國立臺灣大學工學院土木工程學系 碩士論文
Department of Civil Engineering College of Engineering
National Taiwan University Master Thesis
微生物式之碳酸鈣膠結效應對粒狀土壤地質改良之研探 Effect of precipitation of microbiological CaCO
3cementation
on the geotechnical improvement of granular soil
卓雨璇 Yu-Syuan Jhuo
指導教授：黃燦輝 博士 陳立憲 博士 Advisor：Tsan-Hwei Huang,Ph. D.
Li-Hsien Chen, Ph. D.
中華民國 100 年 7 月
July, 2011
口委
I
委審定 定書
II
摘 要
論文名稱：微生物式之碳酸鈣膠結效應對粒狀土壤地質改良之研探 校所別：國立台灣大學土木工程學系大地工程組 頁數：88 時間：九十九學年度第二學期 學位：碩士
研究生：卓雨璇 指導教授：黃燦輝、陳立憲
關鍵字：土壤微生物、碳酸鈣、掃描式電子顯微鏡、元素分析、超音波脈衝
鑑於微生物為地質成岩、礦化過程重要因素之一，且台灣國土危脆，大地防 災之需求日殷，突顯出土壤強化改良與邊坡工程整治等需求刻不容緩。本文嘗試 突破傳統地質改良方式，如物理式地錨工程及化學式灌漿工程為主之技術選項，
改用存在於土壤中之微生物改良強化土壤本身之方式，進行本土首次研探。亦即 利用生物技術之輔佐；進行長時性、生態式之地質改良，發展更近於自然之生態 工程為本文要旨。
首先藉由採集台灣各地土壤樣本中既有之菌種；依文獻提及之微生物引致碳 酸鈣沉澱之機制作為改進參考，篩選出本土具有引致碳酸鈣沉澱特質之微生物，
並首次嘗試以多菌式 (即多菌種)對砂土進行改良，並重新審視其碳酸鈣沉澱之 生化機制及其要因，同時找出較合適之培養基及改良方式。以掃描式電子顯微鏡 (Scanning electron microscopy, SEM)配合元素分析，及超音波脈衝 (Ultrasonic pulse)對砂土改良前後作化性與物性之成效評估。
經由系列實驗獲致兩種具土壤改良成效之微生物，一為蘇力桿菌，二為未定 出種名之桿菌屬，以此二菌做研究，並找出合適此二菌之培養環境 (培養基成分) 與影響碳酸鈣沉澱之因子 (尿素濃度、氯化鈣添加時間等)；再針對砂性土壤進 行微生物式之土壤強化程序，經非破壞檢測顯示，此二菌確可引致碳酸鈣沉澱並 提升其土壤剪力波速，未來應可作為相關土壤強化技術之參佐；與沉積岩膠結成
III
岩機理之研析。
IV
英文摘要
Title：Effect of precipitation of microbiological CaCO3 cementation on the geotechnical improvement of granular soil
School：National Taiwan University Pages：88 Department：Civil Engineering
Time：June, 2011 Degree：Master
Researcher：Yu-Syuan Jhuo Advisor：Tsan-Hwei Huang Li-Hsien Chen Keywords：Soil microbes, Calcium carbonate, Scanning electron microscope (SEM),
element analysis, Ultrasonic pulse
Microbial mineralization is one of the important rock-formed factors in geology.
The requirement of disaster prevention engineering become the popular issue because of the weakness earth in Taiwan, and highlighted that soil improvement and slope stability engineering are urgent. This study aims at the first research that break through the traditional method of ground improvement and grout engineering in physics and chemistry, use the microbes in soil to strengthen the earth. That is to say, utilize biological technology to achieve the long-term and ecological ground improvement, developing nature-closed ecology engineering.
By collecting the microbes from the local soil sample, in accordance with Kroll (1990) which bring up the mechanism of microbially induced CaCO3 precipitation (MICP), select the microbes which have the characteristic of MICP. This study try to improve granular soil by multi-microbe, re-examining the mechanism of MICP and the major factors, and find a suitable incubated method and the way of improvement.
V
Evaluate the chemical and the physical properties of improved soil by scanning electron microscopy, element analysis, and ultrasonic pulse.
Through a series of experiment, got two microbes which are Bucillus
thuringensis and Bucillus sp. Find the suitable incubation environment (medium and
temperature), and the factors of effect MICP (the concentration of urea, pH etc.) To strengthen Non-cohesive granular soil by MICP, the examination result shows that this two microbes which can induce CaCO3 precipitation and increased the shear wave.
VI
謝 誌
學生於研究所生涯，成蒙恩師 黃燦輝教授、陳立憲教授的精心指導與寶貴 經驗分享，使學生於專業知識及邏輯思考能力多所啟迪，同時對於學生待人處事 方面，更是時時叮嚀與導正，利以日後踏出社會鋪陳，並於論文寫作時逐字斧正，
使得本文得以順利完成，在此謹致以最誠摯的敬意與感恩。
感謝口試委員台大植科所蔡珊珊教授以及淡大土木所楊長義教授，對本論文 不吝指教並提出寶貴建議，使本論文得以更加完善，在此至上無限感激。
於實驗過程，感謝花蓮慈濟大學微免所林光慧教授，無私提供學生微生物實 驗室及器材做實驗，並將學生當作自己學生般給予微生物領域之學識與指導，光 慧老師對學生們之關心與耐心令學生感到佩服與敬仰；微生物實驗室的黃奕鼎、
陳柏均、林子剛、陳婧育、王思穎、張婷芳、曹詠翔於微生物實驗上之協助與扶 持；電子顯微鏡室的楊梅君學姐於掃描室電子顯微鏡與元素分析教學與指導，並 感謝慈濟大學電子顯微鏡室的儀器提供；台科營建系陳鴻益技士提供實驗所需相 關設備，劉峵瑋學長、巫奇穎學長、徐紳翔於百忙中支援力學試驗；北科土木系 買冠誠、蔡弦諭、劉佳濠、施佩文於土木力學試驗的指導、幫忙與資料提供；北 科材資系何恭睿學長、林佩瑩學姊於 XRD 上的幫忙；台大土木所周英豪先生、
