茶樹赤葉枯病之流行病學及非農藥防治

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國立臺灣大學生物資源暨農學院植物醫學碩士學位學程

碩士論文

Master Program for Plant Medicine College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

茶樹赤葉枯病之流行病學及非農藥防治

Epidemiological study and non-pesticide control of tea brown blight disease

蔡志千

Tsai, Chih-Chien 指導教授：孫岩章博士 Advisor: En-Jang Sun, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

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誌謝

首先感謝口試委員楊宏仁分所長、郭章信教授、洪挺軒教授讓我可以通過此次的考試也指我許多論文需要注意的細節，還有最重要的孫岩章老師讓我對於植物醫學有更深的認識，也教導我許多從論文寫作到實驗的技巧等，也要感謝學長姐們友倫、筱娟、勝志、及昉、奕德、玉瑤、品叡、桓瑜、明毅、柏寬給與諸多幫助，

也感謝學弟妹們鈺平、僑莉、佩琳、嘉玲、立雯、韋辰、彥安時常幫我做東做西，

也感謝我的好夥伴政融給予很多建議。也感謝許多系上老師給予協助與建議，還有好同學們佳燕、秉峰、羽萱、庭禕、又嘉，給予許多支持。

在論文寫作與實驗上，多靠茶改場的秀蕊與思頴學姊給予非常多的幫助，也感謝茶改場邱垂豐課長與許多人的幫助，以及坪林陳陸合師兄、林金定先生以及貓空高振盛先生提供研究用場地，以及颱洪中心大氣資料庫提供氣候相關資料。

也要感謝我偉大的家人們提供我許多的資料，還帶著我上山下海順利完成論文，最後要感謝自己，秉持著信念走到最後，才得以完成這份論文。

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中文摘要

茶樹 Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 為多年生常綠灌木至小喬木植物，經加 工成為嗜好性飲料，因其清香深受國人喜愛而有大量之種植。茶樹病害甚多，其 中以炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)所造成之茶赤葉枯病最為常見。本研 究為調查茶赤葉枯病之流行及所造成之危害並研究防治之道，於北部坪林、文山、楊梅三地區進行病害嚴重度之監測，又因於坪林地區發現到有新芽焦枯之芽 枯病產生，經組織塊分離法可得到炭疽病菌(Colletotrichum spp.)與擬盤多毛孢菌 (Pestalotiopsis spp.)兩種病原真菌，經柯霍氏準則接種嫩芽確認芽枯病主要由茶赤 葉枯病病原菌所造成，而經分生技術鑑定為茶赤葉枯病病原(C. gloeosporioides)。

芽枯病於坪林冬天可造成20~50%之新芽焦枯，造成冬茶產量下降甚至無法採收。

該病菌在不同溫度下培養發現於25℃菌絲生長最佳，於15℃下生長較差，在35℃

下則無法生長。而依據2013年12月至2014年6月流行病學研究調查顯示，該病害於坪林地區月均溫較低、月平均相對溼度較低及月平均風速較大時易發病，且與坪林地區之赤葉枯病有中度至高度正相關，說明赤葉枯病於葉片產生之孢子，可經風雨飛濺至嫩芽。而茶赤葉枯病則是於月平均風速較大時，較易發病，且青心烏龍比台茶十二號、四季春及鐵觀音皆較感病。由於近年非農藥防治逐漸為大眾所青睞，也免除農藥殘留之疑慮，因此選用植物萃取液及拮抗微生物來進行防治試驗。經選用大蒜、薑、薑黃、肉桂、丁香、五味子及藿香等七種植物萃取液進行菌絲生長抑制與孢子發芽抑制試驗，發現酒精萃取之丁香、肉桂及藿香皆具有抑菌效果，然只有薑黃之酒精萃取液及蒜之酒精萃取液(0.2%)於盆栽防治試驗中具抑制芽枯病之效果，其抑制率僅25%。經拮抗菌對峙試驗顯示商品化之枯草桿 菌(Bacillus subtilis)與鏈黴菌(Streptomyces sp.)YU01均有抑菌效果，但於盆栽試驗 中發現鏈黴菌 YU01於接種前一天施用有83%之抑制率，枯草桿菌則無。而於農

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藥對芽枯病菌絲生長抑制試驗證實測試之13種藥劑中免賴得、嘉賜貝芬可有效防治此病原菌。而根據接種試驗結果，發現芽枯病菌除青心烏龍外對四季春、臺茶十二號及大葉烏龍等品種皆有病原性，而以芒果炭疽病、草莓炭疽病、咖啡炭疽病等病原菌接種茶樹嫩芽，皆不會造成芽枯。本研究於田間調查、病原性測試結果皆證明茶赤葉枯病單獨感染嫩芽可造成芽枯病，但為何此病徵只於坪林地區發生仍有待進一步之研究。

關鍵字：茶赤葉枯病、炭疽病、非農藥防治、芽枯病

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Summary

Tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) is a kind of evergreen perennial shrub or small tree, can be processed to the most widely consumed beverage in the world. Due to its fragrant flavor, tea has been massively grown in Taiwan. Tea can be affected by many diseases, among them the tea brown blight disease (Colletotrichum gloeosporioides) is the most common fungus disease in the field. To investigate the severity of tea brown blight disease, and to control it, this study monitored the disease severity of tea brown blight at Pinglin, Wenshan and Yangmei areas. As a new sprout wilt disease was found at Pinglin, New Taipei, tissue isolation methods were conducted to obtain the suspect pathogen. Results showed that both Colletotrichum and Pestalotiopsis can be isolated from the wilting sprout. Through the rules of Koch’s postulates and molecular identification, we confirmed that the sprout wilt is mainly caused by C. gloeosporioides.

Sprout wilt disease can cause 20 to 50 percent of yield loss in Pinglin, resulting in severe economic impact on winter tea in Pinglin area. Culturing this pathogen at different temperatures showed that this pathogen grows best at 25℃ and slower at 15℃, but cannot grow at 35℃. Basing on epidemiological study from December 2013 to June 2014, this disease prefer the low temperature, low humidity and high wind speed. The relationship between sprout wilt and tea brown blight disease is generally positively correlated, indicating that the spores from tea leaves with brown blight disease can splash to sprout by wind and rain and cause the disease. On the other hand, brown blight disease occurred more severe in season of high speed wind. As compared to Ttes No.12, Shy Jih Chuen and Tieguanyin, the cultivar Chih Shih Oolong is the most sensitive to brown blight disease.

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In order to eliminate the concerns of pesticide residues, non-pesticides control of plant disease is right now a favorite by farmer. Therefore we choose seven kind of plant to prepare their extracts and two antagonistic microorganisms to test to control the sprout wilt in this study. They are ginger, turmeric, cinnamon, cloves, cablin potchouli herb and Chinese magnoliavine fruit. The test of their extracts for effect on mycelial growth and spores germination, showed that only ethanol extract of clove, cinnamon and cablin potchouli herb have some inhibition potential against the pathogen. However, only the ethanol extract of turmeric and garlic (0.2%) exhibit the inhibition rate of about 25% in pot plant test. On the other side, antagonism microorganisms Streptomyces (Streptomyces sp.) YU01 and Bacillus subtilis also have inhibition effect on this pathogen in dual culture experiment. Streptomyces YU01 even has 83% inhibition rate to control the sprout wilt disease in pot plant test, when applied one day before the inoculation. Whereas the Bacillus subtilis has no inhibition effect in pot plant test. A total of 13 fungicides were screened for their control rates on tea brown blight pathogen by mycelial growth inhibition test. Results showed that both benomyl, kasugamycin plus carbendazim, have the best potential to control the disease. In this study, we found that the sprout wilt pathogen can infect not only the Chin Shin Oolong cultivar, but also the cultivar Ttes No.12, Shy Jih Chuen and Dah Yeh Oolong. We also found that anthracnose pathogens from mango, strawberry and coffee, cannot cause the tea sprout wilt. Our study proved that the pathogen from brown blight can transmit and cause sprout wilt as shown in our field survey and pathogenicity test. However the reason of sprout wilt only occur in Pinglin area still need further studies in the future.

Key words: Brown blight disease; Colletotrichum gloeosporioides; non-pesticide control; sprout wilt.

