第三章、 材料與方法
五、 蛋白質單向電泳 SDS 聚丙烯醯胺膠體電泳分析 (SDS-PAGE) . 20
SDS-PAGE 實驗流程參考並修改自(Laemmli, 1970)，SDS-polyacrylamide gel 配方參考 Harlow 和 Lane (1988) 配製 12%分離膠體溶液 (separating gel，30%
acrylamide mix、1.5M Tris-HCl, pH 8.8、10% SDS、10% APS (ammonium persulfate) 及 TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)) (附錄 3) 以及焦集膠體溶液 (5% stacking gel，30% acrylamide mix、1M Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、10% APS 及 TEMED) (附錄 4)。
以酒精拭淨鑄膠組合 (玻璃片、陶瓷板與合適的間隔條)，加水確定無滲漏 後可繼續操作。依目標蛋白質分子量選擇 12%濃度的 SDS 膠體溶液，兩片 1.5 mm 厚的膠片約需 25 ml 分離膠體溶液以及 10 ml 焦集膠體溶液。兩混和溶液皆
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在倒入鑄膠組合前才加入催化自由基的 TEMED，使用滴管慢慢加入膠體 (約八 成高) ，再加入 isopropanol 阻隔氧氣加速凝結。約 60 分鐘凝結後移除 isopropanol，
同法注入焦集膠體溶液至頂端，由於凝結快速需要儘快插入樣品槽齒模，需移除
加入含有追蹤染料 bromophenol blue 的 5X sample buffer (FA0020-0025,
BIONOVAS, Toronto, Ontario, Canada)，混勻後以 100℃加熱 10 分鐘。放冷短暫 離心後即可取樣本體積 20 ml 注入樣本槽，注入樣本時儘量把針頭或吸管伸到底 部。接上電源以 70V 進行電泳 30 分鐘，接著以 180V 跑大約 1 小時，可置於冷 房減緩膠片發熱的情形。使用濃度較高的膠片可以等到藍色染料泳出膠體再停 止。
拆開膠片組合後移除焦集膠體，並在分離膠片的右上方截角做記號 (區別膠 片樣品次序)。將膠片放入含有 CBR 染色液 (0.2% Coomassie brilliant blue R-250、
50% methanol 及 10% acetic acid) 之容器中染色，室溫下均勻搖晃約 10 分鐘，若 要進行蛋白質轉印則不必染色。脫色可用自來水洗掉殘餘的染色液，或倒入約 20 ml 的快速退染液 (5% methanol 及 7% acetic acid) 再繼續搖盪。待脫色數次至 背景透明應可看到蛋白質的藍色色帶。
西方墨點轉漬法 (Western Blot) 實驗流程參考並修改自酵素化學實驗 (莊，
2005)。等待電泳過程將轉印膜 (PVDF) (Hybond, GE Healthcare, NJ, USA) 切成 如膠片大小，並以少許甲醇浸溼活化，另取四張濾紙以及兩片方形海綿墊全部放 入轉印緩衝液 (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) methanol) 中備用。轉印夾 打開平放，依序放置一張方形海棉墊，舖上兩張溼濾紙，再取出電泳膠片平鋪其 上。將潤溼的轉印紙覆蓋於膠片上，確認無氣泡存在後再加蓋兩層濾紙及海綿。
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將三明治卡夾放入轉印槽中，轉印紙靠近正極而膠片則為負極，接著將轉印緩衝 液注入轉印槽，置於冷房以 400 mA 轉印約 1.5 小時。
以明膠-NET (0.25% Gelatin、0.15 M NaCl、5 mM EDTA、50mM Tris base 以 及 0.05% Tween 20，pH 8.0) 作為阻斷劑 (blocking buffer)，取出 PVDF 膜浸潤於 其中搖蕩，在室溫下約 30 分鐘。同樣以明膠-NET 稀釋抗體溶液，PVDF 膜在含 有一級抗體的溶液中室溫搖蕩 2 小時，或是冷房中過夜。接著以 TTBS 洗液清洗 兩次 (15 分鐘/次) 後放入二級抗體溶液，室溫搖蕩 1 小時。免疫染色是利用抗 體來偵測轉印紙上面的抗原蛋白質，這裡二抗所放的 anti-rabbit HRP (horseradish peroxidase) 是化學冷光法 (chemiluminescent detection) 中常用的酵素。最後同樣 以 TTBS 洗液清洗兩次 (15 分鐘/次) 後製於保鮮膜上，即可準備配製 ECL (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 的 HRP substrate (peroxide : luminol = 1:1) 進行化學發光法。吸取適當溶液均勻蓋過 PVDF 膜，過 程均避光，室溫下反應約五分鐘。蓋上透明膜確定沒有氣泡後即可進入暗房壓 片。
＊水稻 OsLEA 2h 抗體－可辨認水稻葉片 16 kD 左右蛋白質，稀釋 10000 倍 (由 本實驗室提供)。
＊大麥 pHVA1 抗體－可辨認水稻葉片 27 kD 蛋白質，稀釋 15000 倍 (由中研院 植微所賀端華老師提供) (Xu et al., 1996)。
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