呂偉哲、李晉榮、吳昌坪於提供實驗方向上之建議並予以鼓勵；文榮胡俊雄經理 於可視化直剪盒設計討論與製作。研究進行過程中有了他們，使學生實驗進行順 力並且有持續不懈之動力，特此致謝。
求學期間，感謝研究所學長姐邱雅筑、黃奉琦、許雅涵、邱家吉在課業上以 及人生方向上的勉勵；研究所同學李宛瑾、李晉榮、林昌良、吳昌坪、李文婷於 課程上的相互幫忙、鼓勵與扶持，特別感謝如家人般的呂偉哲，給予我不斷的鼓 勵與共同經歷每個過程。
VII
最後將本論文獻給我最敬愛的父母親、姊姊和弟弟，有了他們的支持是我繼 續深造的動力，無限感謝父母親不辭辛勞的養育、栽培與支持，並給予我無後顧 之憂的求學環境、包容及體諒，尤其是無人可取代的父親，相信您在天上也能感 受到這份喜悅，於此向我的家人說「我愛你們！！」
VIII
目 錄
口委審定書... I 摘 要... II 英文摘要... IV 謝 誌... VI 目 錄... VIII 表目錄... XI 圖目錄... XII
第一章 緒論... 1
1.1 研究動機... 1
1.2 研究目的... 1
1.3 範圍與方法... 2
1.4 內容與架構... 3
第二章 文獻回顧... 5
2.1 微生物於大地工程之作用... 5
2.1.1 微生物之成岩成礦作用... 7
2.1.2 微生物引致碳酸鈣沉澱之生化機制... 9
2.2 微生物技術於大地工程之應用... 14
2.2.1 微生物對砂土不排水剪力強度改良之影響... 15
2.2.2 微生物技術應用於混凝土修復及土壤改良... 17
第三章 試驗儀設與方法... 19
3.1 微生物之分離與生理生化實驗... 19
3.1.1 土壤樣本處理與菌種分離、純化... 19
3.1.2 菌種篩選與培養基選擇... 22
IX
3.1.3 銨離子濃度檢測法與 pH 值測試 ... 25
3.1.4 碳酸鈣濃度檢測法... 30
3.1.5 革蘭氏染色... 33
3.1.6 染色體萃取法... 34
3.1.7 聚合脢連鎖反應... 35
3.1.7 膠體電泳分析... 39
3.2 掃描式電子顯微鏡與元素分析... 41
3.3 微生物式土壤性質改良實驗... 44
3.3.1 砂土物理性質... 44
3.3.2 改良試體製備... 46
3.3.3 超音波脈衝試驗... 47
第四章 試驗結果與分析... 49
4.1 培養基決定與菌種篩選結果... 50
4.2 微生物引致碳酸鈣沉澱機制探討... 58
4.2.1 尿素濃度對銨離子與酸鹼值之影響... 59
4.2.2 氯化鈣添加時機對碳酸鈣沉澱量之影響... 65
4.2.3 酸鹼值與銨離子濃度對碳酸鈣沉澱量之影響... 66
4.3 碳酸鈣膠結物之微觀造影及其改良成效... 70
4.4 改良試體之剪力波速... 79
第五章 結論與建議... 81
5.1 結論... 81
5.1.1 微生物引致碳酸鈣沉澱機制... 81
5.1.2 改良砂試體之非破壞檢測... 82
5.2 建議... 83
5.2.1 微生物式改良技術之研析... 83
X
5.2.2 改良試體之力學性質探討... 83
5.3 未來大地工程之考量... 84
參考文獻... 86
附錄 A：實驗相關資料與圖片 ... i
附錄 B：相關實驗增錄 ... vi
附錄 C：委員意見回覆表 ... x
XI
表目錄
表 2. 1 以 X 光繞射分析砂土改良前後成分變化 (Fischer, 1996) ... 11
表 3. 1 渥太華砂物理性質 (廖元憶，2005) ... 45
表 3. 2 越南石英砂物理性質 (馮高源，2010) ... 45
表 4. 1 菌種篩選之 pH 試紙測試酸鹼度 ... 52
表 4. 2 培養基選擇之 pH 試紙測試酸鹼度 ... 53
表 4. 3 本研究以本土土壤篩選出之微生物引致碳酸鈣沉澱的培養方式... 59
表 4. 4 砂試體改良內容物... 79
表 A. 1 Fischer (1999)以巴氏芽孢桿菌引致碳酸鈣沉澱的培養方式 ... i
XII
圖目錄
圖 1. 1 研究流程圖... 4
圖 2. 1 普遍微生物生長所需之營養源 (Mitchell, 2005) ... 6
圖 2. 2 微生物分類與其構造及生長特性 (Mitchell, 2005) ... 6
圖 2. 3 土壤粒徑與微生物尺寸關係 (Mitchell, 2005) ... 7
圖 2. 4 巴氏芽孢桿菌 (Times, 2007) ... 10
圖 2. 5 巴氏芽孢桿菌引致碳酸鈣沉澱之生化性質 (Fischer, 1996) ... 11
圖 2. 6 巴氏芽孢桿菌引致碳酸鈣沉澱於掃描式電子顯微鏡下之影像... 12
圖 2. 7 微生物引致碳酸鈣沉澱前後之尺寸變化過程。(Mitchell et al., 2005)... 12
圖 2. 8 巴氏芽孢桿菌改良砂土於掃描式電子顯微鏡下之影像 (DeJong, 2006) .. 13
圖 2. 9 Berea 砂岩以酵素水解尿素生成碳酸鈣改良前後之孔隙透水率 ... 14
圖 2. 10 微生物式改良土壤系統綜述 (DeJong et al., 2009) ... 15
圖 2. 11 土壤顆粒與微生物大小之比較 (Mitchell et al., 2005) ... 16
圖 2. 12 以微生物改良砂土前後隨著應變增加之波速與剪力強度變化... 16
圖 2. 13 超音波脈衝結合三軸試驗 (Wicaksono, 2007) ... 17
圖 2. 14 不均質固化現象 (杉本大輔與桑野玲子，2009) ... 17
圖 3. 1 微生物生化實驗流程圖... 19
圖 3. 2 屏東墾丁採集點位置... 20
圖 3. 3 花蓮光復鄉大興村土壤採集地點... 21
圖 3. 4 分離之菌落... 21
圖 3. 5 菌種篩選步驟流程... 24
圖 3. 6 高溫高壓滅菌鍋 (型號：AS-1060 L) ... 25
圖 3. 7 分光光度計... 28
圖 3. 8 不同濃度的氨氮標準溶液經過反應呈色後顏色差異。... 29
圖 3. 9 pH 試紙 ... 29
XIII
圖 3. 10 酸鹼度計 (型號：MP 220) ... 30
圖 3. 11 EDTA 滴定法變色過程 ... 32
圖 3. 12 甲基紅指示劑顏色呈現... 32
圖 3. 13 細菌細胞壁之基本構造... 34
圖 3. 14 3D 搖擺式混合器 ... 35
圖 3. 15 聚合脢連鎖反應示意圖... 37
圖 3. 16 聚合脢連鎖反應複製 DNA 片段示意圖 ... 38
圖 3. 17 聚合脢連鎖反應器... 38
圖 3. 18 電泳槽 (含瓊脂膠體) ... 40
圖 3. 19 膠體電泳分析影像... 40
圖 3. 20 掃描式電子顯微鏡 (型號：S-4700) ... 42
圖 3. 21 離子覆膜機 (型號：E-1010)與 SEM 專用載物台 ... 42
圖 3. 22 硬體實體圖... 43
圖 3. 23 X 光元素分析系統硬體示意圖 (圖片來源：網路) ... 43
圖 3. 24 元素週期表... 44
圖 3. 25 壓克力圓筒及搗實棒... 47
圖 3. 26 改良砂土試體... 47
圖 3. 27 量測超音波脈衝示意圖... 48
圖 4. 1 菌種編碼... 51
圖 4. 2 各微生物於第六天之碳酸鈣沉澱量... 54
圖 4. 3 菌種編號 022 之菌落觀察... 54
圖 4. 4 菌種編號 026 之菌落觀察... 55
圖 4. 5 菌種編號 022 革蘭氏染色於光學顯微鏡油鏡下之貌... 57
圖 4. 6 菌種編號 026 革蘭氏染色於光學電子顯微鏡油鏡下之貌... 57
圖 4. 7 染色體 DNA 萃取後膠體電泳分析照片 ... 58
XIV
圖 4. 8 菌種編號 022 DNA 序列比對結果 ... 58
圖 4. 9 菌種編號 026 DNA 序列比對結果 ... 58
圖 4. 10 檢量線... 60
圖 4. 11 Thermus 培養液內不含尿素對銨離子與 pH 值之影響 ... 61
圖 4. 12 Thermus 培養液內含尿素濃度 5 g/L 對銨離子與 pH 值之影響 ... 61
圖 4. 13 Thermus 培養液內含尿素濃度 10 g/L 對銨離子與 pH 值之影響 ... 62
