3. 材料與方法
3.2 實驗方法
3.2.2 蝕骨細胞
3.2.2.1 中藥對 O.B. / O.C. 共培養系統中蝕骨細胞分化能力的評估 酒石酸具耐受性酸性磷酸酵素活性分析( Tartrate Resistant Acid Phosphatase；TRAP , Activity Assay )
操作：
3.2.2.1.1 骨母細胞 / 蝕骨細胞共培養
取剛出生 3天內的 Sprague-Dawley新生小鼠的頭蓋骨，用第一型膠原蛋白 酵素分離出骨原始細胞( Osteoprogenitor )，和取同一隻鼠體的脾臟分離出脾臟細 胞，分別用血球計數器計數過細胞數後，將同一隻鼠體的骨原始細胞和脾臟細 胞依比例 ＝ 1：50 一起培養。
在 48 孔培養盤中接種 1 ×104 脾臟細胞/well和 2 ×102骨原始細胞/well，放 入細胞培養箱中培養過夜，隔天取出細胞，將實驗組分為4組，分別在不同的 時間點添加中藥，因根據研究〔46,47,48〕，在體外骨母細胞 / 蝕骨細胞共培養實驗 中，蝕骨細胞的成熟約需培養 6 天，而前 4 天是蝕骨前驅細胞( osteoclast progenitors )的增生期，後 2天則是蝕骨細胞的分化期，故第 1組於 1 ~ 4天、第 2組於 5 ~ 6天、第 3組於 1~ 6天、第 4組於第 7~8天時添加中藥，以觀察不同 時期中藥對蝕骨細胞的影響。
3.2.2.1.2 酒石酸具耐受性酸性磷酸酵素活性分析
將添加藥物組每個培養皿中先用微量吸管加入 360μL的共培養細胞培養
＝ 10/1；Acid phosphatase procedure no. 435, Sigma Co., St. Louis, MO,USA )，迅 速以 ELISA plate reader測其連續 5分鐘每分鐘吸光值的變化，並以下列公式表 示：
Mean TRAP Activity ( Sigma Unit / L ) ＝△TRACP Activity × T V ×1000 / 12.9
× LP × SV
即每 Liter 中，每分鐘有多少 Sigma Unit 的α-naphthyl phosphate 被 TRAP 轉換 成α-naphthol。
△TPAP Activity ( △A / min )＝ Final Absorbance － Initial Absorbance / Time Interval ( Change in absorbance per minute at 405 nm )
TV ＝ Total Volume (130μL) SV ＝ Sample Volume (30μL)
12.9 ＝ Millimolar absorptivity of a–naphthol-fast red TR complex at 405 nm LP ＝ Lightpath ( 1- cm )
1000 ＝ Conversion of units per mL to units per liter
將 4組實驗計算結果在座標上繪成TRAP Activity ( Sigma Unit / L )對應各藥物不 同濃度的關係，以評估不同時期 7種中藥6種不同濃度對蝕骨細胞增生和分化 能力的的影響。
3.2.2.2 蝕骨細胞形態觀察：酒石酸具耐受性酸性磷酸酵素染色法( Tartrate
Resistant Acid Phosphatase Stain ；TRAP Stain )
操作：
※ 細胞固定液的配製：
( Acid phosphatase stain kit, ACP stain, procedure no.387, acid phosphatase, leukocyte, Sigma Co., St. Louis, MO, USA )
準備 100 mL 的玻璃瓶，加入 65 mL Acetone 和 25 mL Citrate solution 及 8 mL 37﹪的 formaldehyde，儲存於 2~8 ℃冷藏，使用前回溫至 18~26 ℃。
※ TRAP 染色液的配製：
( Acid phosphatase stain kit, ACP stain, procedure no.387, acid phosphatase, leukocyte, Sigma Co., St. Louis, MO, USA )
（1）準備 100 mL 的玻璃瓶，加入 45 mL 已回溫至 37℃的去離子無菌水。
（2）準備 15 mL 的無菌離心管，加入 0.5 mL Sodium Nitrite Solution 和 0.5 mL Fast garnet GBC base solution，蓋緊瓶蓋輕輕的搖晃均勻，靜置 2分鐘使 其反應成 diazonium salt solution。
（3）將離心管中 1 mL 的 diazonium salt solution加入 Step.（1）的玻璃瓶中，
再加入 0.5 mL 的 Naphthol AS-BI phosphate solution，搖晃混合均勻後蓋 上瓶蓋，靜置於 37℃的恆溫槽內備用。
※ TRAP 染色法：
將前步驟 4 組 48 孔培養盤，加入 200μL 的細胞固定液( Acetone-Citrate- Formaldehyde )，靜置 30秒後吸除固定液，再用 400μL的去離子水清洗，靜置 45 秒後吸除上清液，之後加入 200μL的 TRAP 染液，放入 37℃培養箱中避光 靜置 1小時。1小時後取出吸除染液，同樣用400μL的去離子水清洗，靜置 2 分鐘後吸除上清液，最後用 10μL 的 Hematoxylin 對比染液( counterstaun )染 色，1分鐘後吸除對比染液，將 48孔培養盤移至水槽中，用自來水輕輕的小心
沖洗染液，之後靜置風乾，於 100X的倒立式顯微鏡下觀察7種不同藥物7種 不同濃度下，TRAP 染色蝕骨細胞形態上的變化。
3.2.3 骨母細胞 / 蝕骨細胞共培養
操作 a（同種系鼠體）：