第四章 結果
三、 茶赤葉枯病及芽枯病分離株之病原性測試
健康茶苗係自南投縣購入種植一年之青心烏龍茶苗(Camellia sinensis cv.
Chin Shin Oolong )、大葉烏龍(Camellia sinensis cv. Dah Yeh Oolong)、臺茶十二號 (Camellia sinensis cv. Ttes No.12)及四季春(Camellia sinensis cv. Shy Jih Chuen)等，
皆將茶苗種於紅土、蛭石、珍珠石(按 2：1：1 體積比混合)的 5 吋盆中，置於遮 雨棚培育至少 1 週後，供作本研究試驗用。
(二)茶樹嫩芽以孢子懸浮液針刺接種試驗
本項為確認分離株之病原性，以青心烏龍作為供試植株，先將酒精噴在擦手 紙上，用以去除嫩芽之髒污，再以清水噴在擦手紙上，以去除嫩芽上之酒精共兩
次，即以消毒過之直徑 1 mm 解剖針穿過嫩芽造成傷口，並將事先配製濃度為 1x105之孢子懸浮液噴灑於嫩芽。另以蒸餾水噴灑有相同傷口之嫩芽作為對照組，
每組實驗皆進行 3 重複，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該嫩芽保溼並置於溫 室，觀察並記錄其是否發病，如發病則進行再分離以確認其病原性。
圖 1、茶樹嫩芽以孢子懸浮液接種後保溼處理之狀況。
Figure 1. Tea sprout in moist PE bag after wound inoculation with conidia suspension.
(三)茶樹葉部以孢子懸浮液進行傷口接種之試驗
本項試驗主要目的在於確認自赤葉枯病斑及芽枯病分離所得炭疽菌株之葉 部病原性，故以青心烏龍作為供試植株，先將酒精噴在擦手紙以去除葉部髒汙，
再以清水噴在擦手紙以去除葉上酒精共兩次，即對葉部以消毒過之解剖刀造成傷 口，並將事先配製濃度為 1x105之孢子懸浮液噴灑於傷口。並以蒸餾水噴灑刀割 傷口作為對照組，每組實驗皆進行 3 重複，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該 茶樹葉片保溼並置於溫室中，觀察並記錄其是否發病，並進行再分離以確認病原 性。
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四、 人工接種茶赤葉枯病及芽枯病之病原再分離
為確認上述分離株之病原性，需依柯霍氏準則將接種發病之植株進行病原再 分離，採用的再分離方式為前述之組織分離法及稀釋分離法，皆自病健部進行再 分離，所得之分離株則與原接種之分離株進行比對及鑑定，以完成柯霍氏準則第 四條。
五、 茶赤葉枯病及芽枯病分離株之鑑定 (一)形態鑑定
根據前人研究，使用形態學鑑定對於區分炭疽病菌非常困難 (Cai et al., 2009)，例如參考不完全菌之檢索表“Illustrated genera of imperfect fungi” (Barnett
& Hunter, 1972)，一般只能檢索至屬，因此本研究乃使用分子鑑定技術來確認病 原菌之分類，但也將菌株之形態特徵加以記錄及拍照。
(二)分子鑑定
1、核苷酸(DNA)之萃取
使用 MagCore® Nucleic Acid Extractor HF16 依照波仕特生物科技 Gene-SpinTM – V3，1-4-3 DNA Extraction Kit 來萃取完整之 DNA。本項係將培養 10 天 之分離株自 PDA 洋菜培養基刮下約 100 mg 之菌絲放入微量離心管，加入液態 氮磨碎後，加入 400 μL GP1 Buffer, 5 μL RNase A (10mg/mL) 至微量離心管並震 盪，於 65℃水浴槽中放置 10 分鐘，每 5 分鐘翻轉一次，再加入 100 μL GP2 Buffer 並震盪，於冰上放置 3 分鐘，將 Filter Column 放入 2 mL Collection Tube 再把樣 品加入，以 13,200 rpm 離心 3 分鐘，丟棄 Filter Column 吸取 400 μL 上清液加入 Sample Tube，再將 Sample Tube 放入 MagCore® Nucleic AcidExtractor HF16 機器 中，將 Elution Tube, Tip Plus Holder Set 放入機器中，將機器設定為 Plant Kit，運 作機器，待運轉完成取出60μL 用於 PCR。