圖 4. 14 Thermus 培養液內含尿素濃度 15 g/L 對銨離子與 pH 值之影響 ... 62
圖 4. 15 Thermus 培養液內含尿素濃度 20 g/L 對銨離子與 pH 值之影響 ... 63
圖 4. 16 不同尿素濃度對微生物生長之影響... 63
圖 4. 17 不同尿素濃度對銨離子濃度變化之影響... 64
圖 4. 18 不同尿素濃度對 pH 值變化之影響 ... 64
圖 4. 19 氯化鈣添加時機對微生物生長之影響... 65
圖 4. 20 氯化鈣添加時機對碳酸鈣沉澱量之影響... 66
圖 4. 21 不同離心時間之碳酸鈣沉澱量... 67
圖 4. 22 離心三十分鐘之上清液與沉澱物之碳酸鈣濃度... 68
圖 4. 23 菌種編號 022 與 026 之生長曲線... 68
圖 4. 24 菌種編號 022 與 026 之銨離子濃度... 69
圖 4. 25 菌種編號 022 與 026 之菌液酸鹼度... 69
圖 4. 26 菌種編號 022 與 026 之碳酸鈣沉澱量... 70
圖 4. 27 革蘭氏染色後之砂土於光學顯微鏡下造影顯像... 71
圖 4. 28 未改良之乾砂在 SEM 下造影顯像 ... 73
圖 4. 29 以菌種編號 022 對砂土改良在 SEM 下造影顯像 ... 74
圖 4. 30 混合菌種編號 022 及 026 對砂土改良在 SEM 下造影顯像 ... 75
圖 4. 31 未改良之乾砂之元素分佈 (紅點：O、綠點：Si) ... 76
圖 4. 32 未改良乾砂之元素分析... 76
XV
圖 4. 33 以菌種編號 022 改良砂土試體之元素分佈... 77
圖 4. 34 以菌種編號 022 改良砂土試體之元素分析... 77
圖 4. 35 以菌種編號 022 及菌種編號 026 改良砂土試體之元素分佈... 78
圖 4. 36 以菌種編號 022 及菌種編號 026 改良砂土試體之元素分析... 78
圖 4. 37 以微生物改良砂試體之波速變化... 80
圖 5. 1 可視化直剪盒設計圖... 84
圖 5. 2 應用於邊坡整治工程需考量因素之魚骨圖說明... 85
圖 A. 1 各微生物於第六天之微生物生長情形 ... i
圖 A. 2 各微生物於第六天之 pH 值 ... ii
圖 A. 3 各微生物於第六天之銨離子濃度 ... ii
圖 A. 4 菌種編號 022 DNA 定序結果 (530 f) ... iii
圖 A. 5 菌種編號 022 DNA 定序結果 (1220 r) ... iv
圖 A. 6 菌種編號 026 DNA 定序結果 (530 f) ... iv
圖 A. 7 菌種編號 026 DNA 定序結果 (1220 r) ... v
圖 B. 1X 光繞射分析微生物改良砂土結果 (XRD) ... vi
圖 B. 2 彎曲元件 (bender)測試未改良砂土波速結果 ... vii
圖 B. 3 圓柱試體剪應力與應變曲線圖 ... viii
圖 B. 4 圓柱試體剪應力與正向應力曲線圖 ... viii
圖 B. 5 方形試體剪應力與應變曲線圖 ... ix
圖 B. 6 方形試體剪應力與正向應力曲線圖 ... ix
1
第一章 緒論
1.1 研究動機
沉積岩的成岩過程為風化、搬運、堆積、壓實、膠結、成岩。而早先之地球 科學對成岩礦化過程之認知，認為應是物理式的溫、壓效應；以及化學式的元素 融合所形成。1960 年代，便有學者針對普遍存在於岩、土地質之微生物進行研 究探討，發現沉積岩的膠結強化過程中，微生物確有其作用之機轉參與，並扮演 著重要的影響因子，而氧、硫及碳等化合物確由微生物作用產生。亦即自然界中 微生物之成岩礦化作用普遍存在。
而台灣地處板塊交界，地震頻繁，造就台灣山多平地少之地形，又位於亞熱 帶地區，氣候多變化，南北向狹長，颱風夾帶豪雨沖刷山坡地，加上人為開發，
容易發生邊坡災害。回顧傳統大地邊坡整治工法多為物理式(如重力式擋土牆等) 及化學式(如灌漿工程等)，雖能快速達到鞏固邊坡的效果，但就永續工程之期效 與地下水文等環境保護立場，可能不是最佳之解決方案。鑑於邇來微生物工程之 應用發展方興未艾，故藉由微生物在自然界中的成岩成礦作用之觀點，為大地防 災與地質改良添增一整治思維與方法，對長效式與生態環境考量下之邊坡整治工 程，確可提供另一輔助改良之選項。
1.2 研究目的
依上述對微生物在岩石之成岩礦化的重要性，主要以微生物引致碳酸鈣沉澱，
並於砂土顆粒間產生膠結，進而強化砂性土壤之抗剪強度。由文獻得知，微生物 引致碳酸鈣沉澱之生化機制為微生物吸收環境中之尿素，由其體內一種酵素－尿 素酶將尿素分解成氨 (NH3，俗稱阿摩尼亞)及二氧化碳 (CO2)，由於氨溶於水為 鹼性物質，釋放至環境中會使其週遭環境酸鹼值 (以下簡稱 pH 值)增加，而碳酸 鈣於鹼性環境下較易沉澱；進而強化膠結。
2
本研究目的在從台灣本土土壤中篩選出具有引致碳酸鈣沉澱之微生物，利用 其可引致碳酸鈣沉澱之能力改良砂性土壤，使碳酸鈣附著於砂顆粒表面，產生膠 結作用，以提升土體之抗剪強度，藉由非破壞之掃描式電子顯微鏡配合元素分析，
觀察改良前後砂顆粒表面影像與元素變化，以及超音波脈衝檢測砂土試體改良後 之成效。
1.3 範圍與方法
研究統整出以材料 (material)、方法 (method)、量測 (measure)的概念進行實 驗。土壤樣本採集地點之選擇，則以求項綜整之原則研判進行依據文獻所提微生 物引致碳酸鈣機制從土樣中篩選出合適之微生物，就培養環境及影響碳酸鈣沉澱 因子做系列實驗，發展出一套微生物篩選與土壤改良技術，並對其引致碳酸鈣沉 澱機制作探討。再將微生物改良之砂性土壤，以掃描式電子顯微鏡觀察砂顆粒表 面於改良後產生之膠結物影像，並配合元素分析得到改良前後元素之變化，最後 藉由非破壞檢測之超音波脈衝試驗，檢測改良前後之砂土試體之剪力波速變化，
進行微生物改良成效之化性、物性驗證。
3
1.4 內容與架構
本研究為微生物與大地工程之跨領域整合研究，發展一套篩選方法，從台灣 本土土壤中找出具有引致碳酸鈣沉澱物能力的微生物，應用於砂土改良上，以微 觀方式觀察微生物引致之碳酸鈣膠結於砂顆粒表面並分析改良試體前後元素之 變化，除外，再與文獻提出之碳酸鈣沉澱機制作比較探討，最後利用非破壞超音 波脈衝檢測改良試體波速之變化。圖 1. 1 為本研究之研究流程圖，各章節內容簡 述如下：
第一章：緒論
簡介研究動機、目的、研究方法與內容。
第二章：文獻回顧
對微生物在地質演化過程中之成岩成礦作用做介紹；以巴氏芽孢桿菌為例，
說明其碳酸鈣沉澱之生化機制，以及國內外學者應用巴氏芽孢桿菌於大地工程基 礎土壤改良及建物混凝土裂隙修補。
第三章：研究儀設與方法
主要分成微生物生化實驗、掃描式電子顯微鏡微觀觀察與元素分析、以及非 破壞超音波脈衝檢測，針對各實驗之方法原理、步驟與儀設做介紹。
第四章：試驗結果與討論
菌種篩選過程與基因序列比對結果；探討變更尿素濃度對銨離子與 pH 值之 影響；氯化鈣添加時機、酸鹼值、以及銨離子濃度對碳酸鈣沉澱量之影響；將改 良前後之砂試體以掃描式電子顯微鏡觀察，同時並施作元素分析；最後再以非破 壞超音波脈衝檢測改良成效。
第五章：結論與建議
初步討論本研究方法使微生物引致碳酸鈣沉澱之機制，並與文獻作比較驗證；
針對非破壞檢測結果提出改善改良砂試體之方法，並嘗試提出「可視化」直剪試 驗配合質點影像測速儀之技術研製，藉以觀察試體在受剪過程中，其微觀變形場
變化及其微微觀破壞特徵徵。
圖 1
4
. 1 研究流流程圖
5
第二章 文獻回顧
2.1 微生物於大地工程之作用
微生物普遍存在於環境中，而土壤對微生物來說，是很適合的生長環境，平 均每公克的土壤中，大約有 106~107個微生物存在。由於微生物無法以肉眼看到，
需借助顯微鏡才可觀察，在顯微鏡發明以前，並不知道其存在。直到十七世紀，
荷蘭人李文霍克 (Antony van Leeuwenhoek)利用自製之簡易顯微鏡，蒐集不同來 源的樣品觀察，發現不論從何處取回之樣本均可看到不同形態的小生物。自微生 物被發現後，開始有許多學者針對這微小的生物做研究，並應用於醫學、農業、
工業，如抗生素、疫苗、殺蟲劑、釀酒、分解塑膠或石油等。
