第三章 試驗部分
第二節 試藥與儀器
一、生藥組織學之研究 (一)外部形態之鑑別
利用五官鑑別法及立體顯微鏡檢視試驗之材料，並以照相方式紀錄藥材之外 觀性狀，供以對照分析。
(二)生藥組織切片之鑑別
利用徒手切片法將材料進行橫切（Transverse section，X.S.）、放射性縱切（Radial longitudinal section，R.L.S.）、與切線性縱切（Tangential longitudinal section，T.L.S.）， 切取10 µm 之薄片檢體置於載玻片上，先以 chloral hydrate solution 清除細胞內含 物後，再滴加各種不同化學試劑，如phloroglucinol solution 與 hydrochloric acid 進 行木化反應；或滴加Sudan Ⅲ solution 進行木栓化反應，或利用 Schultze，s 與 KOH maceration method 將材料予以解離，最後 glycerin-water（1：1）混合溶液將檢體 封鎖，蓋上蓋玻片，置於顯微鏡下，先用低倍鏡檢查其輪廓，再以高倍鏡觀察各個 組織之特徵，並以顯微測微計測量各組織或細胞之大小。
(三)結果分析
利用顯微攝影技術，紀錄植物外部形態，並建立生藥組織圖及整理出品種間 的差異點。
(四) 試劑與儀器 1. 試驗試劑：
（1） chloral hydrate solution。
（2） glycerin：alcohol：water（1：1：1）。
（3） glycerin ： water（1：1）。
（4） iodine test solution。
（5） phloroglucinol solution。
（6） potassium chlorate。
（7） potassium hydroxide（50 ％）。
（8） hydrochloric acid（12 N）。
（9） safranine。
(10) SudanⅢ solution。
(11) alcohol（95 ﹪）。
(12) ammonia solution。
2. 儀器：
(1) 顯微鏡（Nikon photograph T-2）及照相設備。
(2) 立體顯微鏡（Nikon SMZ-2T）及照相設備。
(3) 顯微測微計（Erma 0.01 mm Micrometer）。
(4) 電子測微計（Digimatic caliper DC-6）。
(5) 照相機（Nikon FX-35WA）、照相機（Nikon FX-35DA）。
(6) 電腦及其周邊設備與相關軟體。
(7) 顯微鏡（Olympus CH2）。
(8) 顯微鏡（Nikon LABOPHOT-2）。
二、黨參DNA 鑑定之研究
（一）植物材料與DNA 之抽取
本試驗之黨參材料，有嫩葉與飲片藥材二種。試驗所得DNA 之 ITS 序列登錄 於 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene bank 中，試驗材 料列於 Table 3-1。依照材料不同，前處理方式亦有不同。葉片組織部分，剪成細 小碎片於液態氮中研磨粉碎，貯藏於-20 ℃下備用。飲片藥材部分，以環狀剝皮方
式（似削蘋果）去除栓皮層及皮層組織，取維管束組織（菊花紋）切碎後使用。
DNA 之抽取方式，參照使用 Dellaporta method[350]。
1. 磨碎萃取：
（1）取 1-4 g 材料（幼嫩葉或藥材），剪碎成小屑狀置於研缽內，以液態氮研磨 成粉末，移置於離心管中。
（2）加入 15 ml 之 Extraction buffer 及 1 ml 20 % SDS，強力搖晃 50 次使之混合，
接著以65oC 水浴 10 分鐘。
（3）加入 5 ml 之 potassium acetate solution，強力搖晃約 50 次後冰浴 20 分鐘。
2. 異丙醇沉澱：
（1）在 12 krpm（4 oC）離心 20 分鐘，取上清液至新離心管，加入 10 ml 之異 丙醇在-20 ℃下約 5-10 分鐘，使之沉澱。
（2）在 12 krpm（4oC）離心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 10 分鐘，呈乾燥凝膠。