2.目標片段之增幅(PCR 反應)
Polymerase chain reaction(PCR)反應流程如下：於 PCR tube 加入 DNA 1 μL, Primer ITS1 0.5 μL, Primer ITS4 0.5 μL, 2X Taq PCR Master Mix 10 μL, DEPC H2O 8μL，放入 Bioer LifePro thermal cycler 中進行增幅。反應條件為預熱 94℃、10 分 鐘後；94℃、30 秒，50℃、30 秒，72℃、30 秒，三種溫度循環 40 次，接著 72
℃、10 分鐘，10℃、10 分鐘即完成反應。PCR 反應後，進行電泳分析，確定 PCR 增幅產物。
3.PCR 產物電泳分析
使用水平電泳槽系統，電源供應系統與製膠模為 Mupid○R-2plus。秤取 2.1 g agarose(Amresco○R)，加入 140 mL 1X TAE buffer，微波加熱至完全溶解，並於室 溫冷卻數分鐘後，倒入製膠盤中，插入齒梳，待凝固後取出齒梳，將膠體取出置 於電泳槽中，加入 1X TAE buffer 至淹滿膠體，分別 Loading 樣品與 marker 至 well 中(樣品含 80 μL PCR 產物、12 μL DNA-Dye-NonTox 染劑；marker 包含 80 μL 100bp DNA Ladder Green、12 μL 染劑)，以 400 A, 100 V 進行電泳 25 分鐘後，
將膠片以 UV 燈照射，觀察並記錄之。
4.純化 DNA
將膠體上之 DNA 條帶(Band)切下置於微量離心管，每 100 mg 樣品加入 100 μL binding Buffer，置於 60℃水浴槽加熱至膠體完全融解且每 3 分鐘搖晃一次，
將樣品加入含 spin column 之 collection tube，極速(13,200 rpm)離心 1 分鐘，去除 collection tube 中之液體，再加入 500 μL binding Buffer 極速離心 1 分鐘，去除 collection tube 中廢液，加 700 μL Washing Buffer 至 spin column 極速離心 1 分鐘，
去除 collection tube 中廢液，再次加入 700 μL washing buffer 極速離心 1 分鐘，去 除 collection tube 中廢液，極速離心 3 分鐘，去除 collection tube 中廢液，丟棄 collection tube，將 spin column 放入微量離心管，於 45℃熱水浴 5 分鐘去除酒精，
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於室溫加入 30 μL elution buffer 靜置 2 分鐘，極速離心 1 分鐘，置於冰上保存準 備送定序。
5.基因片段之定序
純化之產物委託波仕特生物科技股份有限公司進行定序，取回之序列經校正 後，於美國 NCBI (National Center for Biotechnology Information)網站上，以 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)功能鑑定本研究使用之分離株分類地位。
六、 溫度對芽枯病菌生長速度之影響
為了解芽枯病菌於不同溫度下生長之情況，選取經病原性測試得知具有病原 性之菌株培養於 PDA 洋菜培養基，於 25℃十二小時光週定溫生長箱培養五天後，
