以螢光奈米鑽石探討斑馬魚胚胎的細胞質動態

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department (Graduate institute) of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 以螢光奈米鑽石探討斑馬魚胚胎的細胞質動態 Fluorescent Nanodiamond as a Probe for Exploring Cytoplasmic Dynamics in Zebrafish Embryo. 研究生：李哲宇 Che-Yu Li 學號：699420637. 指導教授：張煥正 H.-C. Chang 林震煌 C.-H. Lin. 中華民國 101 年 6 月 June, 2012 I.

(2) Abstract Fluorescent nanodiamonds (FNDs) have recently developed into an exciting new tool for bioimaging applications. The material possesses several unique features including high biocompatibility, easy bioconjugation, and perfect photostability, making it a promising optical nanoprobe both in vitro and in vivo. This work explores the potential application of the novel nanomaterial as a photostable, nontoxic tracer in vivo using zebrafish as a model organism. We introduced FNDs into the yolk cell of a zebrafish embryo by microinjection at the 1-cell stage. Movements of the injected particles were investigated by using single particle tracking techniques. We observed unidirectional and stop-and-go traffic as part of the intricate cytoplasmic movements in the yolk cell. We determined a velocity in the range of 0.19 – 0.40 μm/s for 40 particles moving along with the axial streaming in the early developmental stage (1 – 2 hpf) of the zebrafish embryos.. Key words：fluorescent nanodiamonds, single particle tracking,. zebrafish embryo,. zebrafish embryo,. II. microinjection.. real-time.

(3) 摘要近來在生物顯影應用方面，螢光奈米鑽石已發展成一項新穎的工具。由於此材料具有許多獨特性質，包括高生物相容性、易於將生物分子修飾在表面的特性以及良好的光穩定性，使得鑽石作為活體外和活體內的光學奈米探針十分具有前景。此篇論文以斑馬魚為生物模型，利用此新穎奈米材料的光穩定且無毒性的特性，作為在生物活體內追蹤工具。我們以顯微注射裝置將螢光奈米鑽石注入單細胞時期斑馬魚胚胎的卵黃細胞，進行長時間的追蹤及觀察細胞質流的運動過程，接著利用單一粒子追蹤技術來探查粒子的運動。我們在卵黃細胞內細胞質錯綜複雜的運動中，觀測到單一方向性且時行時止的運輸方式。並且在早期的斑馬魚胚胎發展階段中(發育 1–2 個小時的受精卵)，測定 40 個粒子於胚胎中隨著軸向的細胞質流移動的速率，其範圍在 0.19 – 0.40 μm/s 之間。. 關鍵字：螢光奈米鑽石、斑馬魚胚胎、即時單一粒子追蹤、卵黃細胞質流、顯微注射 III.

(4) 目錄 Abstract ................................................................................................... II 摘要 ........................................................................................................ III 目錄 ........................................................................................................IV 表目錄 ....................................................................................................VI 圖目錄 ....................................................................................................VI 第一章緒論 ........................................................................................... 1 1.1 前言 .......................................................................................... 1 1.2 螢光奈米鑽石........................................................................... 2 1.2.1 鑽石的結構特性 ............................................................ 2 1.2.2 鑽石的缺陷中心 ............................................................ 5 1.3 斑馬魚 ...................................................................................... 7 1.3.1 以斑馬魚作為脊椎動物模式生物 ................................. 8 1.3.2 斑馬魚的胚胎發育 ...................................................... 12 1.3.3 斑馬魚早期胚胎的卵胞質分離 ................................... 18 1.4 研究動機 ................................................................................ 20 第二章實驗方法 ................................................................................. 22 2.1 藥品 ........................................................................................ 22 2.2 儀器 ........................................................................................ 23 2.3 螢光奈米鑽石製備 ................................................................. 27 IV.

(5) 2.4 螢光奈米鑽石修飾牛血清白蛋白 ......................................... 29 2.5 螢光光譜測量......................................................................... 30 2.6 斑馬魚培養及胚胎收集 ......................................................... 30 2.7 長時間影像觀測的斑馬魚胚胎固定...................................... 31 2.8 顯微注射 ................................................................................ 32 2.9 胚胎影像 ................................................................................ 33 第三章結果與討論 ............................................................................. 34 3.1 螢光奈米鑽石......................................................................... 34 3.2 螢光奈米鑽石於斑馬魚之生物分佈...................................... 37 3.3 螢光奈米鑽石於斑馬魚胚胎之細胞質動態 .......................... 42 第四章結論 ......................................................................................... 44 第五章參考文獻 ................................................................................. 45. V.

(6) 表目錄表 1－1 鑽石的種類與特性 14 ............................................................... 4 表 1－2 鑽石的缺陷中心性質 21 ........................................................... 6 表 1－3 斑馬魚的胚胎發育階段 27...................................................... 16. 圖目錄圖 1－1 鑽石與石墨結構 ....................................................................... 3 圖 1－2 各式 Nitrogen-vacancy 缺陷中心的晶格結構 20 ...................... 6 圖 1－3 斑馬魚之胚胎發育（a）生命週期 (b)囊胚期 (c) 體節形成期 (d)成魚............................................................................................. 7 圖 1－4 斑馬魚的研究用途與目前的檢測工具 33 ................................ 9 圖 1－5 斑馬魚在藥物設計中的效用和發展過程 33 .......................... 11 圖 1－6 斑馬魚的囊胚示意圖 ............................................................. 14 圖 1－7 囊胚進行腔腸化的細胞移動過程 ......................................... 15 圖 1－8 斑馬魚各階段的胚胎發育圖 27 .............................................. 17 圖 1－9 卵細胞內細胞胞質的流動 ..................................................... 18 圖 1－10 斑馬魚胚胎微管分佈的免疫螢光影像 ................................ 19 圖 2－1 螢光光譜儀光路設計圖 ......................................................... 24 圖 2－2. 40 keV He 離子束佈值裝置 .................................................. 26 VI.

(7) 圖 2－3. 40 keV He 離子束佈值裝置簡圖 .......................................... 27. 圖 2－4 螢光奈米鑽石製備流程圖 ..................................................... 29 圖 2－5 斑馬魚胚胎固定於載玻片示意圖 ......................................... 31 圖 2－6 (a) BSA-coated FND 於斑馬魚胚胎卵黃的顯微注射示意圖 (b) 1 cell-stage 斑馬魚胚胎的亮視野影像 .................................... 32 圖 3－1 修飾 BSA 前後螢光奈米鑽石在 PBS 溶液之粒徑分佈 .......... 35 圖 3－2 螢光奈米鑽石螢光光譜圖 ..................................................... 36 圖 3－3 未修飾 BSA 螢光奈米鑽石於 ................................................. 37 圖 3－4 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於不同時期斑馬魚的活體分佈 ..... 39 圖 3－5 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚胚胎的活體分佈 .............. 41 圖 3－6 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚幼體的活體分佈 .............. 41 圖 3－7 螢光奈米鑽石於胚胎卵黃內之長時間細胞質流追蹤螢光影像 ....................................................................................................... 43. VII.