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表目錄

表 1 茶赤葉枯病葉片罹病級數標準。 ... 20

表 2 本研究用以製備萃取液之植物種類及其處理方法。 ... 22

表 3 臺灣北部地區茶赤葉枯病及芽枯病病害調查結果。 ... 28

表 4 臺灣北部茶樹芽枯病以組織塊分離法分離病原之結果。 ... 31

表 5 臺灣北部茶樹芽枯病以稀釋分離法分離病原之結果。 ... 31

表 6 臺灣北部茶樹芽枯病分離所得真菌分離株之編號及其來源。 ... 32

表 7 臺灣北部茶樹赤葉枯病斑以組織塊分離法分離病原之結果。 ... 35

表 8 臺灣北部茶樹赤葉枯病斑分離所得真菌分離株之編號及其來源。 ... 36

表 9 臺灣北部茶赤葉枯病分離所得分離株以針刺接種青心烏龍後之發病結果。 ... 38

表 10 臺灣北部茶樹芽枯病分離所得分離株以針刺接種青心烏龍後之發病結果。 ... 39

表 11 人工接種以稀釋分離法分離芽枯病之結果。 ... 43

表 12 臺灣北部茶赤葉枯病分離株 BC-5 以引子對 ITS1/ITS4 經 PCR 增幅所得之 DNA 序列至 NCBI 網站基因庫比對之結果。 ... 46

表 13 茶赤葉枯病菌株 BC-5 在不同溫度下以 PDA 培養 5 天之菌絲長度。 ... 50

表 14 2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區茶赤葉枯病危害嚴重度與當地氣象資料之相關分析。 ... 52

表 15 2013 年 12 月至 2014 年 5 月楊梅地區茶赤葉枯病危害嚴重度與當地氣象資料之相關分析。 ... 54

表 16 2013 年 12 月至 2014 年 6 月文山地區茶赤葉枯病危害嚴重度與當地氣象資料之相關分析。 ... 54 表 17 2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區芽枯病罹病率與茶赤葉枯病危害嚴

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重度之相關分析。 ... 55

表 18 2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林區芽枯病罹病率與氣象資料之相關分析。 ... 56

表 19 不同植物萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 孢子發芽率之影響。 . 59 表 20 七種植物之萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 之孢子發芽抑制率。 . ... 60

表 21 不同植物萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 菌絲生長之影響。 ... 62

表 22 七種植物萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 之菌絲生長抑制率。 . 64 表 23 五種植物萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 在盆栽防治試驗之結果。 ... 66

表 24 不同拮抗微生物對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 在盆栽防治試驗之結果。 ... 70

表 25 共十三種藥劑對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 菌絲生長之影響。 ... 72

表 26 共十三種藥劑對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 之菌絲生長抑制率。 ... 73

表 27 四種不同炭疽病菌接種於茶樹造成芽枯之發病率。 ... 75

表 28 茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 接種於不同品種茶樹之發病率。 ... 75

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圖目錄

圖 1、茶樹嫩芽以孢子懸浮液接種後保溼處理之狀況。 ... 16

圖 2、新北市坪林區有機茶園青心烏龍芽枯病之萎凋病徵。 ... 28

圖 3、新北市坪林區有機茶園青心烏龍赤葉枯病之炭疽病徵。 ... 29

圖 4、桃園縣楊梅區茶園青心烏龍赤葉枯病之炭疽病徵。 ... 29

圖 5、臺灣北部茶芽枯病分離所得之擬盤多毛孢菌分離株之分生孢子形態。 .... 33

圖 6、臺灣北部茶芽枯病分離所得之炭疽病菌分離株之分生孢子形態。 ... 33

圖 7、臺大中非大樓頂樓溫室中健康茶苗之栽種情形。 ... 37

圖 8、茶樹赤葉枯病菌分離株 BC-5 以針刺接種青心烏龍嫩芽 5 天後之發病情形。 ... 40

圖 9、臺灣北部茶芽枯病分離株 BC-X 以針刺接種青心烏龍 8 天後之發病情形。 ... 41

圖 10、臺灣北部茶赤葉枯病分離株以孢子懸浮液進行傷口接種後於葉片出現之病徵。 ... 42

圖 11、臺灣北部茶赤葉枯病分離株 BC-5 以引子對 ITS1/ITS4 進行 PCR 增幅分所得之 DNA 片段電泳圖譜。 ... 44

圖 12、臺灣北部茶赤葉枯病分離株 BC-5 以引子對 ITS1/ITS4 進行 PCR 增幅後所得之 DNA 序列。 ... 45

圖 13、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 於葉上產生分生孢子盤(A)，及其分生孢子形態(B)。 ... 47

圖 14、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 分生孢子之發芽形態。 ... 48

圖 15、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 於載玻片培養基上產生之壓器。 ... 48

圖 16、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 培養於 PDA 之菌落形態。 ... 49

圖 17、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 於載玻片培養基上產生之分生孢子梗 ... 49 圖 18、茶赤葉枯病菌芽枯型菌株 BC-5 在不同溫度下以 PDA 培養五天菌絲長度

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之比較。 ... 50

圖 19、臺灣北部茶赤葉枯病於 2013 年 12 月至 2014 年 6 月病勢發展曲線。 .... 52

圖 20、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區月平均相對溼度與茶赤葉枯病危害嚴重度之相關性。 ... 53

圖 21、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區月平均風速與茶赤葉枯病危害嚴重度相關分析。 ... 53

圖 22、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區芽枯病病勢發展曲線。 ... 55

圖 23、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區芽枯病罹病率對月均溫之相關性。 ... 56

圖 24、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區芽枯病罹病率對月平均相對溼度之相關性。 ... 57

圖 25、2013 年 12 月至 2014 年 6 月坪林地區芽枯病罹病率對月平均風速之相關性。 ... 57

圖 26、酒精及農藥處理對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 孢子發芽率之影響。 ... 59

圖 27、七種植物之萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 孢子發芽率之影響。 60 圖 28、七種植物之萃取液對茶赤葉枯病菌 BC-5 之孢子發芽抑制率。 ... 61

圖 29、酒精及農藥處理對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 菌絲長度之影響。 ... 63

圖 30、七種植物之萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 菌絲長度之影響。 ... 63

圖 31、七種植物之萃取液對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 之菌絲生長抑制率。 64 圖 32、枯草桿菌及放線菌 YU01 對茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 對峙培養之菌絲生長結果。 ... 65

圖 33、大蒜酒精萃取液防治茶赤葉枯病效果。 ... 67

圖 34、薑黃酒精萃取液防治茶赤葉枯病效果。 ... 68

圖 35、使用免賴得防治芽枯型茶赤葉枯病之效果。 ... 69

圖 36、前一天施用放線菌 YU01 對茶赤葉枯病菌之防治結果。 ... 71

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圖 37、共 13 種藥劑對於茶赤葉枯病芽枯型菌株 BC-5 之菌絲生長抑制率比較。

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第一章前言

一、茶樹之簡介

茶樹 (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) 為多年生常綠灌木至小喬木植物，在植 物分類上屬於雙子葉植物綱 (Magnoliophyta) 杜鵑花目 (Ericales) 山茶科 (Theaceae) 。林奈氏於 1753 年將茶樹學名訂為 Thea sinensis L., 後又改為 Camellia sinensis L., 1823 年印度阿薩姆野生種被發現後學者再將茶樹分為印度大 葉種 (Camellia sinensis var. assamica) 及中國小葉種 (Camellia sinensis var. sinensis).

現今國際間通用的茶樹學名為 Camellia sinensis (L.) Kuntze. (阮，1995)

茶葉原產於中國、印度，約於西元 725 年傳到日本栽培，西元 828 年傳到韓國，到十六世紀時西方國家開始接觸中國茶葉，臺灣約於清朝嘉慶 15 年 (西元 1810 年) 開始種植茶樹，過去臺灣的茶業有非常輝煌的歷史，目前全年產量約一萬四千公噸，種植面積約一萬三千公頃(賴，2013)。

茶樹嫩芽可經過加工成為嗜好性飲料，因其清香深受國人喜愛，故在臺灣有大量之種植，主要分布於南投縣 (6,821 公頃)、嘉義縣 (2,189 公頃)、新北市 (1,674 公頃)、桃園縣(758 公頃)、新竹縣(535 公頃)，其他縣市如苗栗縣、雲林縣、臺中市、臺東縣、高雄市、宜蘭縣、花蓮縣、臺北市皆有生產 (賴，2013) 。

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二、茶樹之品種介紹

臺灣茶樹品種主要由大陸引入，在 20 世紀中後期才開始有本土茶樹的育種，

最初由平鎮及魚池茶葉試驗所進行，至茶葉改良場成立後再積極推展，首先於民國 58 年育成臺茶一號、二號、三號及四號等四種優良品種，至民國 103 年止經正式登記命名者共有 21 品種(邱等，2009)，目前栽培品種以青心烏龍、清新大冇、臺茶十二號、臺茶十三號、四季春為主(林和蕭，2004)，以下對本研究使用之茶樹品種加以介紹：

