儀設與方
3.1.2 菌種篩選與培養基選擇
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3.1.2 菌種篩選與培養基選擇
將採集回來之土壤樣本經序列稀釋後，依據 Kroll (1990)研究巴氏芽孢桿菌 (Bacillus pasteurii)引致碳酸鈣沉澱，認為可能之生化機制：微生物吸收環境中的 尿素 (Urea)，以其體內的一種酵素－尿素脢 (Urease)，將尿素分解成氨 (NH3) 及二氧化碳 (CO2)釋放至環境中，由於氨溶於水為鹼性物質，釋放至環境中會使 其週遭酸鹼值升高，而碳酸鈣在偏鹼的環境下較容易沉澱。化學式如下：
NH2 – CO – NH2 + 3H2O → 2NH4+ + 2OH- + CO2
Ca2+ + CO32- → CaCO3
從土樣中篩選出具有引致碳酸鈣沉澱能力較佳之微生物作為本研究主要使用的 菌種，篩選方法分為三步驟 (流程圖如圖 3. 5)，第一步限制生長環境，調整培養 基組成，僅以尿素作為營養氮源，在此培養基上可生長之微生物即為具有可分解 尿素能力之微生物；第二步為測試微生物之酸鹼值，將第一步篩選出之微生物從 培養基轉移至培養液內，以 pH 試紙測試培養液之酸鹼值，挑選出使培養液偏鹼 之微生物，第三步則是檢測碳酸鈣沉澱的量來決定本研究將使用的菌種。
培養基由於加入之凝固劑 (洋菜粉，agar)含量不同，可將培養基分為固體 (solid)、半固體 (semi-solid)、液體 (liquid)培養基三類，於本實驗中僅使用固體 及液體培養基，內文中將固體培養基稱為培養基，液體培養基稱為培養液。
本研究在微生物生化實驗中將使用之培養基為 UF 培養基、Thermus 培養基、
LB 培養基以及 M9 培養基。調整 UF 培養基之化學成分以符合限制微生物生長 環境，作為第一步菌種篩選之用，Thermus 培養基與 LB 培養基則擇一作為後續 培養及改良砂土之營養液之用，選擇方法是將第一步篩選出來之微生物種入 Thermus 或 LB 培養液內，經 pH 試紙測試個別含菌培養液 (簡稱菌液)之酸鹼度 選擇可使菌種產生較高 pH 值者。
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(1) 修飾過的 UF 培養基
每公升溶液中添加之化學成分與重量或體積分別為 fructose 10 g、peptone 10 g、yeast extract 10 g、urea 2 g 及 10 倍的 salt solution 100 ml，視實驗需要加入 15 g 的洋菜粉 (Agar)。而 10 倍的 salt solution 配製之化學成分，每公升溶液中含有 NaCl 5 g、MgSO4 0.2 g、CaCl2 0.02 g、(NH4)2SO4 1 g。欲調配固態培養基，則加 入 15 g 之洋菜粉使容液凝固即可。本研究在上述說明篩選菌種步驟中，第一步 為限制生長環境，因 Kroll (1990)提出之微生物引致碳酸鈣沉澱機制說明巴氏芽 孢桿菌具有尿素脢 (urease)可分解環境中之尿素，在此假設微生物引致碳酸鈣沉 澱需要能分解尿素之能力，因此在第一步篩選擇將 UF 培養基調整為每公升溶液 含有 glucose 10 g、urea 2 g、10 倍的 salt solution 100 ml。將 fructose (果糖)改為 glucose (葡萄糖)，兩者皆為單醣，但葡萄糖較果糖容易吸收，而微生物生存不外 乎吸收碳源及氮源，其他化學成分如 peptone 及 yeast extract 則不添加，減少微 生物其它的營養來源，強迫微生物吸收葡萄糖及尿素作為碳與氮之營養源，在此 培養基可生存之微生物，即為可分解尿素者。
(2) Thermus 培養基 (Ramaley and Hixson, 1970)
每公升溶液中添加之化學成分與重量或體積分別為 Peptone 3 g、yeast extract 1 g、Glutamic acid 1 g、10 X Castenholz Basal salts 100 ml，最後將最終 pH 值調 整到 7.8，欲製作固體培養基擇加入 20 g 之洋菜粉 (agar)。10 倍的 Castenholz Basal salts 配製之化學成分，每公升溶液中含有 Nitrilo triacetic acid
( C6H7NO6Na2) 1 g、CaSO4‧2H2O 0.6 g、MgSO4‧7H2O 1 g、NaCl 0.08 g、KNO3 1.03 g、NaNO3 6.89 g、Na2HPO4 1.11 g、FeCl3溶液 (14 g/L) 200 ml、Nitsch’s trace elements 溶液 10 ml。其中 Nitsch’s trace elements 溶液配製之化學成分，每公升 溶液中含有 H2SO4 0.5 g、MnSO4‧H2O 2.2 g、ZnSO4‧7H2O 0.5 g、H3BO3 0.5 g、
CuSO4 0.016 g、Na2MoO4‧2H2O 0.025 g CoCl2‧6H2O 0.046 g。
Peptone (蛋
M9 glucose 每公升溶 t solution 配
g、NH4Cl ast extract (酵 之醣類。
為 tryptone 1 e (胰化蛋白
.3 銨離子
為得知篩 究參考環保 氨氮及銨離 kaline citrat 醯鐵氰化鈉 te solution) 鈉溶液 (Sod W448.51B 水 中加入酚溶
，與樣本溶 ium nitropr 7)於波長 64
l solution)及 離子反應並