PE tube ，PE tube 綁線固定，用膠帶在桌上固定 PE tube，插上抽好 0.6 c.c. PBS 的針筒，慢慢打. 47.
(48) 入 PBS ，看到右肺脹起來，再慢慢吸回 PBS，重複灌洗 0.6 c.c. PBS，最後總 共灌出 3 ml 灌洗液 (BAL) ，肺泡灌洗液靜置於冰上。. B.) 老鼠檢體處理. 材料： 均質機、滅菌的均質棒、DEPC 水、氯仿 (Phenol Chloroform IsoAmul alcohol)、70﹪酒精 (alcohol)、裝冰塊的小燒杯、廢液桶、離心機、15 ml 離 心管、玻片 (micro slides glass; Daco)、玻片架、滴管 (droper)、cytospin 用固 定架和 cytospin 用漏斗 (Shadon)、打洞濾紙 (190005 Filter Cards; Shandon)、 cytospin 離心機 (cytospin 3; Shadon)、小鼠肺泡灌洗液、左肺、全血、微量離 心機 (Microfuge centrifuge; Beckman)。. 步驟： 將小鼠的肺泡灌洗液拿去做 cytospin，玻片陰乾以甲醇固定，作 Giemsa 染色，將左肺以均質機在冰上均質，均質液置於冰上，清洗均質棒，15 ml 離 心管內裝 DEPC 水、氯仿、70﹪酒精，順序為： DEPC 水兩次、氯仿一次、 DEPC 水一次、70﹪酒精一次、等酒精乾燥。清洗完均製棒後才能均質下一 管左肺；0.2 ml 全血離心 2500 rpm，15 min. ，離出血清後靜置於冰上。. 48.
(49) C.) 老鼠肺中及血液中 Klebsiella pneumoniae 含量. 材料： 酒精燈、70﹪噴霧酒精、擦手紙、裝 70﹪酒精的小燒杯、微量離心管 (1.5 ml micro - centrifuge tube)、微量離心管放置架(eppendorff rack)、15 ml 無菌培 養血清瓶、三角玻璃棒、無菌 PBS、無菌 LB agar plate、 1000p、200p、20p 吸管唧筒 (pipette pump)、吸管尖 (blue & yellow tip)、無菌 blue、yellow tips、 廢物桶、筆、無菌通風櫥、37℃ 培養箱 (incubator) 、老鼠左肺均質液、已 分離出血清的全血。. 步驟： 取老鼠之肺均質液及血清各 100 μl 用無菌 PBS 作 1：10 的連續稀釋，各 稀釋到 10-1、10-2、10-3 倍，取均質液及血清還有各倍數稀釋液各 20μl 均勻 塗抹於標記好的 LB agar 上，再將血清與血球混合，形成全血，取全血 20μ l 均勻塗抹於 LB agar 上，將塗抹好的 LB agar 靜置於 37℃ 培養箱中，培 養 18 小時，18 小時後計算 LB agar 上的菌落數。. 伍、統計方法. 49.
(50) 慢性糖尿病組與其控制組；急性糖尿病組與其控制組的血糖值和體重紀 錄、急性糖尿病組與其控制組的 AMs 吞噬能力實驗使用成對測試分析 (Paired Student-t test; Excel© Window 2000; t 檢定; 成對母體平均數差異檢 定) 。慢性糖尿病組與其控制組；急性糖尿病組與其控制組的 AM 和殺菌能 力實驗取 log CFU+1 之後，使用成對測試分析。慢性糖尿病組與其控制組的 血糖值和體重紀錄、急性糖尿病組與慢性糖尿病組的比較，皆使用非配對測 試 (Unpaired Student-t test;. Excel© Window 2000; t 檢定; 兩個母體平均數差. 異檢定，假設變異數不相等). 50.
(51) 第三章. 結果. 壹、 糖尿病小鼠之生理. 一、. 糖尿病小鼠之血糖值. 6 週齡之 C57BL/6J 品系的小鼠，控制組的小鼠注射檸檬酸鹽緩衝溶液 (citrate buffer)，實驗組的小鼠則以連續注射 4 天以上的 STZ， 破壞胰臟蘭氏 小島之 β 細胞後，測量小鼠之全血中葡萄糖 (glucose) 的濃度，若小鼠之血 糖值 ＞ 300 mg/dl ，則是為有意義之成功糖尿病誘發，在小鼠第 8 週齡時， 也就是糖尿病誘發後兩星期，控制組的小鼠，其血糖平均值為 142 ±3.3 mg/dl，實驗組的小鼠血糖平均值為 361.2 ±3.3 mg/dl，且實驗組小鼠血糖值 與控制組小鼠血糖值比較，兩組有明顯統計學上的差異，其 p＜0.05，因此， 結果顯示本實驗成功的誘發了小鼠的糖尿病，在小鼠成功誘發糖尿病之後， 持續飼養小鼠到 6 個月大，使其變成慢性糖尿病之小鼠，在將其犧牲之前一 週，也就是 29 週齡時，為確認小鼠仍然有糖尿病，於是再次檢測小鼠的血 糖值，則控制組的小鼠血糖平均值為 208.8 ±19.8 ml/dl， 實驗組的小鼠血糖 平均值為 518.6 ±25.8，實驗組小鼠血糖值與控制組小鼠血糖值比較，兩組 有明顯統計學上的差異，其 p＜0.05，無疑的，實驗組小鼠血糖值仍然維持 ＞ 300 mg/dl 的濃度，而且與糖尿病誘發初期也就是第 8 週齡時相比較，實驗組 51.