(8) 第一章緒論 1.1 前言近年來，隨著奈米尖端科技的發展，運用奈米技術將奈米材料與生物分子結合應用在生物與醫學的環境下，產生了給人類無限想像空間的奈米生物科技（Nanobiotechnology），其中生物檢測與螢光標記是一個重要的應用方向。在早期的生醫研究中，多是利用螢光合成染 1. 2. 料分子（fluorescent dye）或螢光蛋白（fluorescent protein）進行生物細胞之標的與顯影，但其中仍受限於許多問題，例如狹窄的激發能帶， 3. 生命週期短，光穩定性不佳，光漂白（photobleaching）等缺點使其在生物標記上受到應用限制。 4. 隨後發展的量子點（quantum dots）克服染料分子及螢光蛋白的許多缺點，可藉由調整量子點大小以放出不同波段的螢光波長，高莫耳吸收係數與高量子效率且無光漂白的優點，吸引許多科學家的注意將其應用在生物體螢光標記上5,6。但量子點本身具有生物毒性7與光閃爍8（photo-blinking）問題，雖然許多技術利用包覆策略嘗試要減緩 7,9. 這些問題的嚴重性，但是當粒子濃度高至特定值，其釋出量對生物仍會產生傷害，因此考量到生物安全性與環境保護，侷限了量子點在生醫與其他方面的應用。 1.

(9) 這幾年奈米鑽石（nanodiamond）逐漸被重視與發展，其組成成分為碳元素，除了具有優異的物理及化學特性如高傳熱、高硬度、耐酸鹼等特性之外，還有極佳的化學惰性（chemical inert），生物毒性極低10，其表面經化學處理後能產生羧基11或其他衍生的官能基團，可進行後續的化學修飾。除此之外，經過高速粒子轟擊和高溫退火的鑽石能於晶體結構中產生發光中心（color center），發出明亮且穩定的螢 12. 光，且不因表面化學修飾而改變螢光性質，適合應用於長時間之螢光標記13。這些特性使得螢光奈米鑽石近來在生物應用上作為螢光探針極具發展潛力。. 1.2 螢光奈米鑽石 1.2.1 鑽石的結構特性自古以來，鑽石因其堅硬、質地稀少與炫麗的光芒而被列為寶石中的珍稀，但鑽石雖然寶貴，成分其實與石墨相同，同樣皆由碳原子所組成，只是兩者的結構與原子排列不同，如圖 1－1 所示。石墨有巨大的共價結構，其碳原子彼此以 sp2 鍵結形成層狀六方面體結構（layer of hexagonal network），但層與層之間僅由微弱的凡得瓦力（van dor Waals force）彼此吸引而堆疊，因此容易剝落，莫氏硬度（Mohs hardness）只有 1～2。 2.

(10) 鑽石之碳原子以 sp3 共價鍵與鄰近的四個碳原子形成四面體（tetrahedron），以面心立方晶格（face-center cubic）排列，組成三維的立體網狀結構。原子與原子間形成強大之共價鍵結合，使鑽石的硬度非常大，莫氏硬度達 10，同時也具有極高的熔點（3815℃），密度則是 3.52 g/cm3。純鑽石通常視為絕緣體，其價帶與傳導帶的能階差達 5.5 eV 14，只有摻入雜原子成為雜質半導體（extrinsic semiconductor）後才會具有導電性。鑽石有極高的折射率（以標準黃色鈉光 589.5 nm，折射率為 2.417），而全反射臨界角為 24.5°，因此當鑽石經過適當的切割琢磨之後，即能顯現出炫麗的光彩。. 圖 1－1 鑽石與石墨結構. 3.

(11) Type. Feature. Color. Nitrogen atom concentration up to 0.3%,. Ia. Natural Abundance. Colorless,. clustered together within the carbon. yellow. Note Most natural. 98%. diamonds. lattice Nitrogen atom concentration up to. Ib. Almost all Yellow,. 500ppm, spread evenly throughout the. 0.1%. orange, brown. carbon lattice. diamonds. Colorless,. IIa. No or little nitrogen atoms contained. yellow, brown,. synthetic. The “purest” 1–2%. diamonds. pink, purple. IIb. No or little nitrogen but boron contained. Blue, gray. 0.1%. p-type semiconductor. 表 1－1 鑽石的種類與特性 14. 鑽石可依據晶體內的雜質原子含量不同而分為四大類（表 1－1）。 Type I 為含有雜質原子氮的鑽石，依其含氮量的多寡可分為 Type Ia 與 Type Ib 兩種。大部分的天然鑽石都屬於 Type Ia，其內部的氮原子多聚集成大團或版狀（platelet）呈現淡黃色，又依氮聚集方式細分為 type IaA 碳原子鄰近位置有兩個氮原子聚集（A aggregates），以及 type IaB 碳原子周圍四個位置都是氮原子（B aggregates）。而 Type Ib 鑽石中氮原子含量極少，約僅有 500 ppm，人工合成的鑽石大都屬於此類。Type IIa 為純淨幾乎不含雜質的鑽石，透過切割與車工後即為一般市售寶石級鑽石。而 Type IIb 鑽石參雜有其他元素如硼原子，可做為 P 型半導體材料使用。. 4.

(12) 1.2.2 鑽石的缺陷中心鑽石的螢光性質來自於晶格中氮原子所形成的點缺陷 (point defect)。當 type I 鑽石以高能量粒子束（如中子束）或離子束（如電子、氫離子或氦離子束）進行佈植之後，置於真空內高溫退火（annealing），使得在佈植過程中產生的空缺（vacancy）會與鑽石內原有的氮原子結合，形成各種缺陷中心（圖 1－2），在光譜上能夠看到許多獨特的吸收或螢光帶（absorption/luminescence bands）。在 type Ib 中，含有較高濃度氮原子（約 200 ppm）的鑽石，所形 —. 成的缺陷中心為帶負電的氮空缺中心 (N-V) ，其零聲子線（zero-phonon line, ZPL）為 637.2 nm (1.945 eV)15。而氮原子濃度較低(<10 ppm)的 Type Ib 鑽石，所形成的缺陷中心為中性不帶電的氮空缺中心(N-V)0，零聲子線為 574.9 nm (2.156 eV)16。而在氮含量較多的天然鑽石 type Ia 也會存有其他缺陷中心，如 N3，此類型缺陷中心主要為空缺鄰近的三個氮原子，此類型所生成的 ZPL 位置為 415.2 nm (2.985 eV)17。若是在 type IaA 鑽石以 A aggregates 形成的缺陷中心為(N-V-N)0 也稱為 H3，零聲子線為 503.2 nm (2.463 eV)18 。在 type IaB 以 B aggregates 與空缺形成缺陷中心則為 H4，其零聲子線位置為 496.0 nm (2.499 eV) 19。表 1－2 為缺陷中心的性質整理。 5.

