螢光奈米鑽石於斑馬魚之生物分佈

我們利用 1－cell stage 的斑馬魚胚胎進行螢光奈米鑽石的顯微注 射並觀察活體顯影。首先，以未修飾 BSA 的螢光奈米鑽石進行顯微注 射，注射位置為卵黃部分(圖 2－6 a)，注射量約 12.5 ng，利用倒立 式螢光顯微鏡進行觀測，圖 3－3 為斑馬魚胚胎在不同時期 3 hpf 和

10 hpf 的胚胎影像。在圖 3－3b 中，處於囊胚期的胚胎正進行快速的 細胞分裂，可明顯觀察到粒子集中於胚盤的中央且有明顯的聚集

（aggregation）情形。而圖 3－3d 中，原腸胚期的胚胎其表胚層已進 行至 100%外包階段，也是有嚴重的粒子聚集情況。

圖 3－3 未修飾 BSA 螢光奈米鑽石於 3 hpf(b)和 10 hpf(d)時期斑 馬魚胚胎的活體 DIC 影像和 cofocal 疊圖，(a) (c) 分別為同時 期未進行顯微注射的控制組（control）。

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為了減少螢光奈米鑽石在胚胎內聚集的情形，我們利用表面修飾 BSA 之螢光奈米鑽石進行顯微注射，圖 3－4（a）（b）為斑馬魚胚胎 在不同時期 4.5 hpf 和 24 hpf 的胚胎影像。在圖 3－4a 中，處於囊胚 期的胚胎正由表胚層開始進行外包，從 confocal 影像中可明顯觀察到 螢光奈米鑽石大多數分佈於正在分裂的胚盤中，僅少量的螢光奈米鑽 石位於植物極卵黃的周圍。參考 Leung 等人⁵⁶所提出的胚胎細胞質流

（ooplasmic streaming）動向推斷，他們認為卵胞質流的力量是藉由

cortical shoulder constriction 擠壓卵黃內的胞質向上，進而產生軸向流 動（axial streaming）至胚盤中，再沿著周圍向下流往植物極（參考圖 圖 1－9）。藉此對照圖中螢光奈米鑽石分佈的結果與上述論點是吻 合的。

圖 3－3b 則為處於咽胚期的斑馬魚，此時胚胎的自體螢光因為色 素生成的關係所已變得較為明顯，但與圖 3－3c 未接受顯微注射的控 制組相比較，仍可辨別出螢光奈米鑽石分佈於卵黃囊和心臟以及體節 中，表示隨著斑馬於胚胎的生長，鑽石粒子會隨機地散佈於其體內，

並非集中於某特定器官或組織中。

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圖 3－4 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於不同時期斑馬魚的活體分佈 DIC 影像、cofocal 影像在 z 軸的 xy 切面圖以及不同 z 軸的疊圖。

（a）4.5 hpf（b）24 hpf（c）control，scale bar＝100μm

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接著我們嘗試將注射量降低到約 5 ng，並觀測在不同階段活體影 像。以圖 3－5a 的結果與圖 3－3b 相互比較，可發現因修飾 BSA 之 螢光奈米鑽石在生物介質 PBS 下懸浮性佳，粒子在囊胚的分佈大小 較為均勻，沒有明顯的聚集情形。而圖 3－5b 也顯示在體節形成期的 胚胎，鑽石粒子也是均勻分布在整個發育中的體節和卵黃囊之中。

此外，雖然注射量下降，但在胚胎發育後期階段圖 3－6a 咽胚期 和圖 3－6b 孵化期的幼體（larva）螢光影像中仍可觀察出鑽石粒子均 勻地分佈於各個組織，且與同時期未進行顯微注射的 control 組互相 比較斑馬魚之外觀和形態，並未有畸形缺陷或者發育不良的情形，表 示 BSA 修飾的螢光奈米鑽石對脊椎動物的生長發育不會造成有害之 影響，提升了長時間活體內顯影觀測之應用性。

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圖 3－5 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚胚胎的活體分佈 DIC 影 像和 cofocal 影像（a）4.3 hpf（b）12 hpf，（c）（d）分別為 同時期未進行顯微注射的控制組（control），scale bar＝250 μm。

圖 3－6 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚幼體的活體分佈 DIC 影 像和 cofocal 影像（a）30 hpf（b）72 hpf，（c）（d）分別為同 時期未進行顯微注射的控制組（control），scale bar＝250 μm。

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