(52) 小鼠血糖值有升高的情形，而且 p＜0.05，有統計學上的差異 ，在控制組小 鼠方面，29 週齡時，其血糖平均值與第 8 週齡時相比較有有明顯上升的情形， p＜0.05，但是雖然控制組小鼠血糖亦有上升，但是其血糖濃度仍然未達 300 mg/dl ，尚未構成罹患糖尿病的條件，所以控制組之小鼠依然是正常沒有糖尿 病之小鼠（圖三） 。第 8 週控制組小鼠 n = 42，實驗組小鼠 n = 46，第 29 週控 制組小鼠 n = 10，實驗組小鼠 n = 27，以非配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。至於急性糖尿病組的小鼠，其誘發方式為之前的控制組小鼠在第 30 週齡時分離出一組，一樣給予 4 天以上連續注射 STZ 誘發糖尿病，誘發 後第 18 ~ 20 天，有就是第 33 週齡時犧牲，此組就當作急性糖尿病小鼠，急 性糖尿病小鼠的血糖平均值在第 32 週齡時為 320.8 ± 5.7 mg/dl，血糖值 ＞ 300 mg/dl ，證明小鼠被成功的誘發糖尿病，而其控制組的血糖值則為 185.3 ± 9.9 mg/dl，急性糖尿病組與控制組血糖值比較 p＜0.05，有明顯統計學上的差 異 （圖四） 。第 32 週控制組小鼠 n = 4，急性糖尿病組小鼠 n = 4，以配對測 試比較，結果以 Mean ±SEM 表示。若將急性糖尿病組小鼠與第 8 週慢性糖 尿病小鼠血糖比較，急性糖尿病組小鼠血糖值較高，其 p＜0.05，若將急性糖 尿病組小鼠與第 29 週慢性糖尿病小鼠血糖比較，29 週慢性糖尿病組小鼠血糖 值高出許多，其 p＜0.05，除此之外，無論慢性或急性之糖尿病小鼠，只要經 過 STZ 誘發糖尿病，與正常小鼠相較，都有出現多吃、多喝、多尿之三多症 狀。. 52.
(53) 二、. 糖尿病小鼠之體重. 從誘發小鼠慢性糖尿病開始，比較每個月糖尿病小鼠與控制組小鼠 之體重變化，其 Mean ±SEM 值表示於（表一），結果顯示自小鼠成功誘發 糖尿病後一個月開始，糖尿病組之小鼠體重皆比正常小鼠輕，且 p＜0.05，每 一個月兩組別的小鼠體重比較皆有統計學上的差異 （圖五） 。在誘發急性糖 尿病小鼠方面，在第 30 週齡時，急性糖尿病組之體重平均值為 28.33 ±1.12 g，控制組小鼠之體重平均值為 28.17 ± 1.19 g 及，兩組體重並無統計學上的 差異，在糖尿病誘發後第 18 天，也就是小鼠第 33 週齡時，急性糖尿病組之 體重平均值為 24.5 ±1.32 g，控制組小鼠之體重平均值為 27.5 ±1.55 g，兩 組之體重比較，p = 0.067。尚未達到統計學的差異（圖六） 。第 33 週控制組小 鼠 n = 4，急性糖尿病組小鼠 n = 4，以配對測試比較，結果以 Mean ±SEM 表示。. 貳、糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞. 一、 肺泡巨噬細胞之型態和比例. 將支氣管灌流液 (BAL) 所取得之細胞，以 Giemsa stain 染色，可看到. 53.