微生物分佈之範圍很廣，且繁殖迅速，絕大多數的微生物以分裂生殖方式繁 殖後代，其生殖速率按等比級數增加，完成一代繁殖之時間極短，當生理狀態及 生存環境不受阻礙且條件適宜，則每 20 到 30 分鐘便可繁殖一代，其生長普遍需 要之營養源如圖 2. 1，又微生物體積小，具有極大的比表面，可與外界環境密切 接觸，易受環境條件影響，故其有很高的代謝速度，對環境適應力很強，圖 2. 2 說明微生物分類與其構造及生長特性。
微生物的機制對地球的形成與生物演進相當重要，其普遍存在於地球生態中，
生物代謝過程所攝取環境中之物質及代謝之產物，均會使自然界產生微觀變化 (Mitchell et al.,2005)，而微觀影響巨觀，進而使巨觀改變。過去土木工程分析土 壤行為多以力學機制、地質形成過程、岩石礦物成分等解釋之，近年來對於微生 物在地球科學上的演化做了許多研究，微生物遍佈在近地表的土壤及岩石中，參 與了地球化學反應之過程，生物活動在大地工程領域上之對土壤機制行為影響很 大並扮演著重要角色，由其是對粒狀土壤，微生物可改變粗糙粒狀的土壤行為(包 括水力傳導系數、分佈及強度等)、增加地質中化學反應的速率、提升風化的速 度，也會改變樣本之化學及物理性質，，而土壤經由生物固結處理後，單一生物
之尺尺寸增加與
圖
圖
與土壤顆粒經
圖 2. 1 普遍
圖 2. 2 微生物
經由固結作
遍微生物生長
物分類與其
6
作用而粒徑增
長所需之營
其構造及生
增加 (如圖
營養源 (Mit
生長特性 (M
2. 3)。
tchell, 2005
Mitchell, 200 5)
05)
.1 微生物 「微生物
、聚集元素 錫根，微生 化學作用(如 與機制較不 層及地上沉 用之研究才 gne 等人認 有異養微生 鹽類，主要 結合的微生 的作用，遠大 結核的形成 屬礦物死亡
圖 2. 3 土壤
物之成岩成
物成礦作用是 素形成礦床或 生物成礦學，
如元素融合) 不重視，然而 沉積岩，生物 才在國際間有 認為，在金屬 生物之參與，
要是由微生物 生物成礦作用 大於單純化 成；與微生物 亡後，可直接
壤粒徑與微
成礦作用
是指微生物 或礦化菌體
，2000) 。」
)和物理作用 而生物成礦作 物成礦作用是
有了進展，
屬元素的表面
，Ehrlich 在 物所形成的 用進行許多 化學沉澱，並 物的生化作用
接堆積形成
7
微生物尺寸
物及其代謝作 體自身直接堆
」過去地球 用(如溫、壓
作用研究已 是三大成礦 並發表越來 面遷移和聚 在 1981 年研 的。而閻葆瑞 多的研究，發
並透過現代 用有密切關 成多金屬結核
寸關係 (Mitc
作用所產生 堆積形成有 球科學所學習
壓效應)，對 已將近一個 礦作用之一 來越多生物 聚集過程，以 研究顯示，一 瑞等人自 19 發現微生物對 代和化石微生 關聯，且微生
核 (閻葆瑞
chell, 2005)
生的有機質參 有用礦產的作 習到地球地 對於微生物在
世紀，但發
，直至七○
物參與成礦作 以及之後的
一些硫化物 985 年以來 對鐵、錳的 生物研究，
生物在吸收
，1994)。
)
參與成礦或 作用 (閻葆 地質形成過程 物在地質演化
發展較慢，在
○年代之後 作用之證據 的再沉積作用
物、氧化物和 來，對海洋多 的轉移及沉積 證明深海多 收或吸附大量 或分 葆瑞、
程僅 化之
在地
，此 據。
用中 和碳 多金 積所 多金 量的
8
微生物數量繁盛，種類眾多，細菌、真菌、及藻類均遍佈於地球上各種環境 中，因其生理作用多樣，分佈範圍極廣，在岩石、礦物的沉積作用中，均參與扮 演相關之地質作用過程。其活動及代謝作用，可改變成礦的物理和化學環境，且 微生物個體本身及其生命活動可吸附或吸收成礦元素直接沉澱和聚集成礦物。在 海洋沉積物中，大量的各類微生物活動對沉積岩之性質及岩石成岩成礦作用有很 大的作用，如微生物活動使有機物分解產生腐植質，在鹼性環境中，有鈣鹽出現 時，微生物可促使鈣的沉澱等。在成岩過程早期壓實作用階段快速凝聚形成的結 核，通常由方解石 (Calcite)，成分為碳酸鈣 (CaCO3)組成，在結核中可發現未被 壓縮且保存完好的微生物化石，證實微生物活動之產物可引起膠結物之沉澱 (閻 葆瑞，2000)。
微生物的海洋中成岩作用研究，Murray 和 Irvine (1989)首先研究碳酸鈣沉澱，
認為碳酸鈣之沉澱乃由碳酸銨及硫酸鈣之作用所產生的，其化學式如下：
(NH4)2CO3 + CaSO4 → CaCO3 + (NH4)2SO4 碳酸銨是來自銨 (NH4+
)與二氧化碳 (CO2)，細菌所產生的銨是吸收環境中 之蛋白質物質，以其體內蛋白脢分解所產生，銨的產生使海水酸鹼值增加，而促 進碳酸鈣的沉澱 (Moberg et al., 1934)，除了分解蛋白質物質所釋放出之氨外，某 些微生物能將硝酸鹽還原成氮或銨，使水成鹼性，促使碳酸鈣及碳酸鎂的沉澱。
關於碳酸鈣沉澱之作用，還有其他機制：
1、在海水中碳酸鈣沉澱主要是由於細菌對有機鈣鹽的氧化作用：
Ca(COOCH3)2 + 4O2 → CaCO3 + 3CO2 + 3H2O 2、硫酸鹽細菌的還原作用，造成碳酸鈣沉澱：
CaSO4 + CH3COOH → CaCO3 + H2S + H2O + CO2
3、海洋中碳酸鈣的沉澱是由於脫氮細菌的作用所造成，其中做為作用物之氫與 探來自有機物在厭氧情況下的氧化作用：
Ca(NO3)2 + 3H2 + C → CaCO3 + 3H2O + N2
9
了解微生物參與岩石的成岩成礦的過程，除海洋沉積岩外，在自然界中常見 的自然膠結材有氧化矽、碳酸鈣、黏土等，而本文以微生物引致碳酸鈣沉澱機制；
應用於大地工程中與防災為探討對象。
2.1.2 微生物引致碳酸鈣沉澱之生化機制
微生物在成岩成礦作用中，主要作為填補岩、土孔隙材料。及為普遍存在 於自然界中。常見的膠結材有氧化矽、黏土、及碳酸鈣等。Marry 與 Irvine (1989) 為海洋微生物之研究先驅，並發現微生物確實可以引致碳酸鈣沉澱，Kroll 於 1990 年研究巴氏芽孢桿菌 (Bacillus pesteurii，如圖 2. 4)，針對微生物引致碳酸鈣沉澱 提出其生化機制。其研究顯示，巴氏芽孢桿菌會吸收環境中的尿素 (Urea)作為 能量來源，以其體內之尿素脢 (Urease)分解尿素產出氨(NH3，俗稱阿摩尼亞)溶 於水後可分離出銨離子與氫氧根離子釋放到環境中 (式 2-1)，使其週遭環境之酸 鹼值上升，導致鈣離子 (Ca2+)與碳酸根離子 (CO32-
)結合生成碳酸鈣而沉澱 (式 2-2)，化學式如下：
NH2－CO－NH2 + 3H2O → 2NH4+
+ 2OH- + CO2
(2-1) Ca2+ + CO32- → CaCO3↓ (2-2) Cell－Ca2+ + CO32
- → Cell－CaCO3 (2-3) Fischer (1999)依據 Kroll 所提出之碳酸鈣沉澱生化機制檢測並證實了巴氏芽 孢桿菌引致碳酸鈣沉澱的生化性質 (如圖 2. 5)，以 X 光繞射分析砂土內之礦物 沉澱物定量並證實巴氏芽孢桿菌引致的碳酸鈣晶體為方解石 (Calcite)，如表 2. 1，
四個砂試體分別處理：(1) 巴氏芽孢桿菌、培養液，(2) 死亡之巴氏芽孢桿菌、
培養液，(3) 僅培養液，(4) 未處理之乾砂，一號砂試體吸收尿素、產生碳酸鈣，
其他三個砂試體並無生成碳酸鈣。於 SEM 下發現巴氏芽孢桿菌被碳酸鈣晶體包 覆圍繞著，像中心核 (如圖 2. 6、式 2-3)，進而使微生物尺寸增加 (如圖 2. 7)，
表示方解石礦物是由微生物所引致形成的，而 DeJong (2006)同樣以巴氏芽孢桿
改良砂土，並 色的物質即
微生物引
，產生氨後溶
，所能製造 ease)，為一種 mati and Vo 酵素之碳酸 9。
並以 SEM 觀 即為碳酸鈣沉 引致碳酸鈣之
溶於水，為 造的環境酸
種酵素。尿 ordouw (20 酸鈣沉澱研究
圖
觀察改良砂 沉澱。
之機制中使 為鹼性物質 酸鹼值則越鹼
尿素脢可將微 003)利用尿 究，並應用於
圖 2. 4 巴氏芽
10
砂試體前後
使酸鹼值升高
，當微生物 鹼。而微生 微生物吸收 尿素脢分解尿 用於 Berea 砂
芽孢桿菌
後之微觀變化
高的原因為 物分解尿素能
生物分解尿 收之尿素分解
尿素在引致 砂岩孔隙修補
(Times, 200
化(如圖 2. 8
為微生物分 能力越強，
尿素的主要物 解為氨及二 致碳酸鈣中之
補之強化研
07)
8)，砂土顆粒
分解環境中之 所生成的氨 物質為尿素 二氧化碳釋出 之功能，進行 研究，結果如
粒間
之尿 氨越 素脢 出，
行單 如圖
圖 2. 5
表 2.
