在已定序之 Stenotrophomonas maltophilia K279a 基因體序列 中發現在 L2 β-lactamase 基因下游有一 ampH 基因。首先去證明 L2-ampH 此基因組裝為一 operon。 利用 QRT-PCR 策略，定量菌 株 KJ, KJΔR, 及 KJΔDI 在有無誘發物的情況下， L2 及 ampH 下 游 hypothetical protein 基 因 之 RNA transcript 的 量 。 KJ 為 wild-type 菌株； KJΔR 為一在有誘發物情況下， L2 基因亦不能被 誘發的突變株 (non-inducibility mutant) (Lin, C.W., et al., 2009)[26] ； KJΔDI 為 一 在 無 誘 發 物 情 況 下 ， L2 亦 會 持 續 表 現 的 突 變 株 (constitutive expression mutant) (Lin, C.W., et al., 2009)[26] 。結果顯示:
ampH 基因的 RNA 表現量無論在何種菌株皆會隨著 L2 基因的 RNA 表現量平行的上升或下降 (圖 4)，但 hypothetical protein RNA 的量則沒有明顯的變化。此結果支持了 L2-ampH 基因組裝為一 operon 的論點。此外， RT-PCR 及 agarose 電泳分析證實在菌體中 確實存在有一 RNA transcript 其可橫跨 L2 與 ampH 基因，涵蓋 L2-ampH 之 intergenic region (IG)。所以，證實了 L2-ampH 基因組 裝的確為一 operon。
為進一步了解是否在其他菌體中，亦有相似之 β-lactamase-ampH
43
operon 組 裝 ， 將 L2 β-lactamase 蛋 白 序 列 利 用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 網站比對搜索，比對到在有些菌體其染 色體上存有與 L2 β-lactamase 相似的 β-lactamase 基因 (表 7) 。而
進一步分析這些菌種的 β-lactamase 基因之下游基因，皆未發現其存 在有類似 AmpH 的蛋白。所以，在 S. maltophilia 存在之 L2-ampH operon 是一個獨特的組裝。
Operon 這個名詞最早是在原核生物及線蟲動物門被發現，以 operon 來說，包含兩個或以上的結構基因，這些結構基因會被轉錄 成為一個多基因性的 mRNA 。而在結構基因的上游是 promoter 的 序列，能給予 RNA polymerase 提供結合點及引發轉錄 (
Platt, T.,
et al., 1970)[50]。第一個被發現有 operon 存在的是 Escherichia coli 的 lac-operon (Jacob, F., et al., 1960)[51]。以現有的技術平台要預測是否有 operon 的存在有幾種方法，(1) 藉由觀察基因與基因之間的間隔 (intergenic region) 去預測 (Ermolaeva, White et al. 2001)[52]；(2) 從已 解 開 的 基 因 序 列 的 菌 株 去 分 析 ， 有 一 個 分 析 網 站 可 以 提 供 資 訊 (OperonDB ; http://operondb.cbcb.umd.edu/cgi-bin/operondb/operons.cgi
) (表 8)。在本論文中利用此兩種方法去預測 operon ，兩種方法預測結果都支 持 L2-ampH-hp 基因組裝是一個 operon 。但是，實驗結果則是支持 L2-ampH 此兩基因組裝才是一 operon。
44
接著對於 L2 及 ampH 基因的表現量做分析，去了解此 operon 的表現模式，實驗結果顯示在沒有誘發物的條件下菌株 KJAmpHxylE
所表現的C23O 活性略高於 KJL2xylE 所表現的 C23O 活性 ( 65vs 3 Uc/OD450nm， 表 2)，此說明 ampH 基因有自己的啟動子。有誘發物 (30 μl/mg cefuroxime.) 的條件下，菌株 KJL2xylE C23O 活性明顯比 KJAmpHxylE 高 ( 411 vs 183 Uc/OD450nm， 表 2)，這代表 L2 基因的 表 現 量 比 ampH 基 因 多 ； 所 以 此 operon 的 表 現 屬 於 down regulation 的模式。 所以就此 operon 的表現型式而言， L2 與 ampH 基因之表現同時受 L2 promoter (PL2) 的驅使，且 PL2 啟動 L2 與 ampH 基因的方式為 inducible 且 down-regulation 。此外，ampH 基 因之表現除了受 PL2 啟動子影響外， ampH 基因有自己的啟動子 (PampH)，但相較於 PL2 啟動子
，
PampH 啟動子的強度明顯小很多 (表 2)。雖然 ampH 最早命名為 Na+/H+ antiporter ，但實驗結果發現其 功能與鈉鹽平衡的相關性並不明顯。 S. maltophilia 之 L2 基因其調 控機制已在本實驗室中分析研究 (Lin CW. et al., 2009)[26] ，對於 ampH 基因及其產物的功能特性則沒有文獻報導過。所以，先以 bioinformatics 去分析 AmpH 蛋白序列，想對於 ampH 基因及其產 物有初步的認識。利用 PCR 將菌株 KJ 之 ampH 基因轉殖出來，
45
定出其蛋白序列並分析。分析結果顯示此 AmpH 蛋白為一個 N 端 與 C 端都位於細胞質內的穿膜蛋白，有 404 個氨基酸及 12 個穿膜 區。之後再將 AmpH 蛋白序列進行資料庫 BlastP 分析，結果顯示 此蛋白與 S. maltophilia K279a 、 R551-3 和 Xylella fastidiosa 9a5c 這三株細菌的類似蛋白 (homologues) 相同度很高 ( 100%、98%、70%，
表 4 )，但此三株細菌都只將定序序列發表，並未對該基因之功能特
性有所報導。而文獻中已確知與維持鈉鹽類平衡有關之蛋白，如 E.