(54) 灌流液中細胞之種類及比例，Giemsa stain 可將肺泡巨噬細胞質染成紅色，細 胞核染成深藍色，肺泡巨噬細胞之核質比約為 1 : 3，有時可在細胞質看見空 泡，染色結果顯示無論是慢性糖尿病小鼠、急性糖尿病小鼠或正常組小鼠， 其肺泡巨噬細胞在灌流液中之比例皆＞92 %。. 二、 肺泡巨噬細胞之數目. 從支氣管灌流液 (BAL) 所取得之肺泡巨噬細胞數目，控制組小鼠有 6.8 ±0.58 ×105 cells ，慢性糖尿病小鼠有 8.58 ±0.84 ×105 cells，慢性糖 尿病小鼠與其控制組細胞數目比較有統計學的差異， P＜0.05 （圖七）。第 33 週控制組小鼠 n = 9，慢性糖尿病組小鼠 n = 9，以配對測試比較，結果以 Mean ±SEM 表示。急性糖尿病小鼠灌流液細胞數目則為 13.95 ± 1.05 ×105 cells ，其控制組細胞數目則為 6.7 ±1.795 ×105 cells，但是兩組相比較，其 p = 0.15，急性糖尿病小鼠之灌流液細胞數和其控制組的細胞數目沒有差異， （圖 七）， 33 週控制組小鼠 n=3，急性糖尿病組小鼠 n=3，以配對測試比較，結 果以 Mean ±SEM 表示。如果拿慢性糖尿病小鼠之灌流液細胞數和急性糖尿 病組的細胞數目相比較，急性糖尿病組的細胞數目要比慢性糖尿病小鼠多，p ＜0.05。33 週慢性糖尿病小鼠 n = 9，急性糖尿病組小鼠 n = 3，以非配對測 試比較，結果以 Mean ±SEM 表示。. 54.
(55) 三、 肺泡巨噬細胞之吞噬能力. (1) 以小鼠肺泡巨噬細胞在體外吞噬螢光小球的實驗，觀察糖尿病 小鼠的肺泡巨噬細胞對於非生物性物質 (nonbiological) 的吞噬能力， 結果分三方面來評估鼠肺泡巨噬細胞吞噬能力，第一：有吞噬螢光小 球的肺泡巨噬細胞佔全部肺泡巨噬細胞數目的百分比 (gated %)，第 二：有吞噬螢光小球的肺泡巨噬細胞，其細胞所吞噬的螢光強度 (FL-Mean)，相當於每一個有吞噬作用發生的肺泡巨噬細胞，其平均所 吞的螢光小球數量，第三：參照 Gina 等人的方法 (Gina et al, 2000)， 以經過計算的吞噬指標 (Phagocytosisi Index; PI = mean × gated %)，來 表示肺泡巨噬細胞的吞噬能力。此外，為了考量小鼠巨噬細胞本身的 背景值，每隻老鼠還作了一項肺泡巨噬細胞未加螢光小球的 no beads 組，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 6.67 ± 3.27 %，其控制組小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 4.31 ± 2.64 %，結果顯示慢性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量比正 常小鼠多， p＜ 0.05 （圖八），第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控 制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。而控 制組小鼠的 no beads 組為 0.81 ± 0.59%，慢性糖尿病小鼠 no beads 組 為 0.81 ± 0.18 %，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組，沒有統. 55.
(56) 計差異， p = 0.19，並且不論控制組和慢性糖尿病組的有 beads 組和 其 no beads 組相較，彼此間也都沒有統計差異。慢性糖尿病小鼠之肺 泡巨噬細胞其細胞所吞噬的螢光強度 (FL-Mean) 為 376.6 ± 221.1， 控制組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度 369 ± 210.1，以慢性糖尿病 小鼠和控制組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.42，所以 兩組吞噬的螢光強度並沒有差異（圖九） ，第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表 示。而控制小鼠的 no beads 組螢光強度為 141.1 ± 56.8，慢性糖尿病 小鼠 no beads 組為 165.3 ± 69.5 ，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組螢光強度，沒有統計差異， p = 0.21，並且不論控制組和慢性 糖尿病組的有 beads 組和其 no beads 組相較，彼此間也都沒有統計 差異。經過運算後吞噬指標 (PI) 結果，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細 胞吞噬指標 (PI) 為 36.32 ± 32.01，控制組之肺泡巨噬細胞的吞噬指 標 (PI) 為 25.12 ± 23.53，以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨噬細 胞的吞噬指標 (PI) 比較， p = 0.15，所以兩組肺泡巨噬細胞吞噬指標 並沒有差異，而控制組小鼠的 no beads 組為 1.365 ± 0.99，慢性糖尿 病小鼠 no beads 組為 1.53 ± 0.75 ，控制組和慢性糖尿病小鼠的 no beads 組，沒有統計差異， p = 0.372，並且不論控制組和慢性糖尿病 組的有 beads 組和其 no beads 組相較，彼此間都沒有統計差異，第. 56.