（3）加入 0.5 ml 之 TE buffer，重新將凝膠溶出呈懸浮液。
3. 酚清洗：
（1）將懸浮液倒入收集管，加入等量（0.5 ml）phenol（pH 8.0）混勻，在 10 krpm（4 ℃）離心 5 分鐘。
（2）將上清液倒入新收集管，加入 0.25 ml chloroform（chloroform：
isoamylalcohol=24：1）和 0.25 ml phenol 混勻，在 10 krpm（4 ℃）
離心5 分鐘。
（3）將上清液倒入新收集管，加入 0.5 ml chloroform 混勻，在 10 krpm（4 ℃下）
離心 5 分鐘。
4. 酒精沉澱：
（1）將上清液倒入新收集管，加入 0.9 ml absolute EtOH 和 0.15 ml ammonium acetate（7.5 M）。
（2）將混合液置於-20 ℃下 30 分鐘加強沉澱作用，在 10 krpm（4 ℃下）離心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 5-10 分鐘。
（3）再以 70 % EtOH 清洗，置於室溫下 15 分鐘。
5. 真空乾燥：
（1）在 10 krpm（4 ℃下）離心 5 分鐘，去掉上清液，抽氣至完全乾燥。
6. TE 溶解：
（1）加入 TE 緩衝液（10：1）0.2 ml 溶解產物。
（2）酌量加入 RNase A（10 mg/ml），分解及處理 RNA。
（3）保存於-20 ℃以供使用。
（二） PCR 反應
DNA 通常為雙股，呈相反方向結合。其中一股為 5'（指核苷酸 Nucleotide 分 子中五碳醣的第五個碳的方位）→ 3'，另一股為 3'→ 5'。DNA 係由核苷酸包括：
腺嘌呤（adenine）（A）、鳥糞嘌呤（guanosine）（G）與胞嘧啶（cytosine）（C）及 胸腺嘧啶（thymine）（T）所組成。且在配對氫鍵結合時均為 A 對 T，G 對 C。選 取特定引子 18D 和 28CC，利用 PCR 複製核糖體核酸基因間隔區(ITS)，這組 ITS1-5.8S-ITS2 引子序列是：
18D（5'- CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）和 28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）
PCR 複製核糖體核酸基因間隔區的反應物及濃度如下：在 0.6 ml 的微量離心 管內加入10 µl of 10 X reaction buffer，10 µl MgCl2（25 mM），2 µl dNTP
mix (8 mM)，25 µM 的 18D 和 28CC 引子各 4 µl，和 10 U of Taq polymerase
，最後加入4 µl 的模板 DNA，加無菌水使總體積成 100 ul，將微量離心管置入熱 循環器。反應的熱循環溫度及時間如下，先以94 ℃反應 5 分鐘，然後 94 ℃反應 1 分鐘，60 ℃反應 1 分鐘，72 ℃反應 1 分 30 秒的三個步驟進行 40 個循環，最後 72
℃反應10 分鐘後，將 PCR 複製產物維持在 4 ℃下備用。
由於許多藥材經曬乾、烘乾、炮製等加工處理後，或染色體DNA 抽取技術等 因素，基因體序列常造成斷裂現象，所以當上述一步驟方法無法同時擴增ITS 1 /ITS 2 序列時，我們即利用兩步驟分段擴增法，第一組引子由 18D 與 1858 組成，用來 擴增ITS 1 序列，第二組引子由 2858 與 28CC 組成，用來擴增 ITS 2 序列。如 Fig.
3-1 所示。
Fig. 3-1. The structure of ribosomal DNA of higher plants.
The positions of internal transcribed spacer（ITS）regions relative to 18S,5.8S and 26S rDNA, and corresponding positions of primers used for PCR and sequencing are indicated.