(13) 圖1－2 各式Nitrogen-vacancy缺陷中心的晶格結構20（灰色：碳原子，黑色：氮原子以表示，空心虛線：空缺）. ZPL. λem. τ. Defect center. Point group. （nm）. （nm）. （ns）. V0(GR1). Td. 741.2. 898. 2.55. 0.014. (N－V)－. C3v. 637.6. 697. 11.6. 0.99. (N－V)0. C3v. 575.4. 600. …. …. N-V-N (H3). C3v. 503.5. 531. 16. 0.95. N3 + V (N3). C3v. 415.4. 445. 41. 0.29. ψ. 表 1－2 鑽石的缺陷中心性質 21 ，zero-phonon line(ZPL)，emission maxima(λem)，Emission lifetimes(τ)，quantum effciencies(ψ) 6.

(14) 1.3 斑馬魚 22. 斑馬魚（Zebrafish, Danio rerio）原產於東印度，屬鯉科魚丹屬，是一種常見的淡水熱帶魚。最早的描述是由 Francis Hamilton 在1822 年所記錄23，此硬骨魚類體型纖細，成熟時體長約 3 cm，體側有水平藍白相間的條紋（圖1－3）與斑馬相似故以此命名。斑馬魚有25對染色體，生長週期短，孵出後約3個月達到性成熟24。成魚繁殖能力強，在室溫下極易產卵，且產卵無季節性，可利用人為調控光週期使雌魚產卵25，每次可達數百顆。胚胎透明且可被移植在體外中生長26，受精卵從受精到孵化只需48小時27，方便觀察記錄其發育過程。. 圖1－3 斑馬魚之胚胎發育（a）生命週期 (b)囊胚期 (c) 體節形成期 (d)成魚，scale bar = 300 μm。28 7.

(15) 1.3.1 以斑馬魚作為脊椎動物模式生物在 1960 年代晚期，美國俄勒岡大學的噬菌體遺傳學家 George Streisinger 29，開始尋找能夠作為模式系統（model systems）研究脊椎動物神經發育基因（the genetic basis of vertebrate neural development）的生物，首次將斑馬魚引進實驗室中，觀察魚胚胎發育過程並詳細定義各個發育階段，方便後來的學者參考研究，也奠定了使用斑馬魚作 23. 為發育模式動物的基礎。近十年來，斑馬魚已成為目前研究脊椎動物的發育生物學和基因功能的最佳模式動物之一，圖1－4為斑馬魚的研究用途與目前的檢測 25. 工具。斑馬魚具有許多優點，包括：體型小容易飼養、養殖花費少易於大量飼養、性成熟期短約3個月、體外受精、具有光週期誘發產卵、受精卵單細胞在12小時內便可看出脊椎動物的雛型、48到72小時後即發育成可覓食逃亡的魚體30，卵黃囊位於中央易於辨識以及胚胎透明－神經、肌肉、消化道、心臟、血管、血球在可見光顯微鏡下可直接觀察發育過程，而此特性是老鼠、黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）、秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）等模式生物所沒有的31。而且胚胎發育上的機制與哺乳動物是非常相似，許多重要的調控蛋白質的表現位置與時間也都與哺乳動物相似32。. 8.

(16) 圖 1－4 斑馬魚的研究用途與目前的檢測工具. 33. 另一項研究優勢，就是斑馬魚的全基因組已經定序完成，該計畫始於2001年，由英國桑格研究院（Sanger Institute）及世界眾多斑馬魚實驗室合作完成。 34. 35. 此外，斑馬魚容易進行誘發突變，可以機械性（迦瑪射線照射）或化學方法（突變劑N-ethyl-N-nitrosourea36）來產生變種供發育與分化的遺傳研究，用分子生物學方法改變特定基因的表現37及產生基因轉殖魚38。在1996年德國杜賓根大學Christiane Nusslein-Volhard和美國哈佛大學的W. Driever藉由大規模的化學誘導突變，篩選出2,000 種 39. 以上斑馬魚突變種，相關的表現型變異遍及發育各個階段。對一些 9.

(17) 40. 41. 42. 變種的研究已顯示在一些器官或組織如肌肉、眼睛、耳朵、心臟 43. 44. 45. 、血液、胰臟及腎等所產生的缺陷，與人類這些器官所產生的一. 些疾病之病理特徵相似，且為相同或同源基因變異所造成。另外，以一些小分子的化學物質浸泡處理斑馬魚胚胎，亦可觀察到明顯的器官及發育上的變化，且有些化學物質所引起器官的改變與特定基因缺陷所產生的變種相類似33。因此，以上諸多特點使得斑馬魚成為研究胚胎發育分子機制、人類遺傳學、基因表現調控機制以及人類疾病方面良好的實驗物種。同時近幾年來，斑馬魚也用來探討藥物作用的機制，如一些心血管、抗血管形成及抗癌症等藥物，發現在斑馬魚胚胎及哺乳類系統皆 46. 能產生相似的生理及形態的反應。因此斑馬魚可用來從事下列的藥物研究（圖1－5），例如化學藥物庫的篩選、藥物毒性及畸型的預測、藥理及毒物基因學等研究。同時，更可以做為測試人類治療新藥的一個介於細胞培養及昂貴的老鼠活體測試系統的橋樑。. 10.

(18) 圖 1－5 斑馬魚在藥物設計中的效用和發展過程. 33. 然而，近幾年隨著奈米粒子廣泛被應用於生醫和臨床治療上，斑馬魚也被作為評估奈米毒性（nanotoxicity）的測試生物，用以檢視奈米粒子對於生物健康和環境的影響。有許多奈米材料皆針對此議題進 47. 48. 49. 50. 51. 52. 行研究，如量子點、金、銀、銅、二氧化矽、氧化鋅等奈米粒子，顯示如何藉由測試奈米材料在生物體的分佈與毒性，以找出一種生物毒性低的奈米探針是十分重要的課題。. 11.