5 巴氏芽孢
1 以 X 光繞
孢桿菌引致碳
繞射分析砂
11
碳酸鈣沉澱
砂土改良前後
澱之生化性質
後成分變化
質 (Fischer
化 (Fischer, r, 1996)
1996)
圖
圖 2. 6 巴
圖 2. 7 微生
巴氏芽孢桿 (Fischer, 19
生物引致碳
桿菌引致碳 996)
碳酸鈣沉澱前
12
碳酸鈣沉澱於
前後之尺寸
於掃描式電
寸變化過程
電子顯微鏡下
。(Mitchell
下之影像
et al., 20055)
圖
圖 2. 8 巴氏氏芽孢桿菌改
(a)
(b)
(c) 微生
(d) 微生 改良砂土於
13
未處理之乾
) 石膏膠結
生物引致輕量
生物引致重量 於掃描式電子
乾砂
結砂
量碳酸鈣
量碳酸鈣
子顯微鏡下下之影像 (DDeJong, 20006)
圖 2. 9 B (N
2 微生物
微生物引 2.7 ㎜，並 較高的剪力 顆粒形成較 生物、營養 ogrout)改良 有很多，如機 漿。主要考量 都有其利弊 物式改良土
。
Berea 砂岩以 Nemati and
物技術於大
引致碳酸鈣沉 並可將粒狀材 力強度及較低 較佳之組構。
養鹽、pH 值 良基礎地盤固
機械式之動 量著重於改 弊，但持續研 土壤系統 (如
以酵素水解 d Voordouw,
大地工程
沉澱的作用 材料 (如 10 低的透水性
。除了做為 值調整劑，利
固結之工法 動力壓密、填 改良均勻性
研究創新確 如圖 2. 10)，
14
解尿素生成碳 , 2003)
程之應用
用被發現可用 0 % 矽與 性，此微生物 為裂隙修補外
利用微生物 法。目前用來
填土壓密等
、改良成本 確是有其必要
，說明微生
碳酸鈣改良
用
用來作為裂 90 % 砂)混 物技術可提供
外，寺島麗 物代謝作用使
來作為改良 等，以及化學 本、以及環境 要。DeJong 生物改良砂土
良前後之孔隙
裂隙修補，有 混合巴氏芽孢
供一長期且 麗等人(2009) 使其固化，
良砂土工程性 學式之水泥 境衝擊等，
g 等人 (200 土可改善現
隙透水率
有效裂隙平均 芽孢桿菌，可
且有效的膠結 )於矽砂內注 開發生物灌 性質之技術 泥系、化學系
各種既有之 09)提出綜述 現地的土壤性
均寬 可產
結強 注入 灌漿 術方
系之 之方 述微 性
圖
.1 微生物 砂性土壤 1 可說明微 見之處作用
Jong 等人 ( 作膠結材改
增加砂土凝 以超音波脈
除了巴氏 中的水採取
06)所做之大 能於地盤固 象」(圖 2. 1 試驗過程中 砂試體部分 質固化現象
圖 2. 10 微生
物對砂土不
壤顆粒大小對 微生物與砂土 用，使土壤顆
(2006)則利 改良渥太華標
凝聚力，參 脈衝及三軸壓 氏芽孢桿菌，
取微生物來源 大地力學超 固化的方法評
4)，這是經 中由下往上注 分並未完全浸 象帶來的結果
生物式改良土
不排水剪力
對微生物來 土、粉土、
顆粒與顆粒 利用巴氏芽孢
標準砂，其認 參考 Fischer
壓密試驗砂 日本東京大 源，進行微 超音波非破壞
評估。他們也 經過試驗後取
注入與微生 浸濕而造成 果誤差。
15
土壤系統綜
力強度改良
來說足以讓微 與黏土之大 粒間產生膠結
孢桿菌引致 認為碳酸鈣 (1999)培養 砂土改良前後
大學杉本大 微生物引致 壞檢測方式 也發現了試 取出之砂試 生物混合之溶 成此現象，因
綜述 (DeJon
良之影響
微生物於砂 大小關係，
結作用，並 致碳酸鈣沉澱
鈣膠結物可使 養及改良砂土 後之差別 (結 大輔與桑野玲 致碳酸鈣膠結 式 (儀設如圖
試體改良不均 試體，其可自 溶液，目的在 因此，本研究
ng et al., 200
砂土顆粒與顆 微生物可於 並可幫助做微
澱之能力，
使砂顆粒與 土之方式進 結果如圖 2 玲子於神奈 結物實驗 圖 2. 13)，進
均勻產生的 自立，造成 在達到砂試 究在實驗過
09)
顆粒間移動 於人類肉眼 微裂隙修補
將碳酸鈣沉 與顆粒間產生 進行砂土改良
2. 12)。
奈川縣平塚市
，參考 DeJ 進行利用為生
的「不均質固 成此現象之原 試體均勻改良 過程中需克服
動，圖 眼不 補，
沉澱 生膠 良，
市池 Jong 生物 固化 原因 良，
服不
圖 2
圖 2. 12
2. 11 土壤顆
以微生物改 (DeJong, 2
顆粒與微生
改良砂土前 006)
16
生物大小之比
前後隨著應變
比較 (Mitch
變增加之波
hell et al., 2
波速與剪力強 2005)
強度變化
圖
圖
.2 微生物 許多大地 工程之基礎
圖 2. 13 超
圖 2. 14 不均
物技術應用
地領域學者利 礎土壤改良及
超音波脈衝結
均質固化現
用於混凝土
利用巴氏芽 及建物混凝
17
結合三軸試
現象 (杉本大
土修復及土
芽孢桿菌能夠 凝土裂隙修補
試驗 (Wicak
大輔與桑野
土壤改良
夠引致碳酸 補等，Bang
ksono, 2007
野玲子，200
良
酸鈣沉澱之特 等人在 20
7)
09)
特性，發展在 001 年時研究
在大 究巴
18
氏芽孢桿菌引致碳酸鈣沉澱應用於混凝土裂隙修補中，混凝土的酸鹼值相當高，
為確保巴氏芽孢桿菌可於混凝土中存活，他們將微生物固定於聚氨脂
(Polyurethane，簡稱 PU)聚合物、石灰、矽煙 (silica fume)，以及飛塵 (fly ash) 中，再置入混凝土裂隙內，靜置室溫 28 天後，量測其勁度增加之百分比，發現 將微生物固定於 PU 聚合物內所增加的勁度百分比高於其他物質，並探討不同的 裂隙大小與混凝土試體尺寸之改良成效。
除了國外學者將巴氏芽孢桿菌應用於大地工程外，國內亦逐漸重視微生物在 大地工程上之應用。中興大學執行經濟部水利署之研究計畫 (2007)，探討細菌 應用於混凝土修復及淤泥固結之開發研究，探討巴氏芽孢桿菌尿素脢活性及不同 pH 值對巴氏芽孢桿菌生長之影響，並改變淤泥內不同水泥系材料 (如爐石與飛 灰)及水泥的添加量、環境養護溫度等，觀察巴氏芽孢桿菌固化淤泥之成效。
Fischer (1999)利用巴氏芽孢桿菌以其體內尿素酶分解環境中尿素，提升環境 pH 值，進而使鈣離子與碳酸根離子較易結合之特性，改良砂性土壤，從掃描式 電子顯微鏡下觀察發現碳酸鈣確實能膠結砂土顆粒，DeJong (2006)以等向壓密不 排水三軸試驗配合超音波脈衝檢測砂土改良於力學上之變化，於 2009 年更利用 大尺度之實驗室實驗，以模擬現地進行土壤地盤改良之情形。
卓雨璇 (2007)嘗試從台灣本土土壤找出具有引致碳酸鈣沉澱能力之微生物，
應用於邊坡地質改良之初探，與春泉生技股份有限公司合作進行產學計畫。
以多 力，
之化
3.1
3.1
生土 則選
本研究目 多菌式 (即多
，進而提升土 化學藥品、
1 微生物
微生物生
.1 土壤樣 本實驗土 土石流者，
選擇花蓮光 將採集回
第三
目的在於篩選 多菌種)改良 土體之剪力
材料、儀器
物之分離與
生化實驗內容
樣本處理與
土壤樣本有二 故土樣來源 光復鄉大興村 回來之土樣以
三章 試
選出台灣本 良粒狀土壤 力波速。規劃
器和設備一
與生理生
容與流程整
圖 3. 1 微
與菌種分離
二，採集地點 源一為屏東 村 (定位如圖 以去離子水
19
試驗儀
本土土壤中，
壤，使其顆粒 劃一系列研 一一列出。
生化實驗
整理如下圖 3
微生物生化實
離、純化
點選擇方法 東墾丁 (定位
圖 3. 3 星號 水做序列稀釋
儀設與方
，具有引致碳 粒間產生碳 研究方法說明
驗
3. 1，本章節
實驗流程圖
法為找該土壤 位如圖 3. 2 星 號處)。
釋至 10-5，去
方法
碳酸鈣沉澱 碳酸鈣膠結物
明如下，並
節將以此流
圖
壤中具有碳 星號處)，另
去離子水為
澱物之微生物 物，增加凝 並將實驗中所
流程做介紹
碳酸鈣者與易 另一土樣來
為水經過純化 物，
凝聚 所需
：
易發 來源
化除
去較 等。
固化
℃)培 一個 養基 他菌
較活躍不穩
。取 0.1 ml 之 化之培養基
培養之。待 個個分散開 基上各菌落 菌，此步驟
穩定之離子如 之 10-3、10 基)上，以小玻
待該土樣中適 開的菌落 (如 落挑出，以三 驟為菌種純化
如鈣離子 (C 0-4、10-5土壤 玻璃珠將土
適應培養基 如圖 3. 4)，即 三區畫線方式
化。
圖 3. 2 屏
20
Ca2+)、鎂離 壤稀釋溶液 土壤稀釋溶液
基生存環境之 即菌種分離 式將菌劃開
屏東墾丁採
離子 (Mg2+
液分別滴於固 液均勻塗開