1. 青心烏龍(Camellia sinensis cv. Chin Shin Oolong )：於臺灣各茶區均有栽培，樹 身略小，枝葉著生多，葉色較其他品種濃綠而光澤，樹性稍弱，植於貧瘠地或新墾地成活率較低，易罹患白蟻及枝枯病，抗病蟲害能力弱，耐旱性弱，適合製造包種茶及烏龍茶。

2. 臺茶十二號(Camellia sinensis cv. Ttes No.12) 或稱“金萱”：是以硬枝紅心為父 本與臺農 8 號雜交之後裔，於西元 1981 年命名，富有茸毛，芽密度高，樹勢強產量高，採摘期長，對枝枯病有抗性，適合製作包種茶及烏龍茶，成茶帶有奶香味。

3. 四季春(Camellia sinensis cv. Shy Jih Chuen) ：屬地方品種，由木柵農民自行選 育而成，樹型中大橫張，枝葉與茶芽密生，下位枝條仍易長芽，萌芽期早，開花數多，抗病能力強，耐旱性中等，適合製作包種茶。

4. 鐵觀音(Camellia sinensis cv. Tieguanyin)：屬地方品種，主要分布於基隆市與臺 北市文山區，樹大枝肥，枝葉疏生，萌芽期短，收量少，茶芽芽色綠帶紫，抗病能力強，耐旱性中等，適合製作包種茶(李和張，2013)。

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三、茶樹之栽培管理

茶樹性喜溫暖溼潤，自南緯 45 度至北緯 38 度間均可栽培。茶樹對於溫度的適應性視品種而異，一般而言小葉種之抗寒性及抗旱性皆較大葉種為強。

茶樹最適宜生長溫度為 20℃~25℃之間，年降雨量為 1,800~3,000 公厘，且分布平均者最佳，朝晚有霧，相對溼度經常保持在 75~80%有利於茶芽發育及茶菁品質，反之長期乾旱或溼度過大則不適於茶樹經濟栽培。

茶樹喜好微酸性土壤，雖於不同種類土壤皆可生長，但以酸鹼度在 4.5~5.5 之間，透氣排水良好且富含腐植質及礦物質之砂質壤土或砂質黏土為佳，一般中性或鹼性土壤均不適於茶樹生長。

茶樹為異交作物，利用有性繁殖的後代無法保存品種原有特性，一般以無性之扦插苗或壓條法來進行繁殖，扦插時期依據臺灣氣候環境可分為 12 至 1 月、5 至 6 月、9 至 10 月等三個時期，其中以 12 月至翌年 1 月最適宜(阮，1995)。

種植時以行距 150~180 公分，株距 40~50 公分，每公頃定植 12,000~14,000 株為基準，於雨後、氣溫較低及土壤溼潤時種植較佳，應儘量避免晴天種植，若於晴天種植，應先將土壤溼潤，種植後再行澆水，使根部充分與土壤接觸。

種植後為減少葉片水分蒸發，應於植株離地面 20 公分處行水平式剪枝。為防止乾旱保護幼苗，應於幼苗兩側覆蓋稻草或其他乾草，以防止水份蒸發。茶樹在幼年期樹冠尚未鄰接時，茶行間因光照充足相當容易產生雜草，此時可以利用雜草抑制席、稻草、花生殼等資材覆蓋，減少人工除草的成本。

茶芽伸長至一芯五葉時即可採摘。臺灣地處亞熱帶氣候溫暖，全年自二月至十一月在不同茶區皆有茶芽可採摘，因採摘季節不同分為：早春茶、春茶、夏茶、六月白、秋茶、白露茶、冬茶等，但一般以一年採收四至五次為宜(賴，2005)。

茶樹為多年生常綠作物，可提供病蟲之食物和居所，且臺灣處亞熱帶氣候條件適合病蟲害發生，也因此病蟲害在茶園終年皆可發現。根據文獻記載，臺灣發生之茶樹病蟲害種類，蟲害方面有昆蟲綱 8 目 47 科 173 種及蜘蛛綱蟎蜱亞綱 4 科 6 種，

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合計 179 種；病害包括真菌 40 種，線蟲 4 種及細菌性病害 1 種，合計 45 種，常 見病害包含茶枝枯病由 Macrophoma theicola Petch 所造成；茶赤葉枯病由 Colletotrichum gloeosporioides Penz. 所造成；茶褐色圓星病由 Pseudocercospora ocellata Deigton 所造成；茶髮狀病由 Marasmius cinisequi Muller ex Kalchbrenner 所 造成；茶餅病由 Exobasidium vexas Massee 所造成；茶網餅病由 Exobasidium reticulatum Ito & Sawada 所造成；白紋羽病由 Rosellinia necatrix Prillieux 所造成；

茶輪斑病由 Pestalotiopsis theae (Sawada) Steyaer 所造成(林和蕭，2004) 。

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四、研究目的

臺大植微系植醫研究室於 2009 年秋天首先於坪林地區觀察到青心烏龍嫩芽焦黑枯萎之現象，危害嚴重造成茶農經濟上之損失，暫稱之為芽枯病(孫，2009)，後經鑑定與茶赤葉枯病相同，隨後作者發現仍常發生，故對此茶樹芽枯現象加以深入研究。

本研究首先於民國 102 年 12 月至民國 103 年 6 月進行為期半年之茶園赤葉枯病或芽枯病危害嚴重度之調查，期望能對於茶赤葉枯病或芽枯病有更深層的了解，

此即為流行病學之研究。在此期間再度於坪林地區發現嫩芽受到危害之現象，此病對於坪林之茶產業帶來嚴重之損害，故即進一步加以深入研究，並鑒於有機農業之需求以及農藥所帶來之負面影響，故亦嘗試以非農藥進行防治之試驗，期能有效解決此一嚴重問題，以增加茶農之產量及收益。

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第二章前人研究

一、炭疽病菌

炭疽病菌(Colletotrichum spp.)最早於 1790 年由 Tode 記錄歸類於 Vermicularia 屬，其後 Corda 於 1831 年命名，屬於真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、小叢殼目(Glomerellales)、小叢殼科(Glomerellaceae)炭疽 病菌屬(Glomerella) (Réblová et al., 2011)，可為植物內生菌、寄生菌、腐生菌或植 物病原菌(Hyde et al., 2009b)。在臺灣有記錄炭疽病菌共 72 種，寄主植物種類 200 餘種(中華民國植物病理學會，2002)，炭疽病菌寄主繁多，根據記錄全世界擁有至少 470 種寄主(Sutton, 1980)，且普遍流行於熱帶地區，但在亞熱帶與溫帶也常出現，炭疽病菌以潛伏感染造成採果後之傷害而聞名(Prusky, 1992)，其中於世界 各地危害廣泛之 C. gloeosporioides 及 C. acutatum，因形態特徵重疊，形成甚多 隱蔽種(Cryptic species)，故兩者被認為皆屬為複合種(Species complex)(胡，2013)。

炭疽病菌因形態學混淆，缺少可供區辨之形態特徵，加上寄主範圍與病原性變化大、培養易產生變異等諸多因素，導致分類相當複雜，早期是以寄主植物之 屬名作為炭疽病菌之種名，如山葡萄(Ampelopsis heterophylla)炭疽病學名為 C.

ampelopsidis(中華民國植物病理學會，2002)。於 1957 年首由 von Arx 將 668 個 名稱之炭疽病菌歸類至 11 個種(von Arx, 1957)，至 1992 年則由 Sutton 將之分類至 39 個種(Sutton, 1980)，至 2009 年再由 Hyde 等人整理發表炭疽病菌物種總共 66 種，加上 19 種尚須確認之物種(Hyde et al., 2009a)。唯現今常用之分類則為 2012 年由 Cannon 等人所提出，係依照親源分析結果將炭疽病菌歸類為九大群 (Clade)，共 119 個炭疽病菌物種(Cannon et al., 2012)。

炭疽病菌在自然界中可能透過種子傳播、於土中或寄主中殘存並以分生孢子由風雨飛濺傳播，或以子囊孢子靠風傳播，當孢子落於適當寄主時，即會發芽產 生壓器(Appressorium)，進而侵入植物組織，擴展後逐漸產生病徵(Cannon et al., 2012)。

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二、茶赤葉枯病

茶赤葉枯病最早於 1899 年於錫蘭發現，在 1982 年則被報導會侵染茶樹造成葉片褐化與枝條枯萎，並自紐西蘭傳至英國(Dickens & Cook, 1989)。此病係由 Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.所造成，為臺灣重要茶樹病害 之一，它可同時危害茶樹葉片及嫩芽，造成茶葉產量降低。