(19) 1.3.2 斑馬魚的胚胎發育斑馬魚的胚胎發育大致上分為七個階段（表 1－3），分別是合子期(Zygote period)、卵裂期(Cleavage period)、囊胚期(Blastula period)、原腸胚期(Gastrula period)、體節形成期(Segmentation period)、咽胚期(Pharyngula Period)、孵化期(Hatching period)，各階段發育型態可參考圖 1－8。合子期(0－0.75 h)：卵子受精後會活化細胞質的運動，進入胚胎發生與發育的階段。此時，受精卵的卵膜迅速吸水膨脹，原本均勻分布的卵黃，其非卵黃質（non-yolky cytoplasm）從植物極(vegetal pole) 開始流往動物極 (animal pole) 方向集中，形成一個無卵黃質（yolk-free cytoplasm）的帽狀區域，胚盤（blastodisc）。卵裂期（0.75－2.25 h）：斑馬魚胚胎卵裂屬於偏裂（meroblastic cleavage），卵裂溝只停留在動物極。胚葉細胞（blastomeres）在第一次卵裂後，每間隔 15 分鐘進行一次分裂，前五次為經裂，產生單細胞層，隨後有緯裂發生。囊胚期(2.25－5.3 h)：始於128-cell stage，細胞再經兩次分裂後進入midblastula transition(MBT)53，細胞分裂速度變慢。此時球狀的胚胎細胞分三類（如圖 1 － 6a 所示），位於胚盤最外層的表胚層 (enveloping layer, EVL) 、與卵黃接觸的卵黃多核層(yolk syncytial 12.

(20) layer, YSL)和上述二者之間的深層細胞(deep cells)。僅深層細胞發育為胚胎本體組織（如圖1－6b所示）。卵黃上端囊胚成扁平狀，細胞繼續分裂成半圓形，表胚層由動物極開始進行外包(epiboly)。原腸胚期(5.3－10.3 h)：腔腸化（gastrulation）是指囊胚細胞有規則地移動，使內胚層（endoderm）和中胚層（mesoderm）細胞遷入胚胎內部，而外胚層（ectoderm）細胞鋪展在胚胎的表面，從而形成原腸胚（圖 1－7）。當胚層邊緣外包卵的程度達 50%時，胚盤細胞在與卵黃交界處增厚形成胚環（germ ring），其後在背部的胚環增厚形成胚盾（embryonic shield）。而下胚層（hypoblast）的細胞運動、遷移將形成中胚層和內胚層，上胚層（epiblast）細胞則產生神經脊索（neural keel）和皮膚。體節形成期(10.3－22 h)：在胚體的中央開始分節，這也是劃分魚類發育的重要階段。此時胚體後側出現尾芽（tail bud），不斷的發育延伸，卵黃囊逐漸由圓形變為長形，體節（somite）也不斷的增加。這個時期另外一個明顯的特徵為視神經囊泡（optic vesicle）的形成。此時期一直持續到 26 個體節為止。咽胚期(24－48 h)：此時期的特色為原始咽弧（pharyngeal arch primary）的形成，在早期並不容易被觀察到，隨後則成長迅速。此時期在視網膜以及皮膚表面開始有色素沉澱形成，於 24 小時開始有 13.

(21) 紅血球在卵黃上流動和心臟跳動的情形。此時心臟已經分化成心房與心室，同時前腸（foregut）形成、掌管嗅覺的纖毛也發育完成、耳囊（otic vesicle）壁增厚而可見。孵化期(48－72 h)：此時可以觀察到顎的軟骨形成，胚體口部已能張閉，完成初期器官的型態發生，同時胚體扭動加劇，隨後破膜而出成為魚苗。. 圖1－6 斑馬魚的囊胚示意圖（a）在原腸胚期，深層細胞被表胚層所外包，卵黃細胞的動物極表層成扁平狀，含有YSL的細胞核。微管（microtubules）從卵黃細胞質延伸到YSL的外部區域。（b）深層細胞在50%－epiboly stage的命運地圖（fate map），在特定區域的細胞最後將分化成各種組織或器官。. 54. 14.

(22) 圖 1－7 囊胚進行腔腸化的細胞移動過程（a） 30%－epiboly stage （b） shield stage，由上胚層(epiblast) 分層(delamination)和外包邊緣的細胞內卷(involution)形成下胚層(hypoblast) （c）邊緣區域的細胞閉合（d）90%－epiboly stage，可明顯看出中胚層圍繞著卵黃，被外胚層和內胚層所包覆（e）100%－epiboly stage，腔腸化完成。54. 15.

(23) 表 1－3 斑馬魚的胚胎發育階段 27. 16.

(24) 圖 1－8 斑馬魚各階段的胚胎發育圖 27. 17.

(25) 1.3.3 斑馬魚早期胚胎的卵胞質分離基本上，胚胎發育的過程乃受一連串相關分子和基因的調控而完成。就動物胚胎而言，因為胚胎自身的基因組無法在卵子受精之初便開始作用，所以從卵子受精到胚胎自身基因組開始活化的這段時間， 55. 主要依賴於卵黃所提供的養分和母體因子(maternal factor) 進行胚胎分裂。當精子進入卵子之後，會造成卵的細胞質移動，此移動在受精卵產生極性(兩端不同的動物極和植物極)與訊息分子的分布不均，使原本均勻分布在卵黃內的細胞質（non-yolky cytoplasm）從植物極開始流往動物極方向集中，之後細胞分裂產生囊胚（如圖 1－9 所示）。. 圖 1－9 卵細胞內細胞胞質的流動（ooplasmic streaming）示意圖 56. 18.

(26) 在斑馬魚胚胎的發育過程中，微管（microtubule）是十分重要的，如圖 1－10 所示，它從卵黃皮層（yolk cortex）組成密集的平行陣列（parallel array），並延伸至囊胚的邊緣，傳遞來自植物極卵黃細胞的物質。而卵細胞內細胞胞質的流動（ooplasmic streaming），是細胞胞器或囊泡透過驅動蛋白（kinesin）在微管上運送所造成細胞質移動的現象。這些細胞質內的物質包括訊息核糖核甘酸（mRNA）、轉錄因子（Transcription factor）、蛋白質和激酶（protein kinase）、能量儲存或傳遞物質、以及許多並未被定義的物質，是影響胚胎發育、腹背軸（dorsoventral axis）形成以及決定未來細胞命運（cell fate）的重要關 57. 鍵。. 圖 1－10 斑馬魚胚胎微管分佈的免疫螢光影像（a）在 256－cell stage 可明顯看見微管（b）局部高倍率影像，微管從 marginal blastomeres (mb) 延伸到 yolk cytoplasmic layer (ycl)。56 19.

