ampH 基因有自己的啟動子(promoter)

第三章研究結果

第二節 ampH 基因有自己的啟動子(promoter)

為了觀察 L2-ampH 此 operon 的基因表現，所使用的策略為構築 KJL2xylE 及 KJAmpHxylE 突變株，菌株 NL2xylE 為 L2 基因內插入一 xylE 基因 (reporter gene) 的突變株；菌株 KJAmpHxylE 為 ampH 基因內插入一 xylE 基因的突變株，所以此兩突變株所表現之 C23O 活性可作為 L2 基因及 ampH 基因表現量。以菌株 KJL2xylE

和 KJAmpHxylE 為檢體，分別分析在沒有誘發物及有誘發物 (30μg/ml cefoxitin) 的情況下，此兩菌株之 catechol 2,3-dioxygenase (C23O) 的表現量。結果如表 2 所示，在有誘發物的條件下 L2 基因 的表現量明顯比 ampH 基因表現量多，表示此 operon 有 down-regulation 的現象。但是在沒有誘發物的情況下， ampH 基因 表現量居然比 L2 基因還多。因此懷疑 ampH 基因有可能有啟動子的存在。

為了釐清 ampH 基因是否有啟動子的存在，所使用的策略為 plasmid transcriptional fusion assay 。以菌株 KJ(pRK415) 和 KJ(pRK567AmpHxylE) 為檢體，分別分析在沒有誘發物及有誘發物 (30μg/ml cefoxitin) 的情況下，此兩菌株之 catechol 2,3-dioxygenase (C23O) 的表現量。結果如表 3 所示，在有無誘發物的情況下菌株 KJ(pRK567AmpHxylE) C23O 的活性皆呈現一微量的表現；與 control

菌株 KJ(pRK415) 相比對後，可以發現此 ampH 基因的啟動子(PampH) 呈現一持續性微量的表現且為 non-inducibility。

第三節 Stenotrophomonas maltophilia KJ ampH 基因分析

在以往的文獻中，沒有對於 S. maltophilia 之 ampH 基因及其產物的特性分析，所以對於此基因了解甚少。為了釐清 ampH 基因及其產物的特性，以菌株 KJ 為檢體， PCR 引子 AmpH-F/AmpH-R ，利用 PCR 將菌株 KJ 之部分 L2 基因、完整 ampH 基因及部分 hp 基因的片段大量複製並選殖到 yT&A vector 中，得一重組質體 pTKJAmpH (圖 1)。再將此重組質體定序得其完整序列後，結果如圖 6 所示，分析結果顯示此 AmpH 蛋白為一個有 404 個氨基酸及 12 個穿膜區的穿膜蛋白，其 N 端與 C 端都位於細胞質內 (TMHMM Server v. 2.0,

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。

為了進一步了解 AmpH 蛋白的特性，將菌株 KJ 之 AmpH 蛋白序列進行資料庫 BlastP 分析。結果如表 4 所示，S. maltophilia KJ 之 AmpH 蛋白與 S. maltophilia K279a 與 R551-3 菌株 Na⁺/H⁺antiporter 蛋白相同度分別為100% 及 98% 。而與 Xylella fastidiosa 9a5c 菌株 之 Na⁺/H⁺antiporter 蛋白相同度為 70% 。但是，這些蛋白皆沒有文獻報導過其功能特性。反倒是與文獻報導已知具有 Na⁺/H⁺antiporter

功能的蛋白相同度不高 (30 - 65%) 。如 E. coli 之 NhaA, NhaB, ChaA, 及 MdfA ； Vibrio cholera 之 NhaA, NhaB, 及 NhaD； P.

aeruginosa 之 NhaP (Pinner, Kotler et al. 1993; Utsugi, Inaba et al.

