3. 材料與方法
3.2 實驗方法
3.2.1 骨母細胞
3.2.1.1 骨母細胞的培養
取剛出生 3 天內的 Sprague-Dawley新生小鼠(中國醫藥學院實驗動物中心) 的頭蓋骨，將周邊的肌肉、結締組織儘量剝除乾淨，隨後將頭蓋骨剪成碎塊，
再用 0.2 ﹪的第一型膠原蛋白脢( collagenase type ? ；Gibco BRL, Rockville, MD, USA, 235 units/mg )消化( digestion )頭蓋骨的結締組織，使間葉基質細胞釋放 出來，然後置於培養箱內( 溫度 37℃、95﹪air / 5﹪CO2 )作初代骨母細胞的培 養，每 2天更換新的培養基，並將大塊的碎骨殘骸用吸管吸除，約7天後細胞 即可長滿整個培養皿。
3.2.1.2 繼代骨母細胞培養
隨後將已培養 7 天長滿細胞的培養皿，加入 0.25 ﹪的胰蛋白脢( Trypsin )/
EDTA ( Gibco BRL, Rockville, MD, USA )使細胞脫離培養皿的底部而成圓球 狀，再用血球計數器( haemocytometer )於 100X倒立顯微鏡下觀察，計數細胞的 存活率，之後將細胞懸浮液以 1：3的比例稀釋均勻分散後，平均分配於3盤 10 cm 的培養皿( TPP Europe/switzer land )中作繼代細胞培養，每 2天更換新的 培養基，約 2 ~ 3 天後細胞即可長滿整個培養皿，此為第 2代的繼代細胞。
待細胞長滿後，重複上述繼代細胞的分盤步驟，取繼代第2或第3代的骨
母細胞作為本實驗的材料。
3.2.1.3 細胞型態的觀察
3.2.1.3.1 劉氏染色法( Liu’s stain )
原理：可將細胞染成藍紫色，但對染色的細胞無專一性。
操作：
將繼代的骨母細胞在 48 孔培養盤( 48 -well plate )中分別接種 5 ×103 / well 的細胞數，再加入 7種中藥 7種不同濃度，n＝3，放入細胞培養箱中培養 2天。
2 天後取出細胞，用 4 ﹪中性福馬林( neutral buffered formaline, NBF )固 定細胞後，用微量吸管加入 100μL 的 Liu’s stain solution A ( 武藤化學株式會 社，日本 )，約染色30秒後，再加入 200μL的 Liu’s stain solution B ( 武藤化學 株式會社，日本 )，搖晃之使 A液和 B液充分混合，約 90秒後溶液表面出現 金屬光澤，吸除 Liu’s stain solution A 和 B 液。
將 48孔培養盤移至水槽中，用自來水輕輕的小心沖洗染液，之後靜置風 乾，於 200X的倒立式顯微鏡下觀察 7種不同藥物 7種不同濃度下，細胞形態 上的變化。
3.2.1.3.2 鹼性磷酸酵素染色法( Alkaline Phosphatase stain, ALP stain ) 原理：可將骨母細胞的鹼性磷酸酵素活化位染成藍紫色，故對骨母細胞染
色有專一性。
操作：
※ 細胞固定液的配製：
( Alkaline phosphatase stain kit, ALP stain, procedure no.86, alkaline phosphatase, leukocyte, Sigma Co., St. Louis, MO, USA )
準備100 mL的玻璃瓶，加入65 mL Acetone 和25 mL Citrate solution 及 8 mL Formaldehyde，儲存於 2~8 ℃冷藏，使用前回溫至 18~26 ℃。
※ 鹼性磷酸酵素染色液的配製：
( Alkaline phosphatase stain kit, ALP stain, procedure no.86, alkaline phosphatase, leukocyte, Sigma Co., St. Louis, MO, USA )
（1）準備 100 mL 的玻璃瓶，加入 45 mL 已回溫至 18~26 ℃的去離子 ( deionized )無菌水。
（2）準備 15 mL的無菌離心管，加入 1 mL Sodium Nitrite Solution 和 1 mL Fast blue BB Alkaline Solution，蓋緊瓶蓋輕輕的搖晃均勻，靜置 2分鐘使其反 應成 diazonium salt solution。
（3）將離心管中 2 mL 的 diazonium salt solution加入 Step.（1）的玻璃瓶中，
再加入 1 mL 的 Naphthol AS-BI Alkaline Solution，搖晃混合均勻後蓋 上瓶蓋，靜置於 18~26 ℃的室溫下備用。
※ 骨母細胞鹼性磷酸酵素染色法：
將繼代的骨母細胞在48孔培養盤中分別接種 5 ×103 / well的細胞數，再加 入 7 種中藥 7 種不同濃度， N＝3，放入細胞培養箱中培養 2 天。
2 天後取出細胞，加入 200μL 的細胞固定液( Acetone-Citrate-
Formaldehyde )，靜置 30秒後吸除固定液，再用 400μL的去離子水清洗，靜置 45 秒後吸除上清液，之後加入200μL的鹼性磷酸酵素染液，在室溫下(18 ~ 26
℃)避光靜置 15分鐘。15分鐘後吸除染液，同樣用 400μL的去離子水清洗，
靜置 2 分鐘後吸除上清液，最後用 10μL Neutral Red Solution 對比染液 ( counterstaun )染色，1分鐘後吸除對比染液，將 48孔培養盤移至水槽中，用自 來水輕輕的小心沖洗染液，之後靜置風乾，於 200X的倒立式顯微鏡下觀察7 種不同藥物 7 種不同濃度下骨母細胞形態上的變化。
3.2.1.4 中藥對骨母細胞存活( survival )和增生( proliferation )能力的評