(27) 57. 在 1997 年 Jesuthasan 和 Strahle 研究團隊，將 0.2 μm 的螢光聚苯乙烯微粒（polystyrene beads）以顯微注射送入 1-cell 至 6-cell stage 的斑馬魚胚胎卵黃細胞，進行即時（ real-time ）的單一粒子追蹤（single-particle tracking）。在 16-cell stage 觀測到微粒從植物極到動物極之間以跳躍式運動（saltatory movement）進行移動，並藉由比較有無添加有絲分裂抑制劑（nocodazole；可抑制細胞和細胞核分裂等依賴微管的過程）的結果，推斷微管對於植物半球到囊胚邊緣之間的物質傳輸是必須且重要的，且這些物質將影響胚胎軸向的形成。. 1.4 研究動機螢光奈米鑽石具有許多獨特性質，包括極佳的化學惰性、高生物相容性、易於將生物分子修飾在表面的特性以及良好的光穩定性，無光漂白（photobleaching）及光閃爍（photoblinking），且(N-V)－缺陷中心其螢光放光為 600－800 nm 的紅外光波段，與生物的自體螢光的 400－550 nm 綠光波段分開，可以減少觀察時的背景訊號，使其近年來廣泛地被應用於生物顯影研究上。以動力學的角度來考慮，螢光探針（fluorescent probe）要具有好的生物應用性，除了要有良好的生物相容性外，還需考慮螢光探針的大小。根據 Stokes-Einstein equation，小的螢光探針其流體力學半徑 20.

(28) （hydrodynamic radius）小，因此擴散係數（diffusion coefficient）大且流動性佳（mobility），較適合用來觀察細胞內結構與動態行為。先前的關於母卵細胞質分離（ooplasmic segregation）的研究，多是利用光學追蹤卵細胞內的胞質和卵黃細粒（yolk granules）的方式來探討細胞質移動. 56-59. 。將螢光探針例如螢光標記的葡萄聚醣. （dextran）、蛋白質和聚苯乙烯微粒（polystyrene beads），以顯微注射（microinjection）搭配顯微鏡的方法來提高細胞質動態的可視化（visualization）。然而，目前卻尚未有大量的數據統計分析，針對此細胞質移動動態做更進一步的詳細探討。因此，本篇論文以斑馬魚為模式生物，利用大小 100 nm 的螢光奈米鑽石作為奈米探針，以顯微注射裝置將螢光奈米鑽石注入單細胞時期斑馬魚胚胎的卵黃細胞，進行長時間的追蹤及觀察細胞質流的運動過程，並利用單一粒子追蹤技術來探查粒子的移動動態，討論其擴散係數及速度，期望未來能將螢光奈米鑽石應用於胚胎發育的研究。. 21.

(29) 第二章實驗方法 2.1 藥品  Synthetic diamond：Elementsix Micron+ MDA, 0-0.1 micron  Sulfuric acid 95-97%： J. T. Baker  Nitric acid 69-70%： ACROS  Ethanol 95%：友和  PBS(Phosphate-Buffered Saline, Ph=7.4)：GIBCO  BSA(Albumin from bovine serum)：Sigma-Aldrich  PTU(1-phenyl-2-thiourea)：Sigma-Aldrich  HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )： Sigma-Aldrich  Potassium chloride：和光  Sodium chloride：ACROS  Calcium chloride：藥理  Agarose gel：Sigma-Aldrich  Tricaine（3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate）： Sigma-Aldrich. 22.

(30) 2.2 儀器  超音波震盪器：Delta DC150  試管振盪器：Scientific industries Vortex-Genie 2  離心機：Kubota 3750  管狀高溫爐：Caeser D-55  二次水製造機：Milipore Simplicity  聚焦式微波化學反應系統：CEM Discover BenchMate  真空迴旋濃縮儀：Panchum Scientific Corp.  動態光散射粒徑分析儀： Bechman Coulter  解剖顯微鏡  顯微注射裝置：Narishige Microinjector IM-300  毛細管製作器：MAJOR P-97  螢光顯微鏡：Nikon TE2000  雷射掃描式共軛焦系統：NIKON C1  螢光光譜儀：Hamamatsu C7374 利用光學元件架設一套可偵測鑽石螢光光譜的裝置。一般而言，螢光光譜儀的設置，通常都在與入射光垂直的位置偵測螢光，但由於鑽石的高折射率（2.42），會使得溶液與鑽石的介面上極易產生散射光，因此並不適合用來量測螢光鑽石，因為極大部分的訊號都會由於 23.

(31) 鑽石的散射而使得偵測效率降低，因此本裝置利用類似螢光顯微鏡的收光方式進行螢光光譜測量（圖 2－1）。光源部分由固態雷射(JL-LD532-GTE；Jetlaser)提供波長 532 奈米的綠光，經由兩片反射鏡射向雙色分光鏡（dichroic mirror, Chroma Tech., Z532RDC），反射後進入十倍物鏡（Nikon Plan Fluor 10x）聚焦到樣品上，樣品受到雷射激發後產出紅色螢光，由物鏡收光後通過雙色分光鏡及長通濾片（Chroma Tech., 550LP），以聚焦透鏡（焦距 5 公分）聚焦將螢光耦合至多道光譜儀（multichannel spectrometer, Hamamatsu C7374）的光纖中，透過光譜儀所提供的電腦軟體分析，最後得到螢光光譜。. 圖 2－1 螢光光譜儀光路設計圖. 24.

(32)  離子束佈值裝置此裝置為實驗室所架設之離子佈植裝置系統（圖 2－2 ），主要包含三個部分：離子源（ion source）產生欲佈植的離子、加速器（accelerator）利用靜電場將離子加速到高動能、佈植室（ target chamber）為進行佈植時，標靶（target）樣品所在空間。離子源部分，主要由震盪器（oscillator, NEC Model 2HA036900）與電源供應器（oscillator power supply, NEC standard model 2HA036910）組成。震盪器則包含兩個功率放大四極管（power tetrode）與一個多重震盪線圈（mutivibratior circuit）。加速器則是由五萬伏特隔離變壓器（50 keV isolation transformer, NEC model 2HA068300）與電源供應器構成。電源供應器的電壓經由變壓器升壓至 40 keV 的高電壓後，連接到加速器的前端，而加速器的尾端則接地維持其電位為零，使得加速器前後有四萬伏特的電位差將離子加速。加速後的離子會直接靶擊位於佈植室中銅帶上的奈米鑽石樣品，同時轉動系統會帶動銅帶轉動，使得銅帶上的奈米鑽石樣品能夠均勻地被氦離子輻射（irradiation）。裝置主要分為兩大部分，以中間移動隔版分離前後兩部分（圖 2 －3）。前半部主要為離子源（RF source）及加速器部分，真空系統則由兩部渦輪幫浦和一台機械幫浦將壓力抽至 1 x 10-7 Torr，並使壓力維持在高真空；而後半部則主要為佈植室，由另外兩部渦輪幫浦和 25.

(33) 一台機械幫浦維持真空，其中渦輪幫浦及佈植室之間也以移動隔版相互分隔。在放置樣品時，必須先將壓力提升至一大氣壓，所以在破真空時需先將隔版放下，待樣品放入後，先以機械幫浦將壓力降至 200 mTorr 後，再把隔版打開，由兩渦輪幫補將壓力抽至 1 x 10-6 Torr，才能進行離子束佈植。. 圖2－2. 40 keV He離子束佈值裝置全貌，由左到右依序為為離子源、. 加速器及佈植室。. 26.