1998; Lewinson, Padan et al. 2004)^[47-49]。其分別的蛋白相同度標示於表3 。所以，菌株 KJ 之 AmpH 蛋白預測其為一穿膜蛋白並且其功能可能不是一 Na⁺/H⁺antiporter。

第四節 AmpH 蛋白主要的功能不是鹽類耐受性 (Sodium tolerance) S. maltophilia KJ 的 AmpH 蛋白在經過資料庫比對過後，是一 個 putative Na⁺/H⁺antiporter ，而文獻中 Na⁺/H⁺antiporter 的主要功能是維持鹽類的平衡，與細菌對鈉鹽之耐受性有關 (Pinner, Kotler et al. 1993) ^[47]。

所以為了釐清 AmpH 蛋白的主要功能，是否為維持鹽類的平衡，

所使用的策略為觀察不同突變菌株在不同鈉鹽濃度下的生長情形 (growth curves) 。以菌株 S. maltophilia KJ、KJAmpH_xylE、KJΔDI 為檢體，培養在10% glucose-XOLN 分別含有 0、0.2 和 0.5 M NaCl 的培養基中。菌株 KJ 、 KJAmpH_xylE、 KJΔDI 則分別代表是 AmpH

蛋白表現量正常、沒有表現和過多表現的菌株。結果如圖7 所示，當

菌株轉換至含有 NaCl 的培養液中，菌株 KJ 、 KJAmpHxylE 、

KJΔDI 的生長曲線會有ㄧ停滯期，尤其是在 0.5 M NaCl 的條件下，

停滯期明顯延長許多。然而在不同濃度的 NaCl 培養液中，此三菌株的生長曲線是相似的，並沒有受到 NaCl 濃度的影響。

因此， AmpH 蛋白的主要功能似乎不是幫助 S. maltophilia 適應高鈉鹽 (NaCl) 的環境，而 S. maltophilia 系統中，可能有其他 Na⁺/H⁺ antiporters 或機制幫忙其適應較高鈉鹽的環境。

第五節鈉鹽 (NaCl) 濃度會影響 L2 和 ampH 基因啟動子的強度在一般細菌生物體，其 Na⁺/H⁺ antiporter 基因之啟動子強弱與 NaCl 的濃度成正比。本論文中的 ampH 基因本在基因體序列中命名 為 Na⁺/H⁺ antiporter 基因，且其表現受 L2

、

ampH 啟動子控制。為 了釐清 ampH 基因啟動子強弱是否跟鈉鹽濃度有關，所使用的策略為chromosomal transcriptional fusion assay。在含有 10% glucose 的 XOLN 培養液中加入不同濃度的鈉鹽去分析菌株 KJL2xylE 和 KJAmpHxylE 所表現的 C23O 活性。所測試的鈉鹽濃度為 0 M 和 0.2 M NaCl。有誘發物條件下所測得 KJL2xylE 之 C23O 活性以及沒有誘發物條件下所測得的 KJAmpHxylE C23O 活性分別代表 L2 和 ampH 基因啟動子的強度。結果如表 5 所示，當菌株 KJL2xylE 在有誘發物存在的條件下，其在 0.2 M NaCl 培養基中所表現的 C23O 活

性比在 0 M NaCl 培養基中所表現的 C23O 活性低；菌株 KJAmpHxylE 在沒有誘發物的條件下，亦呈現相同的趨勢。結果顯示 NaCl 濃度影響 L2 及 ampH 基因的啟動子強度，然而，培養基中 NaCl 濃度跟 L2 及 ampH 基因啟動子的強度是呈現反比的關係。這 個現象與之前的認知在有較高濃度 NaCl 的環境下會增加 Na⁺/H⁺ antiporter 基因的表現是不相符合的。由生長曲線及 chromosomal transcriptional fusion assay 之結果支持 AmpH 蛋白的主要功能與維持鈉鹽類平衡較不相關。因此基因體定序資料庫中將此基因命名為 Na⁺/H⁺ antiporter 基因不適合用來解釋 ampH 基因的特性。

第六節 AmpH 蛋白影響 L1 與 L2 β-lactamase 的表現

上述結果顯示， AmpH 蛋白主要功能似乎不是幫助 S.