估－MTT 分析；MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)reduction – a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferation
原理：
利用活細胞粒腺體中的dehydrodenase可將黃色水溶性的 MTT還原轉換成 暗藍色水不溶性的 formazan ，再用溶劑( acid/alcohol – 0.04 N HCL in isopropanol ) 將 formazan 溶解，然後分別在 O.D. 570 nm 和 O.D. 650 nm測其吸光值，所得
蓋上瓶蓋均勻搖晃使 MTT粉末溶解後，用0.22μm無菌過濾膜( Millipore, USA ) 過濾滅菌，裝至 15 mL無菌離心管中，用鋁箔紙包覆管身避光，標示之儲存於 4 ℃冰箱中。
3.2.1.4.2 formazan 溶劑( acid/alcohol – 0.04 N HCL in isopropanol )的配 製：
取 50 mL無菌離心管，加入 2 mL 1 N HCL，再加入 48 mL isopropanol ( 聯 工化學試藥，台灣 )，標示之儲存於室溫下。
3.2.1.4.3 formazan吸光值( O.D.570－650 nm ) V.S. 骨母細胞數檢量線的 製定 沉澱損失，用微量吸管加入 200μL 的 acid/alcohol – 0.04 N HCL in isopropanol
溶劑，蓋上蓋子，將培養盤移至 shaker plate ( Firstek Scientific )，約 10分鐘後於 colorimetric test, procedure no. DG1245-UV, sigma Co., St. MO, USA )和 5 mL的去 離子水加入 15 mL的無菌離心管中，蓋上瓶蓋適度搖晃使 ALP 試劑B完全溶 解後，再加入 25 mL 的 ALP 試劑 A ( Alkaline phosphatase EC3.1.3.1colorimetric test, procedure no. DG1245-UV, sigma Co., St. MO, USA )，標示之置於室溫 25℃
下。
3.2.1.5.2 0.1 ﹪Triton X-100 的配製
取 50 mL 的無菌離心管中，用微量吸管加入 50μL Triton X-100 ( USB, Amershan Life Science )，再加入 PBS 至 50 mL，蓋上瓶蓋適度搖晃，標示之置 於室溫 25℃下。
3.2.1.5.3 p-nitrophenylate anion 在 O.D .405 nm 每分鐘吸光度的增加量 ( △A / min ) V.S. 骨母細胞鹼性磷酸酵素活性檢量線的製定 將繼代的骨母細胞在 96孔培養盤中由左至右依序接種細胞數由 1 ×103 、 2 ×103 、3 ×103 、4 ×103 、5 ×103 、1 ×104 、2 ×104 、3 ×104 、4 ×104 、5 ×104/well；
N＝8，在室溫 25℃下，每個 well 先用微量吸管加入 20μL 的 0.1 ﹪Triton X-100，靜置 5 分鐘，待 Triton X-100將細胞膜融解( lysis )，使鹼性磷酸酵素溶 離，再加入 100μL 的 ALP 試劑，迅速以 ELISA plate reader測其連續 15分鐘 每分鐘吸光值的變化，並以下列公式表示：
Mean ALP Activity ( Sigma Unit / L ) ＝△ALP Activity × T V ×1000 / 18.45 × LP × SV
即每 Liter 中，每分鐘有多少 Sigma Unit 的 p-nitrophenylphosphate 被 ALP 轉換 成 p-nitrophenylate anion。
△ALP Activity ( △A / min )＝ Final Absorbance － Initial Absorbance / Time Interval ( Change in absorbance per minute at 405 nm )
TV ＝ Total Volume SV ＝ Sample Volume
18.45 ＝ Millimolar absorptivity of p-nitrophenol at 405 nm LP ＝ Lightpath ( 1- cm )
1000 ＝ Conversion of units per mL to units per liter
將計算結果在座標上繪成 ALP Activity ( Sigma Unit / L )對應細胞數的關係，並將 曲線作迴歸，求出 ALP Activity 對應骨母細胞數的檢量線。
3.2.1.5.4 中藥對骨母細胞鹼性磷酸酵素活性的測定
將繼代的骨母細胞在 96孔培養盤中分別接種 5 ×103 / well的細胞數，每個 ß-glycerophosphate )，再於實驗組中加入 0.5 mL的 7種中藥 6種不同濃度，而 空白組則加入 0.5 mL的 PBS；N＝3，再放入細胞培養箱中培養，每 3天更換
細胞培養液和添加藥物，連續培養至 21 天。
21天後取出細胞，再用 4 ﹪中性福馬林( neutral buffered formaline, NBF )固定 細胞，之後再加入 3.0 mL的 5 ﹪硝酸銀溶液，並用 100 W 的白熱燈照射 1小時，
待結節( nodule )暗褐色的磷酸銀沉澱出現，吸去上清液，用 5.0 mL的去離子水重 覆清洗 2次。最後在解剖用顯微鏡( dissecting microscope；Carl Zeiss )放大 30倍的 視野下( magnification ×30 )，用 2 mm2的方格計數礦物質化結節形成的數量，
以評估中藥促進骨骼生成的能力。