(34) 圖 2－3. 40 keV He 離子束佈值裝置簡圖，由左到右依序為為離子源、. 加速器及佈植室，樣品則先鋪在銅帶上。60. 2.3 螢光奈米鑽石製備由於人工合成的鑽石表面可能有帶有其他雜質，所以在使用前必須先經過前處理的步驟。首先取 700 mg 的奈米鑽石，製於玻璃皿中並加入適量的 95%乙醇，以超音波震盪器震盪至奈米鑽石均勻分布於玻璃皿中並乾燥，再置於高溫爐中以 450℃加熱 2 小時，利用空氣中的氧氣進行氧蝕（oxygen etching）以去除鑽石顆粒表面的不純物和雜質，再把鑽石粉末移置單頸圓底瓶中加入高濃度的硫酸及硝酸混合液（H2SO4-HNO3 ,v/v= 3：1），以超音波震盪器震盪使鑽石均勻混合強酸液，接著利用微波反應器在 100℃下反應 3 小時。之後以大量去離子水及高速離心的方式中和酸液，隨即將清洗過的奈米鑽石加入 25 27.

(35) 毫升 95%的乙醇，並用超音波中震盪 20 分鐘讓鑽石粉末均勻懸浮在溶液中。將此懸浮液均勻地鋪在乾淨的銅帶（長 20 公尺，寬 30 毫米）上，並用熱空氣加熱使溶劑蒸發以乾燥銅帶，如此將形成一厚度約為 300nm 的奈米鑽石薄層，以進入離子束佈植程序 60。利用自行架設的離子束佈植裝置（圖 2－2 及圖 2－3）進行離子佈植，將已佈滿奈米鑽石的銅帶放入佈植室，先用機械幫浦將壓力抽至 5 × 10-2 torr，在以渦輪幫浦（turbo pump）將壓力抽至低於 1 × 10-6 torr，接著打開氦氣閥、高壓系統（40 keV accelerator）與轉動系統，進行氦離子束佈植。然而，由於人工方式鋪佈鑽石不容易均勻分布於銅帶上，使得鑽石所接受到的輻射因厚度不同而有所差異，因此會將鑽石取下來重新鋪於銅帶上，重複第二次離子佈植步驟，以減少輻射不均所造成的影響。平均而言，每單位面積所接受氦離子的劑量約為 1×1013 cm-2。完成離子佈植後，使用無棉絮的棉棒沾取酒精將奈米鑽石顆粒自銅帶上刮取下，乾燥後放置於石英管中在溫度 800℃、壓力 60 mTorr 的條件下於橫式管狀高溫爐中，進行 2 小時的高溫退火程序。接著移除真空系統並調整溫度至 450℃維持兩小時，以移除退火過程中鑽石表面形成的石墨結構 61。最後，將鑽石粉末取出加入高濃度的硫酸及硝酸混合液（v/v= 3：1），利用微波反應器在 100℃下反應 3 小時，將氧蝕階段未去除的石墨層移除以及使鑽石官能基化帶有 28.

(36) -COOH 基團而產生親水性. 62. 。最後再以去離子水中和、洗淨及利用. 高速離心機離心乾燥後以便後續實驗使用。. 圖 2－4 螢光奈米鑽石製備流程圖. 2.4 螢光奈米鑽石修飾牛血清白蛋白秤取螢光奈米鑽石 1mg，加入去離子水配成濃度 1 mg/mL 的溶液，並至於超音波震盪器中震盪 30 分鐘，再加入 1mg 牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）後用 vortex 搖晃混合約 30 分鐘。待蛋白質均勻吸附在奈米鑽石表面上後，將混合液置於 filter （Amicon Ultra －15,100 K）內，加入 PBS 溶液用離心機離心，重覆同動作三次左右，以洗去過多未吸附在奈米鑽石表面上的蛋白質。最後以 PBS 回溶已修飾 BSA 的螢光奈米鑽石，儲存於 4℃冰箱。 29.

(37) 2.5 螢光光譜測量先以螢光奈米鑽石標準品校正螢光光譜儀之光路，將待測之螢光奈米鑽石配置成 1 mg/ml 水溶液，測量其光譜圖。. 2.6 斑馬魚培養及胚胎收集實驗動物斑馬魚（Danio rerio, AB strain）由台灣大學生命科學系李士傑教授實驗室提供。斑馬魚在水溫 28.5℃下以 14 小時光照/10 小時黑暗的光週期進行馴養 25。在魚卵受精後進行 1－cell stage 的胚胎收集，並培養在 Ringer’s solution（116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES）中。胚胎的各時期根據其外觀形態進行辨別 27。後續如要進行成魚的顯微鏡觀測，須將胚胎在 22-24 hpf（hours post fertilization）前浸泡於 5％ PTU Ringer’s solution 抑制黑色素的生成，以減少胚胎在螢光顯微鏡下的自體螢光 63。. 30.

(38) 2.7 長時間影像觀測的斑馬魚胚胎固定為了使斑馬魚成魚在顯微鏡下能穩定地進行長時間的影像觀測，需事先將其固定於玻片上 63，如圖 2－5 所示。先準備 1％ low melt agarose solution（15 mg agarose ＋15 mL 去離子水以微波加熱 30 秒），並保存在 42℃下避免凝固。以 20 mL 0.02 ％ tricaine 麻醉斑馬魚胚胎。將鐵氟龍圓環以 vacuum grease 粘至載玻片上固定，把麻醉後的胚胎移至載玻片的圓環中並滴上 42℃ agarose solution，調整胚胎的位置直到 agarose 凝固變硬，再以 0.02 ％ tricaine PTU Ringer’s solution 填滿圓環，最後以蓋玻片密封。. 圖 2－5 斑馬魚胚胎固定於載玻片示意圖. 31.

(39) 2.8 顯微注射先將直徑 1mm 之毛細管以毛細管製作器拉成針形，把已修飾 BSA 的螢光奈米鑽石 PBS 溶液（1 mg/mL）緩慢填入毛細管中，注意過程中不能有氣泡產生，否則在進行顯微注射時易有塞針的情況發生，最後將毛細管針裝置於顯微注射器上。在培養皿中放一載玻片作為受精卵之固定置卵盤，將收集到的斑馬魚胚胎（1～2 cell stage）一顆顆整齊排列在置卵盤中，注射位置依實驗需求分兩部分，一個位於胚胎的卵黃，另一個則位於胚胎的囊胚部份，每劑注射量約 5 nL。之後再將胚胎置於培養液中。. 圖 2－6 (a) BSA-coated FND 於斑馬魚胚胎卵黃的顯微注射示意圖 (b) 1 cell-stage 斑馬魚胚胎的亮視野影像，scale bar=250μm. 32.