coli 之 NhaA, NhaB, ChaA, 及 MdfA ; Vibrio cholera 之 NhaA, NhaB, 及 NhaD ; P. aeruginosa 之 NhaP，其與 AmpH 蛋白之相同度 並不高 (30-65%，表 4) 。這樣的結果顯示 AmpH 蛋白的主要功能不 是維持鈉鹽類平衡，而 S. maltophilia 中應有其他的 Na+/H+ antiporter 蛋白主導鈉鹽類平衡。在一般的情況下，細菌體內會存在多個 Na+/H+ antiporters 幫 忙 協 助 體 內 pH 值 和 鈉 鹽 的 平 衡 。 藉 由 分 析 S.
maltophilia K279a 菌株的基因體序列發現到共有三個基因命名為 Na+/H+ antiporters ， 其 基 因 編 號 分 別 為 Smlt3721 、 Smlt1521 和 Smlt0555，而本論文中的 ampH 基因即為 Smlt3721。對於此三基因 蛋白做比對，發現 Smlt1521 和 Smlt0555 與 Smlt3721 的相同度分 別只有 45% 及 29% ，其主要蛋白序列差異很大。這意味著此三個 Na+/H+ antiporters 在生理學的角色上可能有不同的定位，而且也支持
46
AmpH 蛋白的功能似乎與維持鈉鹽類平衡關係不明顯。
接著想了解 AmpH 蛋白與鈉鹽類之間的關係，利用觀察不同 AmpH 蛋白表現量的突變株 (菌株 KJ, KJΔAmpH, KJ(pRKAmpH) ) 在不同鈉鹽類濃度下的生長曲線 ( growth curve)。 結果顯示，無論 AmpH 蛋白的表現量是正常、沒有表現或是多量表現，其生長曲線 不受鈉鹽濃度的影響（圖7）。所以，生長曲線實驗說明 AmpH 蛋白 的功能似乎與維持鈉鹽類平衡關係不明顯。
此外，在一般細菌生物體，其 Na+/H+ antiporter 基因之啟動子強 弱與生長環境中 NaCl 的濃度成正比。本論文中的 ampH 基因本在 基因體序列中命名為 Na+/H+ antiporter 基因，且其表現受 L2
、
ampH 啟動子控制。因此想要了解鈉鹽類濃度是否會調控 ampH 基因啟動 子的強弱。利用chromosomal transcriptional fusion assay，結果顯示當 KJAmpHxylE 在沒有誘發物的條件下，C23O 活性在 0M NaCl 略比 0.2M NaCl 高 ( 21 vs 14 Uc/OD450nm ，表5) ；在有誘發物的條件下，KJL2xylE C23O 活性在 0M NaCl 比 0.2M NaCl 高 (153 vs 120 Uc/OD450nm，表5) 。可以確定的是 NaCl 濃度的確影響 L2 及 ampH 基因的啟動子強度。然而，培養基中NaCl 濃度跟 L2 及 ampH 基因 啟動子的強度卻是呈現反比的關係。這個現象與之前的認知在有較高 濃度 NaCl 的環境下會增加 Na+/H+ antiporter 基因的表現 (Pinner,
47
Kotler et al. 1993; Utsugi, Inaba et al. 1998; Lewinson, Padan et al. 2004)
[47-49]是不相符合的。
所以經由上述三個實驗結果，(1) bioinformatics 分析 (2) growth curve 分析 (3) PL2 及 PampH promotor 分析，支持 AmpH 蛋白的主要 功能與維持鈉鹽類平衡較不相關。而基因體定序資料庫中將此基因命 名為 Na+/H+ antiporter 基因不適合用來解釋 ampH 基因的功能特 性。