其病原菌有性世代為 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Schrenk，而 目前定義之 Colletotrichum gloeosporioides 是炭疽病菌的集群(Clade)之一，鑑定 上主要以 ITS gene tree 來將炭疽病菌歸類至 C. gloeosporioides 之中(Cannon et al., 2012)。

本病在葉片感染初期會產生黃綠色小點病徵，擴大後顏色加深呈赤褐色，上有灰黑色小點，病斑後期則為灰色。本病在在嫩葉上之病斑多呈褐色小點斑，在嫩枝條上，可造成枝條變黑，容易折斷(曾，2004)。

茶赤葉枯病係以分生孢子為主要傳染源，多隨雨露及灌溉水行飛濺傳播，風雨可擴大其傳播距離，各品種間抗病性之差異極大，不同植株個體之生長狀況亦可影響其發病程度(曾和陳，1984)。

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三、非農藥防治

由於我國地處亞熱帶，氣候高溫多溼，適合多種病害發生與傳播，農民也多以化學農藥來防治病害，然而農藥之使用雖經濟便利但對於環境也有諸多負面影響。如(1)農藥殘毒：有礙消費者之健康。(2)藥害：使用不當或用量過多造成植物傷害。(3)抗藥性：經常使用農藥，使病原產生抗藥性，導致藥效不彰。(4)危害非目標生物：對於土壤內有益微生物或微小動物造成傷害。(5)環境污染：許多農藥於自然界分解較慢，可能造成水源或土壤污染。因此近年來政府極力提倡有機農業與永續農業(林等 2004)。

非化學防治之方法如使用得當，不但減少農藥使用，對病害防治亦可達事半功倍之效。現今常用之非化學防治策略包含：健康種苗、抗病育種、誘導性抗病、

拮抗微生物、非農藥殺菌物質、植物營養液、土壤添加物、栽培管理、物理防治法等(林等 2004)。

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四、植物萃取液防治法

非農藥殺菌物質為具有抑制病原菌之生物性或天然化學物質，近年來因有機農業之興起而逐漸受到重視，在自然界有許多天然植物或中草藥，富含許多特殊的抑菌物質如葡萄糖苷(Glucosides)、生物鹼(Alkaloids)、類萜(Terpenoids)、酚類 (Phenols)、鞣質或單寧(Tannins)、類黃酮(Flavonoids)、皂素(Saponins)、類胡蘿蔔素(Carotenoids)、香豆素(Coumarin)等(謝等，2005)，可用於抑制植物病原菌或促進植物產生抗病機制，因此將之以萃取之方式製成植物萃取液來使用。

1993 年德國 BASF 曾發表大虎杖(Reynoutria sachalinensis)的酒精萃取物對 防治觀賞作物白粉病及灰黴病有良好之防治效果，且於美國登錄為植物抽出物殺菌劑，商品名為 Milsana^® (吳，2012)。該抽出液的防病原理為誘導植物體產生系統性抗病性。植物萃取液大多用於防治植物葉部病害，其滅菌效果可與化學合成農藥相當，而與農藥相比對環境較為友善，故已廣泛引起植醫及環保人士重視(林等，2004)。

而用於炭疽病上有效植物萃取物被研究者頗多，例如大風子(Hydnocarpus castaneus H.F. &Th.)、及山韭菜(Allium thumbergii G. Don)之水萃液與乙醇萃取液 被認為對於小白菜炭疽病(C. higginsianum)之孢子發芽抑制率可達 100%(謝等，

2005)。痲瘋樹(Jatropha curcas)、餘甘子(Emblica officinalis)及萬桃花水茄(Solanum torvum)使用磷酸緩衝液(sodium phosphate buffer)萃取，發現可抑制香蕉炭疽病(C.

musae)之菌絲生長(Thangavelu et al., 2004)。於中國之研究則顯示芒果炭疽病(C.

gloeosporioides) 可使用肉桂 (Cinnamomum zeylanicum (L.)) 、丁香 (Syzygium aromaticum (L.) Merr et L.M.Perry)及霍香(Agastache rugosa (Fisch. & C. A. Mey.) O. Ktze.)之丙酮萃取液抑制菌絲之生長(He et al., 2009)。而在斯里蘭卡則有研究 顯示肉桂與丁香油可防治香蕉炭疽病菌 (C. musae)菌絲之生長(Ranasinghe et al., 2002)。另丁香油也被發表可用於抑制十字花科蔬菜炭疽病菌 (C. higginsianum)，

當施用濃度為 1000 ppm 時，可降低 50%的罹病度(林等，2010)。又在印度的一 篇論文研究中顯示使用大蒜(Allium sativum L.)、薑(Zingiber officinale Rosc.)、薑

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黃(Curcuma longa L.) 、歐洲鱗毛蕨(Dryopteris filix-max (L.) Schott)及洋金花 (Datura metel L.)之水或乙醇萃取液對於茶樹之四種真菌病原(Pestalotiopsis theae (Sawada) Steyaert, Colletotrichum camelliae Mass, Curvularia eragrostidis (P.

Hennings) Mayer, Botryodiplodia theobromae Patouiilard)等皆具有抑制其孢子發芽 之能力(Saha et al., 2005)。

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五、拮抗微生物防治法

拮抗微生物屬於生物防治方法之一種，其病害防治之機制可約略分為五種：

(1)產生抗生素，直接殺死病原菌；(2)營養競爭，直接或間接使病原菌缺乏營養；

(3)微寄生或捕食，以殺害病原菌；(4)產生細胞壁分解酵素；及(5)誘導植物產生抗病性，藉以抑制病原菌(林等，2004)。拮抗微生物除了不會有農藥殘留問題之外，也可於田間形成族群，達到長期防治之效果。

枯草桿菌 (Bacillus subtilis) 屬為革蘭氏陽性菌，分類上屬於厚壁菌門 (Firmicutes)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌科(Bacillales)，屬於植物根圈之有益微生物(Plant rhizobacteria / PR)，除能促進植物生長外，也可保護植物免受真菌之侵染。然其作用機制尚未完全清楚，但已知會產生多種抗菌物質，如多種脂肽類 (Lipopeptides)，其中如表面素(Surfactin)為一種強力的生物表面活性劑(Bais et al., 2004)。

而已被商品化之枯草桿菌(Bacillus subtilis Y1336)，已知具有防治豌豆白粉病 (Erysiphe pisi DC.)、胡瓜露菌病(Pseudoperonospora cubensis (Berkeley et Curtis) Rostovzev.) 、蓮霧果腐病 (Pestalotiopsis euginae) 及芒果蒂腐病 (Botryodiplodia

theobromae Pat.)之功效，在臺灣之商品名為台灣寶^®，且於網站(百泰生物科技，

2011)敘明其擁有 Glomerella cingulata 之防治效果。目前枯草桿菌之生物製劑則 已於全世界被廣泛使用中。

另一方面放線菌亦被認為具有抑菌效果，其中之鏈黴菌(Streptomyces spp.)即 常被用於生物防治。據研究指出鏈黴菌與 Alternaria sp., Curvularia sp., Phytophthora capsici, Colletotrichum sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., Aspergillus niger 等進行對峙培養，發現約有 47~90%之抑制效果(Evangelista-Martinez, 2014)。

鏈黴菌屬於放線菌門 (Actinobacteria) 、放線菌綱 (Actinobacteria) 、放線菌目 (Actinomycetales)、鏈黴菌科(Streptomycetaceae)。鏈黴菌會產生許多二次代謝物，

包括許多用於臨床的抗生素如新黴素(Neomycin)和氯黴素(Chloramphenicol)等，

可抑制病原菌之生長(Kieser et al., 2000)。

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本研究使用之鏈黴菌 YU01 係自花蓮玉里之水稻田篩選而出，而根據前人研 究證實該菌具有抑制多種植物病原真菌之效果，包括鏈隔孢菌(Alternaria sp.) 、 灰黴病菌 (Botrytis sp.)、炭疽病菌 (Colletotrichum sp.) 、鐮孢菌 (Fusarium sp.) 、 疫病菌 (Phytophthora sp.) 、腐霉菌 (Pythium sp.) 、立枯絲核菌 (Rhizoctonia sp.) 、 菌核病菌 (Sclerotinia sp.) 、白絹病菌 (Sclerotium sp.) 等九種病原真菌 (張，

2012)。

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六、流行病學

流行病學(Epidemiology)是研究病害在空間與時間如何變化的學問，狹義的流行病是指短時間快速或大量發生之病害，而廣義來說病害之演替以及病害在不同時間與空間之改變皆稱為流行病，研究過去之病程記錄除了可預測未來病勢發展之外也可用於防治，且許多植物病害一經感染便無法治療更凸顯預防之重要性 (Jeager, 2000)。