之微生物生 離。再以高溫 開，使其大量
採集點位置
+)、鐵離子 固態培養基 開，置於室溫
生長，會在培 溫高壓滅菌 量生長與檢
(Fe2+、Fe 基 (加入洋菜
溫 (約 22℃
在培養基上形 菌過之竹籤將 檢視是否參雜
3+) 菜粉
℃~25 形成
將培 雜其
圖 3. 3 花蓮光
圖 3
21
光復鄉大興村
. 4 分離之
村土壤採集
之菌落
集地點
22
3.1.2 菌種篩選與培養基選擇
將採集回來之土壤樣本經序列稀釋後，依據 Kroll (1990)研究巴氏芽孢桿菌 (Bacillus pasteurii)引致碳酸鈣沉澱，認為可能之生化機制：微生物吸收環境中的 尿素 (Urea)，以其體內的一種酵素－尿素脢 (Urease)，將尿素分解成氨 (NH3) 及二氧化碳 (CO2)釋放至環境中，由於氨溶於水為鹼性物質，釋放至環境中會使 其週遭酸鹼值升高，而碳酸鈣在偏鹼的環境下較容易沉澱。化學式如下：
NH2 – CO – NH2 + 3H2O → 2NH4+ + 2OH- + CO2
Ca2+ + CO32- → CaCO3
從土樣中篩選出具有引致碳酸鈣沉澱能力較佳之微生物作為本研究主要使用的 菌種，篩選方法分為三步驟 (流程圖如圖 3. 5)，第一步限制生長環境，調整培養 基組成，僅以尿素作為營養氮源，在此培養基上可生長之微生物即為具有可分解 尿素能力之微生物；第二步為測試微生物之酸鹼值，將第一步篩選出之微生物從 培養基轉移至培養液內，以 pH 試紙測試培養液之酸鹼值，挑選出使培養液偏鹼 之微生物，第三步則是檢測碳酸鈣沉澱的量來決定本研究將使用的菌種。
培養基由於加入之凝固劑 (洋菜粉，agar)含量不同，可將培養基分為固體 (solid)、半固體 (semi-solid)、液體 (liquid)培養基三類，於本實驗中僅使用固體 及液體培養基，內文中將固體培養基稱為培養基，液體培養基稱為培養液。
本研究在微生物生化實驗中將使用之培養基為 UF 培養基、Thermus 培養基、
LB 培養基以及 M9 培養基。調整 UF 培養基之化學成分以符合限制微生物生長 環境，作為第一步菌種篩選之用，Thermus 培養基與 LB 培養基則擇一作為後續 培養及改良砂土之營養液之用，選擇方法是將第一步篩選出來之微生物種入 Thermus 或 LB 培養液內，經 pH 試紙測試個別含菌培養液 (簡稱菌液)之酸鹼度 選擇可使菌種產生較高 pH 值者。
23
(1) 修飾過的 UF 培養基
每公升溶液中添加之化學成分與重量或體積分別為 fructose 10 g、peptone 10 g、yeast extract 10 g、urea 2 g 及 10 倍的 salt solution 100 ml，視實驗需要加入 15 g 的洋菜粉 (Agar)。而 10 倍的 salt solution 配製之化學成分，每公升溶液中含有 NaCl 5 g、MgSO4 0.2 g、CaCl2 0.02 g、(NH4)2SO4 1 g。欲調配固態培養基，則加 入 15 g 之洋菜粉使容液凝固即可。本研究在上述說明篩選菌種步驟中，第一步 為限制生長環境，因 Kroll (1990)提出之微生物引致碳酸鈣沉澱機制說明巴氏芽 孢桿菌具有尿素脢 (urease)可分解環境中之尿素，在此假設微生物引致碳酸鈣沉 澱需要能分解尿素之能力，因此在第一步篩選擇將 UF 培養基調整為每公升溶液 含有 glucose 10 g、urea 2 g、10 倍的 salt solution 100 ml。將 fructose (果糖)改為 glucose (葡萄糖)，兩者皆為單醣，但葡萄糖較果糖容易吸收，而微生物生存不外 乎吸收碳源及氮源，其他化學成分如 peptone 及 yeast extract 則不添加，減少微 生物其它的營養來源，強迫微生物吸收葡萄糖及尿素作為碳與氮之營養源，在此 培養基可生存之微生物，即為可分解尿素者。
(2) Thermus 培養基 (Ramaley and Hixson, 1970)
每公升溶液中添加之化學成分與重量或體積分別為 Peptone 3 g、yeast extract 1 g、Glutamic acid 1 g、10 X Castenholz Basal salts 100 ml，最後將最終 pH 值調 整到 7.8，欲製作固體培養基擇加入 20 g 之洋菜粉 (agar)。10 倍的 Castenholz Basal salts 配製之化學成分，每公升溶液中含有 Nitrilo triacetic acid
( C6H7NO6Na2) 1 g、CaSO4‧2H2O 0.6 g、MgSO4‧7H2O 1 g、NaCl 0.08 g、KNO3 1.03 g、NaNO3 6.89 g、Na2HPO4 1.11 g、FeCl3溶液 (14 g/L) 200 ml、Nitsch’s trace elements 溶液 10 ml。其中 Nitsch’s trace elements 溶液配製之化學成分，每公升 溶液中含有 H2SO4 0.5 g、MnSO4‧H2O 2.2 g、ZnSO4‧7H2O 0.5 g、H3BO3 0.5 g、
CuSO4 0.016 g、Na2MoO4‧2H2O 0.025 g CoCl2‧6H2O 0.046 g。
Peptone (蛋 微生物之豐 多醣類，提 LB 培養基 每公升溶 ract 10 g、N 過胰臟消化
M9 glucose 每公升溶 urea 1 ml、
10 倍的 salt
、NaCl 0.5 培養基調 作。
蛋白腖)為由 豐富的蛋白質 提供微生物生
基
溶液中添加之 NaCl 5 g，將 化脢分解後之
e-urea 培養基 溶液中添加之
1 M MgSO t solution 配
g、NH4Cl 調配完成後，
由豆類、奶 質來源，yea 生存所需之
之化學成分 將最終 pH 值
之產物，可
基
之化學成分
4 1 ml、Ca 配製之化學成
1 g。
，均須以高
圖 3. 5
24
奶類、蛋類 ast extract (酵 之醣類。
分與重量或體 值調整至 7.
可作為微生物
分與重量或體 aCl2 0.1 ml
成分，每公升
高溫高壓滅菌
菌種篩選步
、肉類等合 酵母萃取物
體積分別為 5。Trypron 物豐富的胺
體積分別為
，視實驗需 升溶液中含
菌鍋 (autoc
步驟流程
合成之有機化 物)是一種由
為 tryptone 1 e (胰化蛋白 胺基酸來源
為 20 % gluco 需要加入 15
含有 Na2HPO
clave，如圖
化合物，可 由酵母菌萃取
0 g、yeast 白腖)為 pep
。
ose 10 ml、
g 的洋菜粉 O4 6 g、KH2
圖 3. 6)進行滅 可提
取出
ptone
20 粉。
2PO4
滅菌
.3 銨離子
為得知篩 究參考環保 氨氮及銨離 kaline citrat 醯鐵氰化鈉 分光光度計 濃度，水樣中 化碳，氨溶於 得知微生物 同濃度的標
繪出吸光值 與回歸式，
圖 3. 6
子濃度檢測
篩選出之微生 保署 NIEA W 離子之溶液中 te solution) 鈉溶液 (Sod 計 (如圖 3. 7
中氨氮濃度 於水為鹼性 物生成之氨濃 標準氨氮溶液 值與標準氨
再將待測溶
6 高溫高壓
測法與 pH
生物其分解 W448.51B 水 中加入酚溶
，與樣本溶 ium nitropr 7)於波長 64 度即為銨離子 性物質，形成 濃度。為進行 液，按照上 氨氮溶液濃度
溶液之吸光
25
壓滅菌鍋 (型
H 值測試
解尿素 (或其 水中氨氮檢 溶液 (Pheno
溶液內之銨離 russide)催化 40 nm 處進
子之濃度，
成銨離子與 行銨離子濃 上述之方法加 度之關係圖 光值代入回歸
型號：AS-1
其他蛋白質 檢測方法－靛
l solution)及 離子反應並 化此溶液之後 進行比色分析
微生物將環 與氫氧根離子
濃度檢測，須 加入化學藥 圖，利用回歸
歸式即可得 1060 L)
)產生之銨離 靛酚比色法 及鹼性檸檬 並使樣本溶液
後會使顏色 析，即可求
環境中尿素 子，藉由量 須以氯化銨 藥劑使其反應
歸得出回歸 得該樣本溶液
離子濃度，
法。此法是將 檬酸鹽溶液 溶液呈色，以
色更加強烈 求得水樣中氨
素分解為氨及 量測銨離子濃 銨 (NH4Cl)製 應呈色(如圖 歸線 (又稱檢 溶液吸光值所
本 將含
以亞
，設 氨氮
及二 濃度 製作 圖 3.