PCR 放大之反應條件為：25 μl 反應中包含 15 ng 模板 DNA，10 mM Tris-HCl (pH 8.3)，50 mM KCl，1.0 μM each primer，0.2 mM dNTP，2.0 mM MgCl2，1.0 U Klen Taq DNA polymerase；反應循環為：one cycle of 94°C for 5 min, 50°C for 1 min and 72°C for 2 min； 40 cycles of 94°C for 1 min, 60°C for 1 min and 72°C for 1.5 min with a final extension of 72°C for 10 min。
18s RNA 5.8s RNA 28s RNA
primer: 18D
primer: 28CC
ITS1 ITS2
primer: 1858 primer: 2858
經PCR 擴增 ITS1/ITS2 序列後以 2% 瓊脂電泳（agarose electrophoresis）進行 長度判別，經分離約500 bp 之片段以 spin column 進行純化，再交由合作廠商進行 以Sanger 法之定序工作。經重覆至少三次不同採集地點之同種藥材，經序列比對 無誤
（三）電泳分析
將PCR 複製產物進行電泳分析。操作步驟如下：
1. 取 0.6 g 瓊膠加入 40 ml 0.5 X TBE 緩衝液中。
2. 在微波爐中加熱 2 分鐘。
3. 迅速加入 2 µl ethidium bromide （7.5 mg/ml），小心振搖，倒入膠盤。
4. 瓊膠在 10-15 分鐘內凝結。
5. 加 Marker 5 µl（事先加入 2 ul dye）。
6. 加 PCR 複製產物 5 µl（事先加入 2 ul dye）。
7. 在 50 V/100 V 電泳槽內進行電泳分離，約 30 分鐘。
8. 以紫外燈箱上觀察，並拍照電腦存檔，以便作為判讀與分析之依據。
（四）定序
在UV 燈下觀察，以確定其 PCR 擴增長度正確，於 700-900 bps 下得一清 晰環帶，再將之交給源資國際生物科技股份有限公司定序。
（五）試劑、材料及儀器：
1.試劑
（1）liquid nitrogen。
（2）extraction buffer，EB 100 mM Tris-HCl pH＝8.0，50 mM EDTA-Na pH＝
8.0 500 mM NaCl，10 mM beta-mercaptoethanol。
（3）20% SDS。
（4）K-solution：5M potassium acetate 60.0 ml。
galatic acetic acid 11.5 ml。
Milli-Q 28.5 ml。
（5）isopropanol。
（6）phenol。
（7）chloroform： isoamylalcohol=24：1。
（8）absolute EtOH。
（9）ammonium acetate (7.5M) 。
（10）TE buffer（Buffer B, TE＝5： 1）。
（11）RNase A（10 mg/ml； Sigma）。
（12）template DNA。
（13）primers： 18D（5'-CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）。
28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）。
（14）10X buffer（Promega, Madison, USA）。
（15）MgCl2（25mM）。
（16）Taq polymerase (Promega,Madison,USA) 。 （17）dNTPs (2mM stock) 。
（18）sterile ddH20。
（19）ethidium bromide solution 10 mg/m。
（20）l5X loading Dyes50 X。
（21）TBE [5 X stock solution1(liter)：54 g Tris base, 27.5 g boric acid, 20 ml 0.5 M, EDTA, pH 8.0] 。
（22）markers Lambda/HindIII (Invitrogen/Life Technologies) 。
（23）agarose (powder) 。
２、材料：
（1）a centrifuge tube。
（2）microfuge。
（3）eppendorf。
（4）glove。
３、儀器：
（1） a mortar and pestle。
（2） water bath。
（3） ice bath。