一個病害會受到病原菌、寄主、環境與時間之影響，影響病害的環境因子中又以溫度與溼度最為重要，由於病害嚴重程度會隨時間而改變，一般以病害嚴重度隨時間變化作圖是為病勢發展曲線(Disease progress curve)，並與氣象因子進行相關與迴歸分析，以求得病害預測方程式來預測病害(Milgroom & Peever, 2003)。

而根據前人對炭疽病菌之研究，在低溫尤其是溼度較高時容易使孢子散播與 入侵，也造成病害為害較嚴重，如 C. gloeosporioides 造成柑橘落果，即在 1 至 3 月發病較嚴重(Denham & Waller, 1981)，而 C. gloeosporioides 造成咖啡炭疽與破 葉也是在 9 至 11 月發病較嚴重(Mohanan, et al., 1989)，其推論是因夏季溫度較高，下雨後水分蒸發速度較快，較不利於孢子之入侵，而冬天則因可用自由水較多，較適宜孢子之入侵。

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第三章材料與方法

一、臺灣北部茶樹赤葉枯病及芽枯病之田間調查

本研究為深入研究 2013 年秋季起在坪林茶園發現之茶樹芽枯之病因，乃於 2013 年 11 月開始有系統地至臺灣北部茶園調查茶樹芽枯之發生情形。由於初步認定該病為赤葉枯病菌所造成，故一併調查典型赤葉枯病之發生情形。地點包括桃園縣楊梅市茶葉改良場之茶園、新北市坪林區陳陸合先生之茶園、新北市坪林區林金定先生之茶園及臺北市文山區高振盛先生之茶園，除了調查上述二病徵之發病情形，並將發病嫩芽及葉片帶回實驗室進行拍照、鏡檢及分離。

二、茶赤葉枯病及芽枯病之病原菌分離、保存及鑑定 (一)嫩芽芽枯之病原菌分離

本項嫩芽芽枯之病原菌分離，係使用組織塊分離法及稀釋分離法。組織塊分離法係自發病茶園採集罹病芽，以消毒過之解剖刀切下約 5 mm 長之病健部，浸泡於 2%次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒 10 秒後，以無菌水漂洗三次，每次 10 秒，將多餘水分吸乾後置於 1.5 %(w/v)水瓊脂培養基 (Water agar, WA, Difco^TM)中進行常溫培養，待長出菌絲後，於解剖顯微鏡下，以解剖刀切取菌絲尖端，移至馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基 (Potato Dextrose Agar Medium, PDA, Difco^TM) 上，置於十二小時光週 25℃ 定溫生長箱中進行培養，以供後續之鑑定及試驗。

稀釋分離法係先將嫩芽發病組織以消毒過之解剖刀切下病健部，浸泡於 2%

次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒 10 秒後，以無菌水每次 10 秒共漂洗三次，將多餘水分吸乾後，即移入含有 1 mL 無菌水之微量離心管中，使用消毒過之研磨棒磨碎組織塊，靜置約 30 分鐘後即吸取 0.3 mL 病組織液滴於 PDA 洋菜培養基上，再以消毒過之三角玻棒將病組織液均勻塗佈於培養基表面，置於十二小時光週 25℃定溫生長箱中進行培養，4 天後觀察分離結果。因在同一培養皿中可能會長出多種可疑病原，故依菌絲或菌落不同，分別挑取移至 PDA 洋菜培養基中培

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養，之後細菌類皆以畫線平板法得到單菌落，移至 PDA 洋菜上培養，得到純化分離株。所得到之純種分離株皆培養於 PDA 洋菜培養基上以供後續之鑑定及試驗(葉，2012)。

為保存菌株，每月會進行繼代培養，確認為同分離株後培養於十二小時光週 25℃定溫生長箱中，並且將確認有病原性之分離株寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源及保存研究中心(BCRC)，以供後續試驗使用。

(二)赤葉枯病之病原菌分離

本項為分離赤葉枯病菌，亦使用組織塊分離法，係自田間採取病葉，以消毒過之解剖刀切下約 5 × 5 mm /mm 病健部，浸泡於 2%次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒 10 秒後，以無菌水漂洗三次，每次 10 秒，將多餘水分吸乾後置於 1.5 % WA 中進行常溫培養，待長出菌絲後，於解剖顯微鏡下，以解剖刀切取菌絲尖端移至 PDA 洋菜培養基上，置於十二小時光週 25℃定溫生長箱中進行培養，以供後續之鑑定及試驗。

三、茶赤葉枯病及芽枯病分離株之病原性測試 (一)供試健康茶樹之栽種

健康茶苗係自南投縣購入種植一年之青心烏龍茶苗(Camellia sinensis cv.

Chin Shin Oolong )、大葉烏龍(Camellia sinensis cv. Dah Yeh Oolong)、臺茶十二號 (Camellia sinensis cv. Ttes No.12)及四季春(Camellia sinensis cv. Shy Jih Chuen)等，

皆將茶苗種於紅土、蛭石、珍珠石(按 2：1：1 體積比混合)的 5 吋盆中，置於遮雨棚培育至少 1 週後，供作本研究試驗用。

(二)茶樹嫩芽以孢子懸浮液針刺接種試驗

本項為確認分離株之病原性，以青心烏龍作為供試植株，先將酒精噴在擦手紙上，用以去除嫩芽之髒污，再以清水噴在擦手紙上，以去除嫩芽上之酒精共兩

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次，即以消毒過之直徑 1 mm 解剖針穿過嫩芽造成傷口，並將事先配製濃度為 1x10⁵之孢子懸浮液噴灑於嫩芽。另以蒸餾水噴灑有相同傷口之嫩芽作為對照組，

每組實驗皆進行 3 重複，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該嫩芽保溼並置於溫室，觀察並記錄其是否發病，如發病則進行再分離以確認其病原性。

圖 1、茶樹嫩芽以孢子懸浮液接種後保溼處理之狀況。

Figure 1. Tea sprout in moist PE bag after wound inoculation with conidia suspension.

(三)茶樹葉部以孢子懸浮液進行傷口接種之試驗

本項試驗主要目的在於確認自赤葉枯病斑及芽枯病分離所得炭疽菌株之葉部病原性，故以青心烏龍作為供試植株，先將酒精噴在擦手紙以去除葉部髒汙，

再以清水噴在擦手紙以去除葉上酒精共兩次，即對葉部以消毒過之解剖刀造成傷口，並將事先配製濃度為 1x10⁵之孢子懸浮液噴灑於傷口。並以蒸餾水噴灑刀割傷口作為對照組，每組實驗皆進行 3 重複，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該茶樹葉片保溼並置於溫室中，觀察並記錄其是否發病，並進行再分離以確認病原性。

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四、人工接種茶赤葉枯病及芽枯病之病原再分離

為確認上述分離株之病原性，需依柯霍氏準則將接種發病之植株進行病原再分離，採用的再分離方式為前述之組織分離法及稀釋分離法，皆自病健部進行再分離，所得之分離株則與原接種之分離株進行比對及鑑定，以完成柯霍氏準則第四條。

五、茶赤葉枯病及芽枯病分離株之鑑定 (一)形態鑑定

根據前人研究，使用形態學鑑定對於區分炭疽病菌非常困難 (Cai et al., 2009)，例如參考不完全菌之檢索表“Illustrated genera of imperfect fungi” (Barnett

& Hunter, 1972)，一般只能檢索至屬，因此本研究乃使用分子鑑定技術來確認病原菌之分類，但也將菌株之形態特徵加以記錄及拍照。

(二)分子鑑定

1、核苷酸(DNA)之萃取

使用 MagCore^® Nucleic Acid Extractor HF16 依照波仕特生物科技 Gene- Spin^TM – V³，1-4-3 DNA Extraction Kit 來萃取完整之 DNA。本項係將培養 10 天之分離株自 PDA 洋菜培養基刮下約 100 mg 之菌絲放入微量離心管，加入液態氮磨碎後，加入 400 μL GP1 Buffer, 5 μL RNase A (10mg/mL) 至微量離心管並震盪，於 65℃水浴槽中放置 10 分鐘，每 5 分鐘翻轉一次，再加入 100 μL GP2 Buffer 並震盪，於冰上放置 3 分鐘，將 Filter Column 放入 2 mL Collection Tube 再把樣品加入，以 13,200 rpm 離心 3 分鐘，丟棄 Filter Column 吸取 400 μL 上清液加入 Sample Tube，再將 Sample Tube 放入 MagCore^® Nucleic AcidExtractor HF16 機器中，將 Elution Tube, Tip Plus Holder Set 放入機器中，將機器設定為 Plant Kit，運作機器，待運轉完成取出60μL 用於 PCR。