(40) 2.9 胚胎影像以倒立式螢光顯微鏡（TE2000, Nikon）進行斑馬魚胚胎的影像拍攝，藉由微分干涉差(differential interference contrast, DIC)先觀察胚胎在白光下的影像，而為了觀察個別的螢光奈米鑽石粒子在胚胎內的移動情形，以 continuous-wave 532 nm（100 mW）固態雷射取代原本的 100 W 汞燈當作激發光源，以 20 X objective 搭配 1.5-fold lens 聚焦激發光源並以 electron-multiplying CCD camera（iXon, Andor）偵測螢光影像。錄製影像（video）的部分，影像每間隔 270 ms 取一次，每一影格（frame）曝光時間（exposure time）為 100 ms。最後再將 tif 檔影像轉檔成 avi 檔的錄影。另外，可再藉由雷射共聚焦掃描系統（confocal laser scanning system, C1 Nikon）搭配 561 nm 雷射和 488 nm 雷射掃描胚胎 z 軸方向的螢光，得到不同 z 軸的 xy 切面圖。. 33.

(41) 第三章結果與討論 3.1 螢光奈米鑽石利用 2.3 所敘述之方法，使用 40 keV He 離子束進行鑽石的離子佈植，經過高溫退火和酸洗後完成螢光奈米鑽石之製備。利用圖 2-1 的螢光光譜儀裝置進行偵測，樣品溶液濃度皆為 1 mg/mL，測量條件如下，激發波長為 532 nm 綠光雷射，功率為 25 毫瓦，每張光譜的收光時間為 100 毫秒，連續取三百張光譜後求其平均所得，以減少懸浮液的螢光變動（fluctuation），得到螢光光譜圖（圖 3－2）。在圖 3－2 中，黑色線代表以 3 MeV H 離子束佈值的標準品，紅色線代表以 40 keV He 離子束佈植的樣品，灰色線則代表未接受離子束佈值只經過酸洗處理的奈米鑽石。透過比較此三個樣品的圖譜可知，有經處理之鑽石其螢光強度明顯遠大未經處理的鑽石，而不同能量之離子束所產生之晶格空缺（vacancy）數量不相同，因此有螢光強弱的差異，但其發光中心的 zero-phonon-line 光譜特性是相同的，N-V0 為 575nm，N-V—則是 638nm。然而，未修飾的螢光奈米鑽石在生物介質（如 phosphate buffered sline, PBS 可維持細胞的 pH 值）中的懸浮性卻很差，有嚴重的聚集（agglomeration）問題，為了使螢光奈米鑽石在離子溶液內有良好的懸浮性，我們在其表面進行牛血清白蛋白（BSA）的修飾 64。 34.

(42) 由圖 3－1 的粒徑分佈圖可得知，在 PBS 溶液中有修飾 BSA 的螢光奈米鑽石其粒徑分佈為 126±34 nm，而未修飾 BSA 螢光奈米鑽石在相同的高離子強度溶液下其粒徑幾乎是三倍大。除此之外，圖 3－1 的插圖也顯示了兩者在 PBS 溶液中懸浮性的差異，左邊為有修飾 BSA 的螢光奈米鑽石經過幾個禮拜後其懸浮性仍然保持穩定，相較於未修飾 BSA 螢光奈米鑽石則是 1 小時後便明顯沉澱於底部。而在圖 3－2 中，藍色線代表有修飾 BSA 的螢光奈米鑽石，與沒有修飾 BSA 的螢光奈米鑽石相比較，發現其螢光強度雖稍有下降，但仍足夠進行胚胎的顯影標記和追蹤。. 圖 3－1 修飾 BSA 前後螢光奈米鑽石在 PBS 溶液之粒徑分佈。右邊插圖為有修飾 BSA 和未修飾 BSA 之螢光奈米鑽石懸浮在 PBS 溶液的對照圖，濃度為 1 mg/mL。 35.

(43) 圖 3－2 螢光奈米鑽石螢光光譜圖. 36.

(44) 3.2 螢光奈米鑽石於斑馬魚之生物分佈我們利用 1－cell stage 的斑馬魚胚胎進行螢光奈米鑽石的顯微注射並觀察活體顯影。首先，以未修飾 BSA 的螢光奈米鑽石進行顯微注射，注射位置為卵黃部分(圖 2－6 a)，注射量約 12.5 ng，利用倒立式螢光顯微鏡進行觀測，圖 3－3 為斑馬魚胚胎在不同時期 3 hpf 和 10 hpf 的胚胎影像。在圖 3－3b 中，處於囊胚期的胚胎正進行快速的細胞分裂，可明顯觀察到粒子集中於胚盤的中央且有明顯的聚集（aggregation）情形。而圖 3－3d 中，原腸胚期的胚胎其表胚層已進行至 100%外包階段，也是有嚴重的粒子聚集情況。. 圖 3－3 未修飾 BSA 螢光奈米鑽石於 3 hpf(b)和 10 hpf(d)時期斑馬魚胚胎的活體 DIC 影像和 cofocal 疊圖，(a) (c) 分別為同時期未進行顯微注射的控制組（control）。 37.

(45) 為了減少螢光奈米鑽石在胚胎內聚集的情形，我們利用表面修飾 BSA 之螢光奈米鑽石進行顯微注射，圖 3－4（a）（b）為斑馬魚胚胎在不同時期 4.5 hpf 和 24 hpf 的胚胎影像。在圖 3－4a 中，處於囊胚期的胚胎正由表胚層開始進行外包，從 confocal 影像中可明顯觀察到螢光奈米鑽石大多數分佈於正在分裂的胚盤中，僅少量的螢光奈米鑽石位於植物極卵黃的周圍。參考 Leung 等人 56 所提出的胚胎細胞質流（ooplasmic streaming）動向推斷，他們認為卵胞質流的力量是藉由 cortical shoulder constriction 擠壓卵黃內的胞質向上，進而產生軸向流動（axial streaming）至胚盤中，再沿著周圍向下流往植物極（參考圖圖 1－9）。藉此對照圖中螢光奈米鑽石分佈的結果與上述論點是吻合的。圖 3－3b 則為處於咽胚期的斑馬魚，此時胚胎的自體螢光因為色素生成的關係所已變得較為明顯，但與圖 3－3c 未接受顯微注射的控制組相比較，仍可辨別出螢光奈米鑽石分佈於卵黃囊和心臟以及體節中，表示隨著斑馬於胚胎的生長，鑽石粒子會隨機地散佈於其體內，並非集中於某特定器官或組織中。. 38.