(57) 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較， 結果以 Mean ± SEM 表示。 (2) 以小鼠肺泡巨噬細胞在體外吞噬螢光 E. coli 的實驗，觀 察糖尿病小鼠的肺泡巨噬細胞對於生物性物質 (biological) ，尤其是細 菌的 LPS 的吞噬能力，結果也是由三方面來評估鼠肺泡巨噬細胞吞噬 能力： gated%， FL-Mean 和 PI，此外，此項實驗除了考量小鼠巨噬 細胞本身的背景值還考慮了螢光 E. coli 的干擾值，每隻老鼠還作了一 項肺泡巨噬細胞也加了螢光 E. coli， 然後將細胞和螢光 E. coli 靜置於 4℃的組別，並將 37℃組的 AMs 表現的 gated%， FL-Mean 和 PI 數 值扣除掉 4℃組的 AMs 表現的 gated%， FL-Mean 和 PI 數值，結 果顯示慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.13 ± 1.51%，其控制組之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.43 ± 1.99%，結果顯示慢性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量與正 常小鼠一樣多， p = 0.22 （圖十） 。第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。而 控制組小鼠的 4℃ E. coli 組為 3.31 ± 1.97%，慢性糖尿病小鼠 4℃ E. coli 組為 6.86 ± 2.03%，控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組 ， 慢性糖尿病小鼠的背景值要比控制組小鼠來得高， p＜ 0.05，並且慢性 糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較， 37℃ E. coli 組. 57.
(58) 的有吞噬增加的情形，p＜ 0.05。以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨 噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.16，所以兩組吞噬的螢光強度並 沒有差異，而控制組小鼠的 37℃ E. coli 組 AMs 表現 FL-Mean 為 10.4 ± 9.25，慢性糖尿病小鼠組則為 49.58 ± 23.93（圖十一）。第 33 週齡 慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組，沒有 統計差異， p = 0.24，並且不論控制組和慢性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，彼此間都沒有統計差異。經過運算後吞噬 指標 (PI) 結果，慢性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞吞噬指標 (PI) 為 1.28 ± 0.48，控制組之肺泡巨噬細胞 37℃ E. coli 組的吞噬指標 (PI) 為 0.73 ± 0.71，以慢性糖尿病小鼠和控制組之肺泡巨噬細胞 37℃ E. coli 組的吞噬指標 (PI) 比較，p = 0.23，所以兩組肺泡巨噬細胞吞噬 指標慢性糖尿病小鼠與控制組沒有差異。第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，結果以 Mean ± SEM 表示。 而控制小鼠的 4℃ E. coli 組 (PI) 為 2.34 ± 1.21，慢性糖尿病小鼠 4 ℃ E. coli 組為 5 ± 1.41，控制組和慢性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組， 也有統計差異， p＜ 0.05，慢性糖尿病小鼠的背景值要比控制組小鼠來 得高，並且慢性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較， 37℃ E. coli 組的吞噬指標有上升的情形，p＜ 0.05。. 58.
(59) 急性糖尿病小鼠之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 3.18 ± 0.97 %，其控制組之肺泡巨噬細胞有吞噬能力的百分比為 8.61 ± 3.33 %，結果顯示急性糖尿病小鼠有吞噬能力的肺泡巨噬細胞數量與正常小 鼠，p = 0.078，及慢性糖尿病小鼠間都沒有差異，p = 0.49（圖十） 。第 33 週齡急性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3；以配對測試比較； 慢性糖尿病小鼠 n = 3；以非配對測試比較；結果以 Mean ± SEM 表 示。而控制組小鼠的 4℃ E. coli 組為 2.79 ± 1.47 %，急性糖尿病小 鼠 4℃ E. coli 組為 5.7 ± 1.94 %，控制組和急性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組，急性糖尿病小鼠的背景值與控制組小鼠沒有差異， p = 0.19， 並且急性糖尿病組的 37℃ E. coli 組和其 4℃ E. coli 組相較，37℃ E. coli 組的有吞噬增加的情形，p＜ 0.05。倘若以急性糖尿病小鼠和控制 組之肺泡巨噬細胞所吞噬的螢光強度比較，p = 0.34，與慢性糖尿病小 鼠相比， p = 0.12，所以急性糖尿病小鼠和不論和控制組或慢性糖尿病 組相較吞噬的螢光強度相較並沒有差異，而控制組小鼠的 37℃ E. coli 組 AMs 表現 FL-Mean 為 12.67 ± 3.18，急性糖尿病小鼠組則為 5.16 ± 4.72（圖十一）。第 33 週齡急性糖尿病小鼠 n = 3； 控制組小鼠 n = 3 ，以配對測試比較，第 33 週齡慢性糖尿病小鼠 n = 3；以非配對測試 比較，結果以 Mean ± SEM 表示。控制組和急性糖尿病小鼠的 4℃ E. coli 組，沒有統計差異， p = 0.2，並且不論控制組和急性糖尿病組的. 59.
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