以消毒過之直徑 35 mm 打孔器切取菌絲塊，反貼接入 PDA 洋菜培養基之中央，
分別置於 15、20、25、30、35℃之十二小時光週梯度定溫生長箱中，觀察溫度對 於菌絲生長速度之影響，每處理各 5 重複，並於五日後觀察。
七、 北部地區茶赤葉枯病及芽枯病流行病學調查 (一)調查地點及品種
自 2013 年 12 月至 2014 年 6 月，每月於北部三個地區對各品種之茶樹進行 茶赤葉枯病或芽枯病危害嚴重度之調查：
1. 桃園縣楊梅區行政院農業委員會茶葉改良場(桃園縣楊梅市埔心中興路 324 號)：品種有青心烏龍、臺茶十二號、鐵觀音、四季春等。
2. 新北市坪林區陳陸合茶農(新北市坪林區漁光里大舌湖 11-2 號)：品種為青心 烏龍、臺茶十二號。
3. 新北市坪林區林金定茶農(新北市坪林區大粗坑茶區)：品種為青心烏龍。
4. 臺北市文山區高振盛茶農(臺北市文山區指南路三段 34 巷 21 號)：品種為鐵 觀音、四季春。
(二)調查方法
1.茶赤葉枯病葉片危害嚴重度
每地點調查五排茶樹，每排調查三單位，每單位定為 20×20 cm2，於每單位 中隨機挑選 10 片成葉觀察茶赤葉枯病危害並依照葉片罹病級數(見表 1)進行記 錄，並計算各地點、各品種之危害嚴重度。
表 1 茶赤葉枯病葉片罹病級數標準。
Table 1. The disease index of tea brown blight used in this study.
葉片未受害則罹病級數定為 0 級
葉片受害面積<1 cm2 罹病級數定為 1 級 葉片受害面積≥1 cm2 罹病級數定為 2 級 葉片受害面積≥4 cm2 罹病級數定為 3 級
危害嚴重度(%)=(Σ(罹病級數×葉片數)/(3×調查總葉數))×100%
2.芽枯病罹病率
只用於坪林之茶園，因有芽枯病徵故增加此項調查，於前述調查單位(20×20 cm2)中，調查有病斑之嫩芽及健康嫩芽數，計算嫩芽之芽枯病罹病率。
芽枯病罹病率(%)=(罹病芽數/調查總嫩芽數)×100%
(三)氣象資料取得
係自國家實驗研究院台灣颱風洪水研究中心，由大氣研究資料庫取得坪林區 (中央氣象局自動測站，站碼：C0A530，站名：坪林，121°42' 05〞E，24°56' 23〞
N，標高 300M)、文山區(中央氣象局自動測站，站碼：C0AC80，站名：文山，
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121°34' 03.1〞E，25°00' 14.7〞N，標高 40M )之氣象資料，另自茶葉改良場取得 楊梅(農業氣象觀測站，站碼：82C16，站名：茶葉改良場，121°12' E，25°45' N，標高 195M)之氣象資料。
八、 芽枯病之非農藥防治 (一)防治資材取得
從一般市場購買蒜、薑，另自中藥店(安生藥局，臺北市中正區南昌路二段 191 號)購買藿香、丁香、五味子、薑黃、肉桂粉等總共七種防治資材。首先將防 治資材經去皮或泡軟等前處理後以 RO 水清洗，各取 100 g 加入 500 mL 水或 50%
(w/v)乙醇 500 mL 中(表 2)，先將萃取液以 3000 rpm 離心 15 分鐘後，再將上清 液以孔徑 0.22μL 之濾紙過濾後倒入無菌玻璃瓶內密封，置於陰涼處三天，每天 搖盪一次，三天後儲存於 4 ℃備用(謝等，2005)。此些即為 20%萃取液。
另取百泰公司商業化之產品台灣寶：枯草桿菌(Bacillus subtilis)與本實驗室分 離自花蓮玉里之水稻田之放線菌(Streptomyces sp.)編號 YU01，作為拮抗微生物進 行試驗。
表 2 本研究用以製備萃取液之植物種類及其處理方法。
Table 2. The plant material used for non-pesticide control test against the anthracnose pathogen in this study and their pretreatment and extract method.