maltophilia 適應高鈉鹽(NaCl) 的環境。而 ampH 基因位於 L2 基因 的下游形成一 operon 的基因組裝，因此推測 AmpH 蛋白是否與 β-lactamase 的表現量有關。為了釐清 AmpH 蛋白的功能，所使用的策略為分析 AmpH 蛋白表現量不同的 S. maltophilia 菌株其所誘發之β-lactamase 活性。以菌株 KJ 、 KJAmpHxylE 、 KJ(pRKAmpH) 為檢體，去分析其 β-lactamase 的活性。菌株 KJ、KJAmpHxylE 、 KJ(pRKAmpH) 則分別代表是 AmpH 蛋白表現量正常、沒有表現和

過度表現的菌株。結果如表6 所示，菌株 KJAmpHxylE 相對於 KJ 的 total β-lactamase 活性明顯下降，進一步利用 Nitrocefin-EDTA 方法分析發現是 L1 β-lactamase 下降；菌株 KJ(pRKAmpH) 相對於 KJ 的 total β-lactamase 活性也明顯下降，進一步去分析發現是 L2 β-lactamase 下降。此實驗結果顯示出 AmpH 蛋白無論過度表現或是不表現都會影響 β-lactamase 的表現，但影響的層面略有不同。在沒有 AmpH 蛋白的情況下，L1 的表現量下降; 而在 AmpH 過量的情況下，L2 的表現量下降。

第四章討論

在已定序之 Stenotrophomonas maltophilia K279a 基因體序列 中發現在 L2 β-lactamase 基因下游有一 ampH 基因。首先去證明 L2-ampH 此基因組裝為一 operon。利用 QRT-PCR 策略，定量菌 株 KJ, KJΔR, 及 KJΔDI 在有無誘發物的情況下， L2 及 ampH 下游 hypothetical protein 基因之 RNA transcript 的量。 KJ 為 wild-type 菌株； KJΔR 為一在有誘發物情況下， L2 基因亦不能被誘發的突變株 (non-inducibility mutant) (Lin, C.W., et al., 2009)^[26]； KJΔDI 為一在無誘發物情況下， L2 亦會持續表現的突變株 (constitutive expression mutant) (Lin, C.W., et al., 2009)^[26]。結果顯示:

ampH 基因的 RNA 表現量無論在何種菌株皆會隨著 L2 基因的 RNA 表現量平行的上升或下降 (圖 4)，但 hypothetical protein RNA 的量則沒有明顯的變化。此結果支持了 L2-ampH 基因組裝為一 operon 的論點。此外， RT-PCR 及 agarose 電泳分析證實在菌體中確實存在有一 RNA transcript 其可橫跨 L2 與 ampH 基因，涵蓋 L2-ampH 之 intergenic region (IG)。所以，證實了 L2-ampH 基因組 裝的確為一 operon。

為進一步了解是否在其他菌體中，亦有相似之 β-lactamase-ampH

operon 組裝，將 L2 β-lactamase 蛋白序列利用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 網站比對搜索，比對到在有些菌體其染色體上存有與 L2 β-lactamase 相似的 β-lactamase 基因 (表 7) 。而

進一步分析這些菌種的 β-lactamase 基因之下游基因，皆未發現其存 在有類似 AmpH 的蛋白。所以，在 S. maltophilia 存在之 L2-ampH operon 是一個獨特的組裝。

Operon 這個名詞最早是在原核生物及線蟲動物門被發現，以 operon 來說，包含兩個或以上的結構基因，這些結構基因會被轉錄成為一個多基因性的 mRNA 。而在結構基因的上游是 promoter 的序列，能給予 RNA polymerase 提供結合點及引發轉錄 (

Platt, T.,

et al., 1970)^[50]。第一個被發現有 operon 存在的是 Escherichia coli 的 lac-operon (Jacob, F., et al., 1960)^[51]。以現有的技術平台要預測是否有 operon 的存在有幾種方法，(1) 藉由觀察基因與基因之間的間隔 (intergenic region) 去預測 (Ermolaeva, White et al. 2001)^[52]；(2) 從已解開的基因序列的菌株去分析，有一個分析網站可以提供資訊 (