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2.目標片段之增幅(PCR 反應)

Polymerase chain reaction(PCR)反應流程如下：於 PCR tube 加入 DNA 1 μL, Primer ITS1 0.5 μL, Primer ITS4 0.5 μL, 2X Taq PCR Master Mix 10 μL, DEPC H2O 8μL，放入 Bioer LifePro thermal cycler 中進行增幅。反應條件為預熱 94℃、10 分鐘後；94℃、30 秒，50℃、30 秒，72℃、30 秒，三種溫度循環 40 次，接著 72

℃、10 分鐘，10℃、10 分鐘即完成反應。PCR 反應後，進行電泳分析，確定 PCR 增幅產物。

3.PCR 產物電泳分析

使用水平電泳槽系統，電源供應系統與製膠模為 Mupid^○^R-2plus。秤取 2.1 g agarose(Amresco^○^R)，加入 140 mL 1X TAE buffer，微波加熱至完全溶解，並於室溫冷卻數分鐘後，倒入製膠盤中，插入齒梳，待凝固後取出齒梳，將膠體取出置於電泳槽中，加入 1X TAE buffer 至淹滿膠體，分別 Loading 樣品與 marker 至 well 中(樣品含 80 μL PCR 產物、12 μL DNA-Dye-NonTox 染劑；marker 包含 80 μL 100bp DNA Ladder Green、12 μL 染劑)，以 400 A, 100 V 進行電泳 25 分鐘後，

將膠片以 UV 燈照射，觀察並記錄之。

4.純化 DNA

將膠體上之 DNA 條帶(Band)切下置於微量離心管，每 100 mg 樣品加入 100 μL binding Buffer，置於 60℃水浴槽加熱至膠體完全融解且每 3 分鐘搖晃一次，

將樣品加入含 spin column 之 collection tube，極速(13,200 rpm)離心 1 分鐘，去除 collection tube 中之液體，再加入 500 μL binding Buffer 極速離心 1 分鐘，去除 collection tube 中廢液，加 700 μL Washing Buffer 至 spin column 極速離心 1 分鐘，

去除 collection tube 中廢液，再次加入 700 μL washing buffer 極速離心 1 分鐘，去除 collection tube 中廢液，極速離心 3 分鐘，去除 collection tube 中廢液，丟棄 collection tube，將 spin column 放入微量離心管，於 45℃熱水浴 5 分鐘去除酒精，

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於室溫加入 30 μL elution buffer 靜置 2 分鐘，極速離心 1 分鐘，置於冰上保存準備送定序。

5.基因片段之定序

純化之產物委託波仕特生物科技股份有限公司進行定序，取回之序列經校正後，於美國 NCBI (National Center for Biotechnology Information)網站上，以 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)功能鑑定本研究使用之分離株分類地位。

六、溫度對芽枯病菌生長速度之影響

為了解芽枯病菌於不同溫度下生長之情況，選取經病原性測試得知具有病原性之菌株培養於 PDA 洋菜培養基，於 25℃十二小時光週定溫生長箱培養五天後，

以消毒過之直徑 35 mm 打孔器切取菌絲塊，反貼接入 PDA 洋菜培養基之中央，

分別置於 15、20、25、30、35℃之十二小時光週梯度定溫生長箱中，觀察溫度對於菌絲生長速度之影響，每處理各 5 重複，並於五日後觀察。

七、北部地區茶赤葉枯病及芽枯病流行病學調查 (一)調查地點及品種

自 2013 年 12 月至 2014 年 6 月，每月於北部三個地區對各品種之茶樹進行茶赤葉枯病或芽枯病危害嚴重度之調查：

1. 桃園縣楊梅區行政院農業委員會茶葉改良場(桃園縣楊梅市埔心中興路 324 號)：品種有青心烏龍、臺茶十二號、鐵觀音、四季春等。

2. 新北市坪林區陳陸合茶農(新北市坪林區漁光里大舌湖 11-2 號)：品種為青心烏龍、臺茶十二號。

3. 新北市坪林區林金定茶農(新北市坪林區大粗坑茶區)：品種為青心烏龍。

4. 臺北市文山區高振盛茶農(臺北市文山區指南路三段 34 巷 21 號)：品種為鐵觀音、四季春。

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(二)調查方法

1.茶赤葉枯病葉片危害嚴重度

每地點調查五排茶樹，每排調查三單位，每單位定為 20×20 cm²，於每單位中隨機挑選 10 片成葉觀察茶赤葉枯病危害並依照葉片罹病級數(見表 1)進行記錄，並計算各地點、各品種之危害嚴重度。

表 1 茶赤葉枯病葉片罹病級數標準。

Table 1. The disease index of tea brown blight used in this study.

葉片未受害則罹病級數定為 0 級

葉片受害面積<1 cm² 罹病級數定為 1 級葉片受害面積≥1 cm² 罹病級數定為 2 級葉片受害面積≥4 cm² 罹病級數定為 3 級

危害嚴重度(%)=(Σ(罹病級數×葉片數)/(3×調查總葉數))×100%

2.芽枯病罹病率

只用於坪林之茶園，因有芽枯病徵故增加此項調查，於前述調查單位(20×20 cm²)中，調查有病斑之嫩芽及健康嫩芽數，計算嫩芽之芽枯病罹病率。

芽枯病罹病率(%)=(罹病芽數/調查總嫩芽數)×100%

(三)氣象資料取得

係自國家實驗研究院台灣颱風洪水研究中心，由大氣研究資料庫取得坪林區 (中央氣象局自動測站，站碼：C0A530，站名：坪林，121°42' 05〞E，24°56' 23〞

N，標高 300M)、文山區(中央氣象局自動測站，站碼：C0AC80，站名：文山，

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121°34' 03.1〞E，25°00' 14.7〞N，標高 40M )之氣象資料，另自茶葉改良場取得楊梅(農業氣象觀測站，站碼：82C16，站名：茶葉改良場，121°12' E，25°45' N，標高 195M)之氣象資料。

八、芽枯病之非農藥防治 (一)防治資材取得

從一般市場購買蒜、薑，另自中藥店(安生藥局，臺北市中正區南昌路二段 191 號)購買藿香、丁香、五味子、薑黃、肉桂粉等總共七種防治資材。首先將防治資材經去皮或泡軟等前處理後以 RO 水清洗，各取 100 g 加入 500 mL 水或 50%

(w/v)乙醇 500 mL 中(表 2)，先將萃取液以 3000 rpm 離心 15 分鐘後，再將上清液以孔徑 0.22μL 之濾紙過濾後倒入無菌玻璃瓶內密封，置於陰涼處三天，每天搖盪一次，三天後儲存於 4 ℃備用(謝等，2005)。此些即為 20%萃取液。

另取百泰公司商業化之產品台灣寶：枯草桿菌(Bacillus subtilis)與本實驗室分 離自花蓮玉里之水稻田之放線菌(Streptomyces sp.)編號 YU01，作為拮抗微生物進 行試驗。

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表 2 本研究用以製備萃取液之植物種類及其處理方法。

Table 2. The plant material used for non-pesticide control test against the anthracnose pathogen in this study and their pretreatment and extract method.

普通名

Common name(Chinese)

學名 Scientific name

科別 Family name(Chinese)

使用部位 Part

前處理 Pretreatment

製成萃取液 Extraction method

Garlic(蒜) Allium sativum L. Alliaceae(蔥科) 鱗莖剝皮，清洗後切丁以果汁機打碎 Cinnamon (肉桂) Cinnamomum cassia Nees Lauraceae(樟科) 乾燥樹皮取得已是肉桂粉加入水中混合均勻 Cablin Potchouli Herb

(藿香)

Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O. Ktze.

Lamiaceae (脣形花科)

地上部乾燥

以均質機磨碎加入水中混合均勻

Chinese magnoliavine fruit (五味子)

Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.