普通名
Common name(Chinese)
學名 Scientific name
科別 Extraction method
Garlic(蒜) Allium sativum L. Alliaceae(蔥科) 鱗莖 剝皮，清洗後切丁 以果汁機打碎 Cinnamon (肉桂) Cinnamomum cassia Nees Lauraceae(樟科) 乾燥樹皮 取得已是肉桂粉 加入水中混合均勻 Cablin Potchouli Herb
(藿香)
Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O. Ktze.
Chinese magnoliavine fruit (五味子)
Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.
Magnoliaceae (木蘭科)
乾燥果實 以均質機磨碎 加入水中混合均勻
Clove (丁香) Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry
Myrtaceae (桃金娘科)
乾燥花蕾 以均質機磨碎 加入水中混合均勻
Turmeric(薑黃) Curcuma longa L. Zingiberaceae(薑科) 乾燥根莖 以均質機磨碎 加入水中混合均勻 Ginger(薑) Zingiber officinale Roscoe. Zingiberaceae(薑科) 根莖 剝皮，清洗後切丁 以果汁機打碎
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(二)植物萃取液對孢子發芽抑制之試驗
為測定植物萃取液對芽枯病菌之孢子發芽抑制效果，取於 PDA 培養 10 天之 赤葉枯病菌分離株，每皿加入 5 mL 無菌水，以消毒過之三角玻棒將孢子洗下，
將孢子懸浮液濃度調為 1x105 conidia/mL，即取 30 μL 孢子懸浮液與 36 μL 之植 物萃取液混合，使植物萃取液最終濃度為 1%, 0.2%, 0.1%，並各添加 6 μL 之 1%
無菌葡萄糖水以促進孢子之發芽，共 72 μL 置於懸滴載玻片上，另以無菌水、酒 精(0.125%, 0.25%, 1.25%)、免賴得 1,500 倍(依照植物保護手冊推薦濃度)做為對 照組，共為十三種處理，每處理 6 重複，皆放置於 25℃全天光照定溫箱下 24 小 時後，即取出玻片以光學顯微鏡觀察孢子發芽之情形，並以發芽管長度超過孢子 長度判定為發芽，每一處理之重複皆計數 100 個孢子，以求其發芽抑制率(謝等，
2005)。
孢子發芽抑制率(%)= ((對照組發芽率-實驗組發芽率)/對照組發芽率)×100%
(三)植物萃取液對菌絲生長抑制之試驗
為測定植物萃取液對芽枯病菌之菌絲生長抑制效果，配製 PDA 於三角燒瓶 中每瓶 120 mL，在高溫高壓滅菌後尚未凝固前約 60℃即先加入植物萃取液，使 萃取液最終濃度為 1%, 0.2%, 0.1%，混淆均勻後立即倒入 9 cm 培養皿中做為萃 取液培養基，另以無菌水、酒精(0.125%, 0.25%, 1.25%)、免賴得 1,500 倍(依照植 物保護手冊推薦濃度)做為對照組。試驗時先以 PDA 培養菌株 10 天後，即以消 毒過之打孔器打出直徑 3.5 mm 圓形菌絲塊，立即移置萃取液培養基中央，於十 二小時光週 25℃定溫生長箱培養，五天後觀察並記錄菌絲生長直徑，每處理作
為測定植物萃取液對芽枯病菌之菌絲生長抑制效果，配製 PDA 於三角燒瓶 中每瓶 120 mL，在高溫高壓滅菌後尚未凝固前約 60℃即先加入植物萃取液，使 萃取液最終濃度為 1%, 0.2%, 0.1%，混淆均勻後立即倒入 9 cm 培養皿中做為萃 取液培養基，另以無菌水、酒精(0.125%, 0.25%, 1.25%)、免賴得 1,500 倍(依照植 物保護手冊推薦濃度)做為對照組。試驗時先以 PDA 培養菌株 10 天後，即以消 毒過之打孔器打出直徑 3.5 mm 圓形菌絲塊，立即移置萃取液培養基中央，於十 二小時光週 25℃定溫生長箱培養，五天後觀察並記錄菌絲生長直徑，每處理作