檢量 所對
26
應之銨離子濃度。
一、比色分析使用之試劑
(1) 酚溶液 (Phenol solution)：取純度≧ 89 % 之液態酚 11.1 ml，以 95 % 乙醇 (Ethyl alcohol)混合至最終體積 100 ml，每週製備。
注意：操作酚時，需戴手套，護眼裝置，在通風良好環境下操作以減少曝露 於此劇毒揮發性物質之危險。
(2) 亞硝醯鐵氰化鈉 (Sodium nitroprusside)溶液，0.5 %：溶解 0.5 g 亞硝醯鐵氰 化鈉於 100 ml 去離子水中。儲存於棕色瓶，最長一個月。
(3) 鹼性檸檬酸鹽溶液 (Alkaline citrate solution)：溶解 200 g 檸檬酸三鈉鹽 (Trisodium citrate)和 10 g 氫氧化鈉 (NaOH)於去離子水中，再稀釋至 1 L。
(4) 次氯酸鈉 (Sodium hypochlorite)約 5 %：購買市售溶液，使用前適當稀釋。
溶液開封後，會慢慢分解，約每二個月要更換一次。
(5) 氧化劑溶液 (Oxidizing solution)：將 25 ml 次氯酸鈉溶液與 100 ml 之鹼性檸 檬酸鹽溶液混合，使用前配製。
(6) 氨氮儲備溶液 (Ammonium stock standard)：取 3.819 g 氯化銨 (NH4Cl)溶解 於去離子水中，並稀釋至 1000 ml。(此時溶液內氨氮濃度為 1000 mg/L) (7) 氨氮標準中間溶液：取 10 ml 氨氮儲備溶液加去離子水稀釋至 1000 ml。 (此
時溶液內氨氮濃度為 100 mg/L)
(8) 氨氮標準溶液：取 10 ml 氨氮標準中間溶液，加去離子水稀釋至 100 ml。(此 時溶液內氨氮濃度為 1.0 mg/L)
以上試劑配製量會隨實驗所需做調整。
二、檢量線製備
(1) 取 2.5 ml 空白樣本於試管中，依次加入 0.1 ml 酚溶液、0.1 ml 亞硝醯鐵氰
27
化鈉溶液及 0.25 ml 氧化劑溶液，使空白樣本呈色，每次加入各溶液後，均 需混合均勻。置於室溫 (22~27 )℃ 暗處至少一小時，可使顏色穩定二十四小 時以上。以此溶液將分光光度計於波長 640 nm 處歸零。
(2) 稀釋氨氮標準中間溶液至 1、2、4、6、8 mg/L，或其他適當之序列濃度。
(3) 將序列濃度之標準中間溶液依照 (1)加入試劑使其呈色，並製於室溫暗處至 少一小時。
(4) 量測在波長 640 nm 之吸光值，以標準溶液濃度 (mg/L)為 X 軸，分別之吸 光值為 Y 軸，繪製一吸光值與氨氮濃度 (mg/L)之檢量線並做線性迴歸得回 歸式。
三、待測樣本製備
(1) 將培養菌之培養液用離心機以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，使培養液與微生物 分離。
(2) 由於培養微生物過程中，微生物會將銨離子 (NH4+
)釋放出來，故取離心後 之培養液做銨離子濃度檢測。
(3) 取離心後之培養液 2.5 ml 於試管中，依次加入 0.1 ml 酚溶液、0.1 ml 亞硝 醯鐵氰化鈉溶液及 0.25 ml 氧化劑溶液，使空白樣本呈色，每次加入各溶液 後，均需混合均勻。置於室溫 (22~27℃)暗處至少一小時。
(4) 以波長 640 nm 量測待測溶液之吸光值 (需先用空白樣本歸零)，將吸光值帶 入檢量線之回歸式中，即得待測溶液之銨離子濃度。
三、酸鹼值 (pH 值)檢測
pH 值為溶液中氫離子活性 (α)的負對數值公式如下：
pH log α log γ H
γ ：氫離子的活性系數
測試則分 測量，實驗中 測量範圍為 頻率很高且 0)，使用前
分成定性的 p 中使用日本 為 pH 1.0 ~ 1 且可測試樣本
前須以 pH 7
H pH 試紙檢測 本製之型號T
11.0。而 pH 本範圍廣泛 7.0 及 pH 4.
圖 3
28
：氫離子濃 測與定量之 Toyo Roshi K
H 酸鹼度計 泛，實驗中使
.0 之校正溶
. 7 分光光 濃度
之 pH 酸鹼度 Kaisha Ltd.
計在實驗室為 使用型號 M 溶液校正儀器
光度計
度計測定，p 之 pH 試紙 為十分普遍 MP 220 之酸
器。
pH 試紙可做 紙 (如圖 3.
遍的儀器，使 酸鹼度計 (如
做簡 9)，
使用 如圖
圖 3 (由
. 8 不同濃 由左到右濃度
度的氨氮標 度為 0 倍、
圖
29
標準溶液經
、1 倍、2 倍
圖 3. 9 pH 試
經過反應呈色 倍、4 倍、6
試紙
色後顏色差 6 倍、8 倍
差異。
、10 倍)
.4 碳酸鈣 此法參考 含有鈣和鎂 ochrome Bl hylenediami 內所有的鈣 滴定終點。
液滴定之體 有微量的鎂 確保待測溶 EDTA 鎂鹽
、EDTA 滴定 緩衝溶液 g EDTA 鎂 Calmagite
圖
鈣濃度檢測
考環保署 NI 鎂離子的待測
ack T 或 Ca inetetraacet 鈣和鎂都被螯
記錄滴定之 體積，經計算 鎂離子存在，
溶液中有足夠 鹽。
定試劑 液：將 16.9 g
鎂鹽，加去 e [1-(1-hydr
圖 3. 10 酸鹼
測法
IEA W208.5 測溶液之 pH
almagite)後 tic acid，簡 螯合時，溶 之 EDTA 二 算後即可得待
，指示劑才可 夠之鎂離子
g 氯化銨溶 去離子水至 2
roxy-4-meth
30
鹼度計 (型號
51A 之水中 H 值維持在 後，使待測溶 簡稱 EDTA)之 溶液會由酒紅
二鈉鹽溶液體 待測溶液內 可在達滴定 子，會在加入
溶於 143 ml 濃 250 ml。
hyl-2-pheny
號：MP 22
中總硬度檢測 在 10.0 ± 0.