Magnoliaceae (木蘭科)

乾燥果實以均質機磨碎加入水中混合均勻

Clove (丁香) Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry

Myrtaceae (桃金娘科)

乾燥花蕾以均質機磨碎加入水中混合均勻

Turmeric(薑黃) Curcuma longa L. Zingiberaceae(薑科) 乾燥根莖以均質機磨碎加入水中混合均勻 Ginger(薑) Zingiber officinale Roscoe. Zingiberaceae(薑科) 根莖剝皮，清洗後切丁以果汁機打碎

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(二)植物萃取液對孢子發芽抑制之試驗

為測定植物萃取液對芽枯病菌之孢子發芽抑制效果，取於 PDA 培養 10 天之赤葉枯病菌分離株，每皿加入 5 mL 無菌水，以消毒過之三角玻棒將孢子洗下，

將孢子懸浮液濃度調為 1x10⁵conidia/mL，即取 30 μL 孢子懸浮液與 36 μL 之植物萃取液混合，使植物萃取液最終濃度為 1%, 0.2%, 0.1%，並各添加 6 μL 之 1%

無菌葡萄糖水以促進孢子之發芽，共 72 μL 置於懸滴載玻片上，另以無菌水、酒精(0.125%, 0.25%, 1.25%)、免賴得 1,500 倍(依照植物保護手冊推薦濃度)做為對照組，共為十三種處理，每處理 6 重複，皆放置於 25℃全天光照定溫箱下 24 小時後，即取出玻片以光學顯微鏡觀察孢子發芽之情形，並以發芽管長度超過孢子長度判定為發芽，每一處理之重複皆計數 100 個孢子，以求其發芽抑制率(謝等，

2005)。

孢子發芽抑制率(%)= ((對照組發芽率-實驗組發芽率)/對照組發芽率)×100%

(三)植物萃取液對菌絲生長抑制之試驗

為測定植物萃取液對芽枯病菌之菌絲生長抑制效果，配製 PDA 於三角燒瓶中每瓶 120 mL，在高溫高壓滅菌後尚未凝固前約 60℃即先加入植物萃取液，使萃取液最終濃度為 1%, 0.2%, 0.1%，混淆均勻後立即倒入 9 cm 培養皿中做為萃取液培養基，另以無菌水、酒精(0.125%, 0.25%, 1.25%)、免賴得 1,500 倍(依照植物保護手冊推薦濃度)做為對照組。試驗時先以 PDA 培養菌株 10 天後，即以消毒過之打孔器打出直徑 3.5 mm 圓形菌絲塊，立即移置萃取液培養基中央，於十二小時光週 25℃定溫生長箱培養，五天後觀察並記錄菌絲生長直徑，每處理作 10 重複，並計算菌絲生長抑制率(林等，2010)。

菌絲抑制率(%)= ((對照組菌絲生長長度-實驗組菌絲生長長度)/

對照組菌絲生長長度)×100%

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(四)拮抗微生物對峙培養試驗

為測試拮抗微生物(枯草桿菌及放線菌)對於芽枯病菌之抑制效果，將拮抗微生物培養於 PDA 洋菜培養基上，培養五天後使用滅菌過之移植環挑取單菌落，

畫於事先吹乾並有標記之 PDA 洋菜培養基之中線，再取出以 PDA 培養 10 天之茶赤葉枯菌株，以消毒過之打孔器打出直徑 3.5 mm 圓形菌絲塊，立即反貼置於 PDA 洋菜培養基距中線 30 mm 處之兩端。另以未使用拮抗微生物之 PDA 洋菜培養基做為對照組，於十二小時光週 25℃定溫生長箱培養，待對照組菌絲生長至靠近中線時記錄各實驗組菌絲生長半徑，每處理做 6 重複，並計算菌絲生長抑制率。

(五)植物萃取液對芽枯病之盆栽防治試驗

為測試植物萃取液對芽枯病之防治效果，以青心烏龍作為供試植株，將酒精噴在擦手紙用以去除嫩芽之髒污，再以清水噴在擦手紙以去除嫩芽上之酒精共兩次，即以消毒過之解剖針對嫩芽造成傷口，立即將 0.2%之植物萃取稀釋液噴灑於傷口上，待其自然風乾後，將濃度為 1x10⁵之孢子懸浮液噴灑於嫩芽。另以蒸餾水噴灑於有接種之傷口作為負對照組，以 1%酒精噴灑於有接種之嫩芽作為酒精對照組，以只噴灑孢子懸浮液於傷口者作為正對照組，每株茶樹皆各取 2 枝條參與試驗，每組皆進行 6 重複，接種後皆使用內部噴水之塑膠袋套封茶樹之嫩芽以求保溼並置於溫室。為確認植物萃取液為保護型或殺菌型，亦進行噴灑病原菌孢子後再施用植物萃取液之試驗。隨後對已發病者進行再分離，以確認其病原性。

(六)拮抗微生物對芽枯病之盆栽防治試驗

為測試拮抗微生物之防治效果，將枯草桿菌依照推薦使用濃度稀釋 800 倍，

放線菌方面，待放線菌於 PDA 產孢後，即各加入 5 mL 無菌水，使用消毒過之三角玻棒洗下孢子，並以序列稀釋法計算放線菌之濃度，即將 0.1 mL 不同稀釋倍

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25

數(10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9)之菌液以消毒過之三角玻棒塗佈於 PDA 上，隔天觀察並計算其菌落數。

本項係以青心烏龍作為供試植株，將酒精噴在擦手紙以去除嫩芽之髒污，再以清水噴在擦手紙以去除嫩芽上之酒精共兩次，即以消毒過之解剖針對嫩芽造成傷口，立即將枯草桿菌、放線菌噴灑於傷口上，待其自然風乾後，將濃度為 1x10⁵ 之孢子懸浮液噴灑於嫩芽。放線菌 YU01 之濃度為每皿 5 mL 洗下之原液、稀釋 10 倍、及稀釋 100 倍三種濃度，另只噴灑孢子懸浮液於傷口者作為對照組，每株茶樹皆各取 2 枝條參與試驗，每組實驗皆進行 6 重複，接種後即使用內部噴水之塑膠袋套封茶樹之嫩芽以求保溼並置於溫室。為確認拮抗微生物效果為保護型或殺菌型亦進行噴灑病原菌孢子後再施用拮抗微生物之試驗，而放線菌作用需較長時間因此額外進行於接種前一天噴灑放線菌之試驗。隨後對已發病者進行再分離，以確認其病原性。

九、農藥對芽枯病菌絲生長抑制試驗

使用藥劑為植物保護手冊中推薦使用於茶赤葉枯病之農藥，分別為 25.9%

得克利(Tebuconazole)、39.5%扶吉胺水懸劑(Fluazinam)、11.6%四克利水基乳劑 (Tetraconazole)、40%克熱淨(烷苯磺酸鹽)可溼性粉劑

(Iminoctadinetris(albesilate))、50%免賴得可溼性粉劑(Benomyl)、70%甲基多保淨可溼性粉劑(Thiophanate-methyl)、24.9%待克利乳劑(Difenoconazole)、23.6%

百克敏乳劑(Pyraclostrobin)、43%嘉賜貝芬可溼性粉劑

(Kasugamycin+Carbendazim)、24.55%貝芬四克利濃懸乳劑(Carbendazim

+Tetraconazole)、16%腈硫克敏水分散性粒劑(Pyraclostrobin+Dithianon)、42.2%

腈硫醌水懸劑(Dithianon)以及 23%亞托敏水懸劑(Azoxystrobin）等共十三種。

試驗前先配製 PDA 於三角燒瓶中，待高溫高壓滅菌後尚未凝固前約 60℃

立即加入農藥，使十三種藥劑有效成分濃度分別為 1, 10, 100, 1000 ppm，二者混合均勻後即倒入 9 cm 培養皿做為農藥培養基，另以無菌水做為對照組。各取

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於 PDA 培養 10 天之菌株，以消毒過之打孔器打出直徑 7 mm 圓形菌絲塊，反貼於農藥培養基中央，於 25℃定溫生長箱中培養，五天後觀察並記錄菌絲生長直徑，每處理進行 5 重複，並計算其生長抑制率。

十、以不同來源炭疽病菌對茶樹進行病原性之檢定

本項不同來源炭疽病菌共有 3 株，包括(1)自苗栗取得具有病原性之咖啡炭疽病菌，(2)自實驗室取得具病原性之草莓炭疽病菌，(3)自臺北取得具有病原性之芒果炭疽病菌。供試茶樹為清心烏龍茶苗，先將酒精噴在擦手紙以去除嫩芽之髒汙，再以清水噴在擦手紙以去除嫩芽上之酒精進行兩次後，即在嫩芽以消毒過之解剖針造成傷口，將濃度為 1x10⁵之芒果炭疽病、草莓炭疽病、咖啡炭疽病之病原菌分生孢子懸浮液噴灑於嫩芽。以確認有病原性之茶樹芽枯病菌分離株做為對照組接種，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該嫩芽保溼並置於溫室，觀察並記錄是否發病，並進行再分離以確認其病原性，再分離方法與前述分離病原菌方法相同。