(46) 圖 3－4 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於不同時期斑馬魚的活體分佈 DIC 影像、cofocal 影像在 z 軸的 xy 切面圖以及不同 z 軸的疊圖。（a）4.5 hpf（b）24 hpf（c）control，scale bar＝100μm. 39.

(47) 接著我們嘗試將注射量降低到約 5 ng，並觀測在不同階段活體影像。以圖 3－5a 的結果與圖 3－3b 相互比較，可發現因修飾 BSA 之螢光奈米鑽石在生物介質 PBS 下懸浮性佳，粒子在囊胚的分佈大小較為均勻，沒有明顯的聚集情形。而圖 3－5b 也顯示在體節形成期的胚胎，鑽石粒子也是均勻分布在整個發育中的體節和卵黃囊之中。此外，雖然注射量下降，但在胚胎發育後期階段圖 3－6a 咽胚期和圖 3－6b 孵化期的幼體（larva）螢光影像中仍可觀察出鑽石粒子均勻地分佈於各個組織，且與同時期未進行顯微注射的 control 組互相比較斑馬魚之外觀和形態，並未有畸形缺陷或者發育不良的情形，表示 BSA 修飾的螢光奈米鑽石對脊椎動物的生長發育不會造成有害之影響，提升了長時間活體內顯影觀測之應用性。. 40.

(48) 圖 3－5 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚胚胎的活體分佈 DIC 影像和 cofocal 影像（a）4.3 hpf（b）12 hpf，（c）（d）分別為同時期未進行顯微注射的控制組（control），scale bar＝250 μm。. 圖 3－6 修飾 BSA 螢光奈米鑽石於斑馬魚幼體的活體分佈 DIC 影像和 cofocal 影像（a）30 hpf（b）72 hpf，（c）（d）分別為同時期未進行顯微注射的控制組（control），scale bar＝250 μm。. 41.

(49) 3.3 螢光奈米鑽石於斑馬魚胚胎之細胞質動態在確定 BSA 修飾能改善螢光奈米鑽石在胚胎內的聚集 (aggregation)，且在顯微鏡下能清楚的觀測到粒子的螢光影像後，我們進一步利用其來探討早期胚胎之細胞質移動。為了達到長時間追蹤細胞質動態之目的，我們以 BSA 修飾螢光奈米鑽石進行 1－cell stage 胚胎顯微注射後，使用倒立式螢光顯微鏡長時間連續觀測同一顆胚胎的螢光影像。圖 3－7 為連續拍攝 1 小時後於不同時間點的影像，此時的胚胎正處於細胞快速分裂的卵裂期，約間隔 15 分鐘進行一次細胞分裂，而胚胎的卵黃雖然注射了大量的鑽石粒子，但囊胚的細胞分裂仍然持續地進行，經過 1 小時候後細胞數量增加了約 16 倍，顯示胚胎的發育是正常的。參考 Kimmel 等人的文獻 65，他們認為在此時囊胚裡的各細胞和下方的卵黃細胞之間會維持某種程度的開放式連結，以讓中等大小（17-kDa）的分子能自由地從胚葉細胞通過移動到下一個，而在圖 3－7 的螢光影像中，可以清楚看見大小均勻的螢光鑽石粒子從卵黃的植物極往動物極方向的囊胚進行擴散移動，到了卵黃與囊胚交界處則隨著胚葉細胞分裂分佈至各個細胞之中。. 42.

(50) 圖 3－7 螢光奈米鑽石於胚胎卵黃內之長時間細胞質流追蹤螢光影像，（a）1.5 hpf（b）1.75 hpf（c）1.85 hpf（d）2.25 hpf. 43.

(51) 第四章結論在本篇研究中，我們首次將螢光奈米鑽石此新穎的奈米材料做為螢光探針（fluorescent probe）應用於模式動物斑馬魚，利用顯微注射的方法將螢光奈米鑽石送入斑馬魚胚胎內，進行長時間的觀察與影像追蹤，探討胚胎卵黃細胞之細胞質動態。藉其優異的光穩定性，我們能持續地以精確的空間定位進行粒子在二維方向移動之長期或短期偵測。此外，螢光奈米鑽石也能持續穩定存留在細胞分裂的囊胚中，隨著胚胎發育最後分散於幼體之中，且在胚胎形成（embryogenesis）上未有異常的外觀和型態。因此，螢光奈米鑽石好的生物相容性及光穩定性，使其未來對於生物之長期或短期活體影像追蹤或是研究藥物動力學相關領域上，有良好的潛力和應用價值。. 44.

(52) 第五章參考文獻 1 2 3. 4 5. 6 7. 8 9 10 11. 12. 13. 14 15. Johnson, I. Review: Fluorescent probes for living cells. The Histochemical Journal 30, 123-140, doi:10.1023/a:1003287101868 (1998). Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67, 509-544, doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.509 (1998). Lippincott-Schwartz, J., Altan-Bonnet, N. & Patterson, G. H. Review: Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nature Cell Biology 5, S7–S14, doi:10.1038/ncb1032 (2003). Michalet, X. et al. Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science 307, 538-544, doi:10.1126/science.1104274 (2005). Chan, W. C. W. & Nie, S. Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection. Science 281, 2016-2018, doi:10.1126/science.281.5385.2016 (1998). Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A. & Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nat Meth 7, 275-285 (2010). Derfus, A. M., Chan, W. C. W. & Bhatia, S. N. Probing the Cytotoxicity of Semiconductor Quantum Dots. Nano Letters 4, 11-18, doi:10.1021/nl0347334 (2003). Nirmal, M. et al. Fluorescence intermittency in single cadmium selenide nanocrystals. Nature 383, 802-804 (1996). Mahler, B. et al. Towards non-blinking colloidal quantum dots. Nat Mater 7, 659-664 (2008). Schrand, A. M. et al. Are Diamond Nanoparticles Cytotoxic? The Journal of Physical Chemistry B 111, 2-7, doi:10.1021/jp066387v (2006). Nguyen, T. T.-B., Chang, H.-C. & Wu, V. W.-K. Adsorption and hydrolytic activity of lysozyme on diamond nanocrystallites. Diamond and Related Materials 16, 872-876, doi:10.1016/j.diamond.2007.01.030 (2007). Yu, S.-J., Kang, M.-W., Chang, H.-C., Chen, K.-M. & Yu, Y.-C. Bright Fluorescent Nanodiamonds: No Photobleaching and Low Cytotoxicity. Journal of the American Chemical Society 127, 17604-17605, doi:10.1021/ja0567081 (2005). Fu, C.-C. et al. Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 727-732, doi:10.1073/pnas.0605409104 (2007). Davies, G. & INSPEC. Properties and growth of diamond. (INSPEC, the Institution of Electrical Engineers, 1994). Davies, G. & Hamer, M. F. Optical Studies of the 1.945 eV Vibronic Band in 45.

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