OperonDB ; http://operondb.cbcb.umd.edu/cgi-bin/operondb/operons.cgi

) (表 8)。

在本論文中利用此兩種方法去預測 operon ，兩種方法預測結果都支持 L2-ampH-hp 基因組裝是一個 operon 。但是，實驗結果則是支持 L2-ampH 此兩基因組裝才是一 operon。

接著對於 L2 及 ampH 基因的表現量做分析，去了解此 operon 的表現模式，實驗結果顯示在沒有誘發物的條件下菌株 KJAmpHxylE

所表現的C23O 活性略高於 KJL2xylE 所表現的 C23O 活性 ( 65vs 3 Uc/OD450nm，表 2)，此說明 ampH 基因有自己的啟動子。有誘發物 (30 μl/mg cefuroxime.) 的條件下，菌株 KJL2xylE C23O 活性明顯比 KJAmpHxylE 高 ( 411 vs 183 Uc/OD450nm，表 2)，這代表 L2 基因的表現量比 ampH 基因多；所以此 operon 的表現屬於 down regulation 的模式。所以就此 operon 的表現型式而言， L2 與 ampH 基因之表現同時受 L2 promoter (PL2) 的驅使，且 PL2 啟動 L2 與 ampH 基因的方式為 inducible 且 down-regulation 。此外，ampH 基 因之表現除了受 PL2 啟動子影響外， ampH 基因有自己的啟動子 (PampH)，但相較於 PL2 啟動子

，

PampH 啟動子的強度明顯小很多 (表 2)。

雖然 ampH 最早命名為 Na⁺/H⁺antiporter ，但實驗結果發現其功能與鈉鹽平衡的相關性並不明顯。 S. maltophilia 之 L2 基因其調控機制已在本實驗室中分析研究 (Lin CW. et al., 2009)^[26] ，對於 ampH 基因及其產物的功能特性則沒有文獻報導過。所以，先以 bioinformatics 去分析 AmpH 蛋白序列，想對於 ampH 基因及其產 物有初步的認識。利用 PCR 將菌株 KJ 之 ampH 基因轉殖出來，

定出其蛋白序列並分析。分析結果顯示此 AmpH 蛋白為一個 N 端與 C 端都位於細胞質內的穿膜蛋白，有 404 個氨基酸及 12 個穿膜區。之後再將 AmpH 蛋白序列進行資料庫 BlastP 分析，結果顯示此蛋白與 S. maltophilia K279a 、 R551-3 和 Xylella fastidiosa 9a5c 這三株細菌的類似蛋白 (homologues) 相同度很高 ( 100%、98%、70%，

表 4 )，但此三株細菌都只將定序序列發表，並未對該基因之功能特

性有所報導。而文獻中已確知與維持鈉鹽類平衡有關之蛋白，如 E.

coli 之 NhaA, NhaB, ChaA, 及 MdfA ; Vibrio cholera 之 NhaA, NhaB, 及 NhaD ; P. aeruginosa 之 NhaP，其與 AmpH 蛋白之相同度 並不高 (30-65%，表 4) 。這樣的結果顯示 AmpH 蛋白的主要功能不是維持鈉鹽類平衡，而 S. maltophilia 中應有其他的 Na⁺/H⁺antiporter 蛋白主導鈉鹽類平衡。在一般的情況下，細菌體內會存在多個 Na⁺/H⁺ antiporters 幫忙協助體內 pH 值和鈉鹽的平衡。藉由分析 S.

maltophilia K279a 菌株的基因體序列發現到共有三個基因命名為 Na⁺/H⁺ antiporters ，其基因編號分別為 Smlt3721 、 Smlt1521 和 Smlt0555，而本論文中的 ampH 基因即為 Smlt3721。對於此三基因

在文檔中 Stenotrophomonas maltophilia 之 AmpH 蛋白以 Dose-Dependent 方式調控L1 及 L2 β-lactamases 之表現; AmpH Regulates the Expression of the Chromosomal L1 and L2 β-lactamases of Stenotrophomonas maltophilia in a Does-Dependent Manner (頁 48-0)

第三章 研究結果