十一、以芽枯病菌對不同品種茶樹之病原性測試

本項係以大葉烏龍、四季春、臺茶十二號即青心烏龍等四品種茶樹作為供試植株，先將酒精噴在擦手紙以去除嫩芽之髒污，再以清水噴在擦手紙以去除嫩芽上之酒精進行兩次後，即在嫩芽以消毒過之解剖針造成傷口，將濃度為 1x10⁵之孢子懸浮液噴灑於嫩芽。以無菌水做為對照組接種，接種後即以內部噴水之塑膠袋套封該嫩芽保溼並置於溫室，觀察並記錄是否發病，並進行再分離以確認其病原性，再分離方法與前述分離病原菌方法相同。

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第四章結果

一、臺灣北部地區茶樹赤葉枯病及芽枯病之田間調查

於 2013 年 11 月至 2014 年 6 月間，前往臺灣北部種植茶樹地區進行茶赤葉枯病與芽枯病之調查，調查地點主要有新北市坪林區陳陸合先生之茶園、新北市坪林區林金定先生之茶園、桃園縣楊梅鎮茶葉改良場之茶園、臺北市文山區高振盛先生之茶園，除了記錄各地點之典型茶赤葉枯病發生情形外，並將罹病葉、罹病芽帶回實驗室進行拍照、鏡檢及分離。其田間病害調查所得結果如表 3，並概述如下：

1. 新北市坪林區陳陸合先生之茶園：於 2013 年 11 月至 2014 年 6 月間，發現該處青心烏龍生長狀況不佳，冬天時芽枯病發生頻繁(圖 2)，茶赤葉枯病則是一直都有發現(圖 3)，臺茶十二號芽枯病也是發生頻繁，但赤葉枯病發病較少，

此茶園行有機農法，以下以坪林區有機茶園表示。

2. 新北市坪林區林金定先生之茶園：於 2013 年 11 月至 2014 年 6 月間，調查該處茶赤葉枯病或芽枯病發生情形，發現該處青心烏龍生長狀況不佳，冬天時芽枯病發生，但較陳陸合先生之茶園輕微，茶赤葉枯病則是一直都有發現，此茶園行慣行農法，以下以坪林區慣行茶園表示。

3. 桃園縣楊梅鎮茶葉改良場之茶園：於 2013 年 11 月至 2014 年 6 月間，調查該處茶赤葉枯病或芽枯病發生情形，發現該處四季春、鐵觀音、臺茶十二號等植株，生長狀態皆良好，新芽並無芽枯病發生，茶赤葉枯病則零星發生，青心烏龍雖無芽枯病發生，但受茶赤葉枯病危害較嚴重(圖 4)，此茶園行有機農法，以下以楊梅區茶園表示。

4. 臺北市文山區高振盛先生之茶園：於 2013 年 11 月至 2014 年 6 月間，調查該處茶赤葉枯病及芽枯病發生情形，發現該處四季春、鐵觀音植株生長狀態良好，新芽並無芽枯病發生，鐵觀音茶赤葉枯病較少發生，四季春則於 2014 年 5,

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6 月受茶赤葉枯病危害較嚴重，此茶園行慣行農法，以下以文山區茶園表示。

表 3 臺灣北部地區茶赤葉枯病及芽枯病病害調查結果。

Table 3. The results of field investigation on tea brown blight disease and sbrout wilt disease in northern Taiwan.

地點茶樹品種病徵

新北市坪林區有機茶園青心烏龍、臺茶十二號芽枯病、赤葉枯病

新北市坪林區慣行茶園青心烏龍芽枯病、赤葉枯病

桃園縣楊梅區茶園青心烏龍、臺茶十二號、

四季春、鐵觀音赤葉枯病

臺北市文山區茶園四季春、鐵觀音赤葉枯病

圖 2、新北市坪林區有機茶園青心烏龍芽枯病之萎凋病徵。

Figure 2. Sprout wilt symptoms on Oolong tea plants found in Pinglin organic tea garden.

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圖 3、新北市坪林區有機茶園青心烏龍赤葉枯病之炭疽病徵。

Figure 3. Anthracnose symptoms on Oolong tea leaves found in Pinglin organic tea garden.

圖 4、桃園縣楊梅區茶園青心烏龍赤葉枯病之炭疽病徵。

Figure 4. Anthracnose symptoms on Oolong tea leaves found in Yangmei, Taoyuan.

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二、茶赤葉枯病及芽枯病之病原菌分離及初步鑑定 (一) 嫩芽芽枯之病原菌分離

對坪林區有機茶園及坪林區慣行茶園之芽枯病，係以組織塊分離法及稀釋進行分離，其組織塊分離法之分離結果如表 4，而稀釋分離法結果如表 5。由於田間調查時於楊梅區及文山區茶園並未發現芽枯病之病徵故未予以納入。結果發現坪林區茶園芽枯病分離所得真菌分離株，可大致分成兩類，第一類為白色雲狀菌絲，生長速度較快，可於 PDA 上產生黑色分生孢子堆，分生孢子具隔膜且基部有 3-5 根附屬絲 (圖 5)，分生孢子大小為 25-32 × 9-11μm，經初步鑑定 為擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis sp.) (Maharachchikumbura 2013) 。第二類為灰白 色菌絲，可於 PDA 培養基底部產生黑色色素，分生孢子無色長橢圓形，不具隔 膜 (圖 6) ，大小為 12.5-22.5 X 2.5-7.5μm，初步鑑定為炭疽病菌(Colletotrichum sp.)。

本項統計自坪林區有機茶園之青心烏龍芽枯病以組織塊分離法分離，共得到 11 株真菌分離株，其中 4 株為炭疽病菌，另有 6 株則為擬盤多毛孢菌，尚有一株為尚無法鑑定之粉紅色菌落真菌，此些分離株之編號皆以 BC 後加不同代碼(如表 6)。於坪林區有機之臺茶十二號則獲得 12 株分離株，其中 1 株為炭疽病菌，9 株為擬盤多毛孢菌，還有一株為桃紅色之真菌菌落另一株為橘色真菌菌落，並將其編號為 BT 後加不同代碼(如表 6)。自坪林區慣行茶園得到 3 株分離株，皆為炭疽病菌，其編號為 GC 後加不同代碼(如表 6)。

而以稀釋分離法分離得到許多菌株，其中有炭疽病菌菌落，但卻沒有分離到擬盤多毛孢菌，而分離得到之細菌菌落多大同小異，且與對照組之細菌菌落相似，故未與以記錄。

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31

表 4 臺灣北部茶樹芽枯病以組織塊分離法分離病原之結果。

Table 4. The fungi isolated from tea sprout wilt in northern Taiwan by tissue isolation method.

地點茶樹品種分離樣

本數

擬盤多毛孢菌 (Pestalotiopsis spp.)之分離率

炭疽病菌 (Colletotrichum

spp.)之分離率新北市坪林區

有機茶園

青心烏龍 11 6/11(55%) 4/11(36%) 新北市坪林區

有機茶園

臺茶十二號 12 9/12(75%) 1/12(8%) 新北市坪林區

慣行茶園

青心烏龍 3 0/3(0%) 3/3(100%)

表 5 臺灣北部茶樹芽枯病以稀釋分離法分離病原之結果。

Table 5. The fungi isolated from tea sprout wilt in northern Taiwan by dilution method.

地點茶樹品種真菌/細菌

菌落種類

真菌種類炭疽病菌之分離

率新北市坪林區

有機茶園

青心烏龍 5 種真菌 4 種細菌

白色菌落深黑色菌落淺褐色菌落炭疽菌落

2/3(66%)

新北市坪林區有機茶園

臺茶十二號

3 種真菌 2 種細菌

深黃色菌落深黑色菌落褐色菌落

0/3(0%)

新北市坪林區慣行茶園

青心烏龍 3 種真菌 3 種細菌

白色雲狀菌落綠色菌落炭疽菌落

1/3(33%)

茶樹赤葉枯病之流行病學及非農藥防治

國立臺灣大學生物資源暨農學院 植物醫學碩士學位學程

碩士論文

Master Program for Plant Medicine College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

茶樹赤葉枯病之流行病學及非農藥防治

Epidemiological study and non-pesticide control of tea brown blight disease

蔡志千

Tsai, Chih-Chien 指導教授：孫岩章 博士 Advisor: En-Jang Sun, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

誌謝

中文摘要

Summary

目錄

表目錄

圖目錄

第一章 前言

第二章 前人研究

第三章 材料與方法

第四章 結果

國立臺灣大學生物資源暨農學院植物醫學碩士學位學程

Tsai, Chih-Chien 指導教授：孫岩章博士 Advisor: En-Jang Sun, Ph.D.

第一章前言

第二章前人研究

第三章材料與方法

第四章結果