溶液呈酒紅 之二鈉鹽溶 紅色轉為藍
體積，扣除 內之碳酸鈣濃 定終點時有明 入緩衝溶液於
濃氫氧化銨
ylazo)-2-nap 20)
測方法－ED .1，加入少 紅色，以乙烯
溶液滴定待測 藍色 (如圖 3
除空白樣本 E 濃度。由於 明顯且清楚 於待測溶液
銨 (NH4OH)
phthol-4-sul
EDTA 滴定法 少量指示劑
烯二胺四乙 測溶液，當 3. 11)，此時 EDTA 二鈉 於待測溶液中
楚的變色，因 液時，添加微
)中，加入
lfonic acid]
法，
(如 乙酸 當溶 時即 鈉鹽
中必 因此 微量
1.25
指
31
示劑：溶解 0.1 g 乾燥粉末狀 Calmagite 於 100 ml 去離子水中，此溶液在滴 定終點顏色變化較 Erichrome Black T 靈敏。每 50 ml 被滴定溶液加入 1 ml 此指示劑，必要時可調整用量。
(3) EDTA 滴定溶液，0.01 M：加入 3.723 g 之含二個結晶水之 EDTA 二鈉鹽於 少量去離子水中，再以去離子水定容至 1000 ml，並以標準鈣溶液標定 1 ml EDTA 溶液可滴定多少碳酸鈣濃度。由於此溶液能自普通玻璃容器中萃取一 些含有總硬度之陽離子，因此應儲存於 PE 塑膠瓶或硼矽玻璃瓶內。
(4) 標準鈣溶液：取 1.0 g 無水碳酸鈣粉末，置入燒瓶中，緩緩加入 1：1 鹽酸 溶液至所有碳酸鈣溶解，加入 200 ml 去離子水，加入幾滴甲基紅指示劑，
以 3 M 的氫氧化銨 (NH4OH)或 1：1 的鹽酸溶液將鈣溶液調整至變色過程 中的橙色 (如圖 3. 12)，加水至 1000 ml。此時 1 ml 碳酸鈣標準溶液內含 1.0 mg 碳酸鈣。
以上試劑配製量會隨實驗所需做調整。
二、待測樣本製備與測定
(1) 將培養菌之培養液用離心機以 12,000 rpm 離心 30 分鐘，使培養液與細菌分 離並確保游離於培養液中之碳酸鈣沉澱。
(2) 為得到碳酸鈣沉澱物，去掉離心出來的培養液，取下方的菌體沉澱塊，此時 菌體內含碳酸鈣沉澱物，加入適量 1：1 鹽酸使碳酸鈣溶解，加去離子水至 2.0 ml。
(3) 以 3 M 的氫氧化銨 (NH4OH)或 1：1 的鹽酸溶液將鈣溶液調整至變色過程中 的橙色後，加入去離子水至 5.0 ml。
(4) 於待測溶液內加入 0.1 ml 緩衝溶液、0.02 ml Calmagite 指示劑，再以 EDTA 二鈉鹽溶液滴定待測溶液，使溶液顏色由酒紅色轉為藍色，當顏色由紅轉為 紫時，滴定時間間隔約 3 至 5 秒，值至達滴定終點。
記錄滴定
A：樣本溶 (ml)。
B：1.00 m 碳酸 滴 V：樣本溶
(
定之 EDTA 二 總硬度 溶液滴定時
ml EDTA 滴 酸鈣標準溶液
滴定碳酸鈣 溶液體積 (
(a
a) 偏鹼
二鈉鹽體積 度 以碳酸
所用 EDTA
滴定容易所對 液濃度 m
L 鈣標準溶液所
(ml)。
a) 螯合過程 圖 3. 11 ED
圖 3. 12 甲
32
積，並計算碳 酸鈣表示，
A 溶液體積
對應之碳酸 mgL 被滴定
所使用之E
程
DTA 滴定法
(b) 偏 甲基紅指示劑
碳酸鈣濃度 mg
L A
積扣除空白分
酸鈣毫克數 定之碳酸鈣 EDTA 溶液體
(b) 滴定 法變色過程
偏酸 劑顏色呈現
度。計算方式 B 1000
V 分析所用 E
(mg) = 鈣溶液取量體
體積 ml
定終點 程
(c)變色過程 現
式如下：
EDTA 溶液體
體積 ml 1000
程中之橙色
體積
色
33
3.1.5 革蘭氏染色
由於細菌之細胞壁主要成分不同，革蘭氏染色法 (gram stain)可藉由此差異 將細菌染色分成兩大類，藍色的革蘭氏陽性菌與紅色的革蘭氏陰性菌 (其分別構 造如圖如圖 3. 13)，革蘭氏染色主要是以結晶紫 (crystal violet)染劑以及碘液使細 菌之細胞壁上色，革蘭氏陽性菌細胞壁脂質含量較少，單層結構且較厚，染劑會 附著於細胞壁上不易被 95 % 酒精脫色，而革蘭氏陰性菌細胞壁脂質含量較多，
三層結構且較薄，染劑不易附著於細胞壁經由酒精脫色呈無色。加入番紅 (safranin)進行複染可將革蘭氏陰性菌染成紅色。
一、革蘭氏染色步驟
(1) 取菌液或培養基上的菌於載玻片上，若從培養基上取菌做革蘭氏染色，則需 先於載玻片上滴約 10 μl 的無菌水，再將菌均勻在水面上塗開。
(2) 待風乾後以酒精燈於載玻片背面過火，使菌固定於載玻片上。
(3) 於在波片上加入適量的結晶紫 (crystal violet)，待一分鐘後沖洗載玻片背面，
避免將菌沖掉。
(4) 加入適量碘液待一分鐘後，沖洗載玻片背面。
(5) 以酒精緩緩沖洗約十秒，進行脫色動作，若為革蘭氏陰性菌，其細胞壁上之 染劑會被酒精脫色，陽性菌則不會。
(6) 最後以番紅 (safranin)進行複染，此步驟會使已脫色之革蘭氏陰性菌呈紅色，
陽性菌則不會。
3.1 鎖反 蘭氏 DNA 至剩 電泳 染色 (1)
(2)
(3)
(4)
(a)
.6 染色體 為了要分 反應 (polym 氏陽性菌細
A extraction 剩下微生物 泳分析，以 色體 DNA 濃
取 1.5 ml 保留菌體 於微量離 (lysozyme 加入 0.1 蛋白質，
加入等體
革蘭氏陽性
體萃取法
分析菌種的 D merase chain 細胞壁較厚，
n)步驟，利 物體內之染色 以得知是否成 濃度。其步
菌液至微量 體沉澱塊。
離心管內加入 e)，混合均
ml 10 % SD 放入 55℃水 體積之 pheno
性菌 圖 3. 13 細
DNA 序列 n reaction，
不易破壞，
利用特殊之酵 色體 DNA 後 成功萃取染 步驟如下：
量離心管中
入 0.5 ml 的 均勻後置於 3 DS 破壞細胞 水槽內一個 ol/chlorofor
34
細菌細胞壁之
，必須將其 簡稱 PCR 做 PCR 前 酵素逐步由 後，稀釋染 染色體 DNA
中，以 12,00
的 solution I 37℃水槽內 胞膜及 0.01 個晚上。
rm mix 溶液
(b) 之基本構造
其 DNA 抽取 R)放大之，以 前需先進行染
由細胞壁、細 染色體 DNA
並找出最適
00 rpm 離心
，其中含有 內 30 分鐘，
1 ml 的 prot
液，以 3D 搖
革蘭氏陰性 造
取出來才能利 以利實驗之 染色體萃取
細胞膜、細 A 至適當倍數
適合做聚合
心 10 分鐘，
有 1 mg/ml 待溶解脢分 teinase K 分
搖擺式混合器 性菌
能利用聚合脢 之進行。由於 取 (Chromos
細胞質分解 倍數，進行膠
合脢連鎖反應
，去掉上清
的溶解脢 分解細胞壁 分解細菌體內
器 (如圖 3 脢連
於革 some
，直 膠體
應的
清液，
壁。
內脂
. 14)
搖勻二小 管中。
重複(4)步 將十分之 Ethanol 加 -20℃一個 將微量離 附於管壁 視染色體 30 分鐘後
.7 聚合脢 聚合脢連 至 106以上
小時，以 12,
步驟二到三次 之一倍微量離
加入微量離心 個晚上，使染 離心管用 4℃
壁上，將裡面 體 DNA 沉澱
後進行膠體電
脢連鎖反應
連鎖反應 (po
，解決因 D
,000 rpm 離
次，搖勻時 離心管內溶
心管中，會 染色體 DN
℃離心機以 面的溶液倒 澱量加入適量
電泳分析。
圖 3.
應
olymerase c DNA 檢體不
35
離心 10 分鐘
時間縮短至 溶液體積之
會看到透明一 NA 沉澱。
12,000 rpm 倒掉，至於室
量的無菌水
14 3D 搖擺
chain reacti 不足而無法
鐘，小心抽取
20 分鐘。
5 N NaCl 與 一絲絲的染
m 離心 10 分 室溫風乾。
水將沉澱物回
擺式混合器
on，簡稱 P 法進行研究之
取上清液於
與兩倍溶液 染色體 DNA
分鐘，此時染
回溶，放置
PCR)可使某 之問題。其
於新的微量離
液體積之 95 A 形成。靜置
染色體 DNA
置 37℃水槽
某 DNA 片段 其操作原理主
離心
% 置於
A 年
槽內
段擴 主要
36
分成三部分(示意圖 3. 15、圖 3. 16)：
(1) 變性反應 (denaturation)：以高溫 (92~95℃)使雙股 DNA 分離 (denature)成單 股 DNA。
(2) 緩冷配對反應 (annealing)：於欲擴增之 DNA 片段之兩端設計一前置引子 (forward primer)和反置引子 (reverse primer)與單股 DNA 配對，此時設計溫度 約為 40~52℃。
(3) 延長反應 (extention)：以 DNA 聚合酵素 (Taq DNA polymerase)於 72℃合成 新的雙股 DNA。
循環操作聚合脢連鎖反應多次後可使 DNA 之增加量為 2N，N 代表重複操作 之次數，在理想的反應條件之下，DNA 是以幾何級數增加。欲得知 PCR 反應後 是否正確擴增該 DNA 片段以及其擴增之量，則以膠體電泳分析做檢核。最後將 PCR 反應產物送至基隆米克斯生物科技公司進行 DNA 定序，將定序後之 DNA 序列輸入 National Center for Biotechnology Information (NCBI)網站進行序列比對，
以得知該菌種名稱。
一、PCR 反應之材料
本實驗使用之前置引子與反置引子分別為 27 f 及 1522 r (為 16 S RNA primer)，前置與反置引子是將欲擷取之 DNA 片段頭與尾固定。為合成新的雙股 DNA 需 A、T、C、G 鹼基，與變性反應後之單股 DNA 配對，需加入 dNTP，為 分散的 A、T、G、C 鹼基。合成雙股需要 DNA 聚合酵素驅動片段複製，而 10X buffer 是為了緩衝聚合脢連鎖反應過程之化學變化。PCR 均於微量試管內進行，
每管微量試管內之反應材料各體積為：染色體 DNA 3 μl、27 f 及 1522 r 引子各 5 μl、dNTP 5μl、DNA 聚合酵素 0.5 μl、10X buffer 5μl、去離子水 26.5μl。
