DNA 之製備

1. 質體 DNA 之抽取

將含有質體之菌株培養於 3 ml 液態培養基中，可視情況加入合

適濃度之抗生素以預防污染。經 37℃震盪隔夜培養，視菌種的生長

速度，在生長對數期間（log phase）取出，分裝至 1.5 ml eppendorf 中，以12,000 rpm 5 分鐘離心，去除上清液後加入 100 μl solution Ⅰ 溶液，使菌體重新懸浮，靜置於室溫中 5 分鐘。接著加入 200 μl solutionⅡ 溶液，緩慢的上下倒置數次後，置於冰上 5 分鐘。之後再 加入150 μl solution Ⅲ溶液，上下倒置數次後再置於冰上 10 分鐘。

接著以12,000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液取至新的 eppendorf 中，

再加入1：1 之 phenol/chloroform 以 vortex 混合均勻，經 12,000 rpm 離心5 分鐘後取上清液至另一 eppendorf 中，重複數次。使溶液分界 層無雜質後再加入等量之 chloroform 以 vortex 混合均勻，經 12,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液至新的 eppendorf 中加入二倍體積之 95

％酒精，用vortex 混合均勻後靜置於冰上 10 分鐘。最後再以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，去除酒精後得沉澱之 DNA，待酒精揮發後用無 菌之去離子水回溶備用。

2. 染色體 DNA 之抽取

將菌株培養於 3 ml 液態培養基中，37℃震盪隔夜培養，視菌種

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的生長速度，在生長對數期間（log phase），移至1.5 ml eppendorf 中，

以8000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液後再到入剩餘的菌液離心 5 分 鐘後，去除上清液。加入1 ml 之 1X STE buffer，並 vortex 使菌體重 新懸浮，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，重複一次此步驟。去上清液後，

先加入200 μl 1X STE vortex 均勻。接著緩慢加入 40 μl 10％ SDS，

慢慢上下倒置 eppendorf，直至澄清。接著靜置 65℃ 30 分鐘，待降 溫後加入Proteinase K（2 mg/ml）20 μl（final conc. 40 ng/ml）於 37℃

作用3~4 小時，接著加入 400 μl 1X STE buffer 放大體積。加入 1：1 比例之phenol/chloroform 用 vortex 混合均勻，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘後取上清液至另一eppendorf 中，重複此步驟數次使溶液分界層 無雜質。再加入等量之chloroform 用 vortex 混合均勻，以 12,000 rpm 離心10 分鐘，取上清液至另一 eppendorf 中加入二倍體積之 95％酒 精，用vortex 混合均勻後置於冰上 10 分鐘，最後利用 tip 捲出染色 體晾乾，再加入無菌去離子水 200 μl 回溶，以 65℃加熱 30 分鐘去 除DNase 後，置於 4℃保存備用。

3. DNA 片段之回收

DNA 片段的回收使用 GeneMark DNA Clean/Extraction Kit，將要 回收的 DNA 片段先以洋菜膠體電泳分離，於 EtBr 染色 10 分鐘，

置於紫外線箱上觀察。使用刀片將目標片段切下來放入 eppendorf 中，

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加入500 μl Binding solution 置於乾浴器 65℃ 30 分鐘。再吸取溶液 至Spin column 中，Spin column 下承接 Collection column，以 12,000 rpm 離心 3 分鐘。再加入 500 μl Washing Solution 12,000 rpm 離心 5 分鐘，重複此步驟二次。打開 Spin column 蓋子等待 3 分鐘使酒精 揮發，最後加入適量無菌去離子水於 Spin column 中，靜置數分鐘後 以12,000 rpm 離心 10 分鐘，即得回收產物。回收所得之 DNA 保存 於4℃備用。

4. DNA 切割反應

選擇合適的限制酶，配合廠商建議的緩衝溶液，和所建議的反應 溫度，進行DNA 切割反應。反應時的 DNA 濃度約為 1 μg/50 μl，而 反應時間則視選擇的限制酶而調整，完成後利用洋菜膠體電泳分析切 割情形。

5. DNA 黏合反應（ligation）

將所選擇的載體經限制酶切割處理後，再與需接黏的 DNA 片段 以適當比例混合均勻，並加入廠商建議的 ligation buffer 和 1 μl T4 DNA ligase，再補上無菌去離子水使最後總體積為 20 μl。混合均勻後，

置於16℃下作用 12~16 小時，即可完成黏合作用。

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