既然 AmpH 蛋白的功能與之前在基因體序列中命名為 Na+/H+ antiporter 基因的功能不符合，又因為 ampH 基因位於 L2 基因的下 游，所以直接聯想到 AmpH 蛋白的功能或許與 β-lactamase 的表現 有關。接著觀察不同突變株的 β-lactamase 活性分析，去了解 AmpH 蛋白與 β-lactamase 的關係。結果顯示，在有誘發物存在的條件下，
AmpH 蛋白表現量正常的原生菌株其 β-lactamase 活性比 AmpH 蛋白沒有表現的突變株 (KJΔAmpH) 還高 (1076 vs 888 Un/mg ，表 6 )，進一步去分析發現下降的是 L1 β-lactamase 的活性；而在有誘 發 物 存 在 的 條 件 下 ， AmpH 蛋 白 表 現 量 正 常 的 原 生 菌 株 其 β-lactamase 活 性 也 比 AmpH 蛋 白 過 度 表 現 的 突 變 株 (KJ(pRKAmpH)) 還高 (1076 vs 665 Un/mg ，表 6)，進一步去分析發 現下降的是 L2 β-lactamase 的活性。所以，不管 AmpH 蛋白的表現
48
量是不表現還是過度表現，都會導致 β-lactamase 的活性下降。此實 驗支持 AmpH 蛋白的主要功能可能是影響 β-lactamase 的表現。
經過一系列的實驗，證明了 L2-ampH 基因組裝為一 operon 且 此 operon 之基因 L2 與 ampH 之表現同時受 L2 promoter (PL2) 的 驅 使 ， 且 PL2 啟 動 L2 與 ampH 基 因 的 方 式 為 inducible 且 down-regulation 。此外， ampH 基因之表現除了受 PL2 啟動子影響 外， ampH 基因有自己的啟動子 (PampH)，而 AmpH 蛋白的主要功 能可能為影響β-lactamase 的表現量。
接著再以有無誘發物的情況來探討此 operon 的調控機制。如圖 8 所示，在沒有誘發物存在下，PL2 啟動子不表現，但 PampH 啟動子 微弱地表現，所以會有少量的 AmpH 蛋白被製造出來。而此少量的 AmpH 蛋白對於 L1 及 L2 β-lactamases 的誘發表現性 (inducibility)
並沒有明顯的影響，所以在沒有誘發物時，L1 及 L2 β-lactamases 呈 現 non-inducibility 的表型 。而當有誘發物存在的情況下，PL2 啟動 子誘發表現，除了表現大量的 L2 β-lactamase 外，亦誘發表現足量 的 AmpH 蛋白，此足量的 AmpH 蛋白可使 L1 β-lactamase 誘發的 表現量增加。在PL2 啟動子表現，但沒有 AmpH 蛋白的情況下，L1 β-lactamase 的誘發性 (inducibility) 不受影響，但誘發的量減少 ( 表 7, induced KJ 及 KJΔAmpH 的 L1 活 性 ) 。 但 若 以 L2
49
β-lactamase 誘發表現量來看，經由 ampR-dependent PL2 啟動子所誘 發的 AmpH 蛋白量不宜過多，過多的 AmpH 蛋白反而減少了 L2 β-lactamase 蛋白的誘發量 (表 7, induced KJ 及 KJ(pRKAmpH) 的 L2 活性) 。所以細菌菌株為了達到 L1 及 L2 β-lactamases 蛋白的最 佳誘發量，很巧妙地以 L2-ampH operon 的型式組裝，使得 AmpH 蛋 白在PL2 啟動子的誘發下足量表現，此可增加 L1 β-lactamase 的誘發 量 。 但 若 過 多 的 AmpH 蛋 白 被 誘 發 產 生 ， 則 反 而 會 折 損 L2 β-lactamase 蛋白的誘發量。所以以 L2-ampH operon down-regulation 調控的模式，控制 AmpH 蛋白的誘發量足以增加 L1 β-lactamase 的 誘發量但不會減少 L2 β-lactamase 的誘發量。
50