（4） PCR machine—GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER)。
（5） gel electrophoresis boxes and power sources。
（6） UV trans-illuminator and camera system。
（7） microwave。
（8） timer。
三、HPLC 指紋圖譜之研究
（一）樣品處理與製備
參照封（2005）[351]製備，秤取研碎黨參藥材1 g，以 10 ml 甲醇經超音波震盪 萃取20 分鐘，收集濾液，重複萃取三次，合併濾液，並以減壓濃縮方式將濾液濃 縮至乾，再以 3 ml 甲醇溶出，定量 5 ml 並以 0.45 μm 濾膜過濾，取濾液 10μL 供 HPLC 檢測。
（二）對照品溶液製備
1. 精確稱取 atractylenolide Ⅲ 10.12 mg，用甲醇溶液定量到 10.0 ml。 製成濃 度為1.012 mg/ml 的標準品儲存溶液。
2.精確稱取 lobetyolin 10.23 mg，用甲醇溶液定量到 10.0 ml。 製成濃度為 1.023 mg/ml 的標準品儲存溶液。
（三）層析條件與試劑儀器 1.層析條件
（1）atractylenolide Ⅲ流動相為 甲醇：水（67：33）。
（2）流速 1 mL/min。
（3）檢測波長 220 nm。
2. 儀器
高效液相層析儀 ( High performance Liquid Chromatography )：
(1) 幫浦：Waters 2695 Separations Module。
(2) 自動注入器：Autosampler 717+。
(3) 檢測器：Waters 996 Photodiode Array Detector。
(4) 分析軟體：Waters Empower software。
(5) 層析柱：RP-18， Inertsil ODS-3 ( 5 μm，4.6×250 mm ) ( GL Sciences Inc.，Shinjuku， Tokyo，Japan)。前端加上管柱( Guard-PakTM pre-column )，以濾除雜質。
四、組織培養研究
（一）組織培養
將植物體，以刀片截取頂芽、莖節、葉、根及根尖部分處，為培殖材料進行 試驗。將培植材料以70 % 酒精殺菌 1 分鐘，再用 0.5 %次氯酸鈉（50ml 加 Tween 20 一滴）配合超音波震盪 10 分鐘。再以無菌水沖洗 3-4 次，接種至含 2,4-D 1mg/L，
3 ％ sucrose，0.9 % agar 之 MS 培養基。
各種培養基配置：本試驗以MS（Murashige & Skoog, 1962）基本鹽類培養基，
添加3% sucrose 及 0.9% agar，並配合 2,4-D、IAA、NAA、BA、Zeatin、Kinetin 等各類植物生長調節劑及添加物。用1N NaOH 及 HCl 將 pH 值調至 5.7+0.1，然後 以121℃、15lb/in2(1.05kg/cm2)進行高壓滅菌 15 分鐘後，擺成斜面，冷卻備用。
培養環境：接種後，將材料置於 25+1℃之恆溫黑暗或光照（100 μE/m2s，光 波長350-800 nm)培養。
（二）黨參市場品、台灣產黨參野生品與癒合組織指標成分之研究
HPLC 分析條件：
1. 材料
（1）台灣產黨參之原植物 C. kawakamii、C. javanica 及 Campanumoea lancifolia
（Table 3-1）
（2）組織培養法所得癒合組織 （3） 市售黨參之乾燥藥材
購自竹南鎮金 X 安貿易公司、台中市聯 X 藥局、龍潭鄉崑 X 藥園及中國 大陸同X 堂成都分店。
（4） 成分標準品
atractylenolide Ⅲ（日本 Wako 和光純藥）、lobetyolin（上海友思生物技術）
2. 檢品之製備
將冷凍乾燥檢品，取出研碎，稱取1 g 後，後處理步驟同 HPLC 指紋圖譜研究 之樣品處理與製備。
3. 標準品之製備
atractylenolide Ⅲ、lobetyolin 標準品同 HPLC 指紋圖譜研究之儲存溶液。
4. 分析條件
依參考文獻，將atractylenolide Ⅲ、lobetyolin 及 ferulic acid 分析條件，列於 Table 3-2。
Table 3-2. 黨參標準品分析條件
標準品名稱 流動相 流速 檢測波長 參考文獻
atractylenolide Ⅲ 甲醇/水 = 67/33 1 mL/min 220 nm 封(2005)[351]
lobetyolin 乙腈/水 = 22/78 1mL/min 267 nm 賀(2005)[352]
2. 試劑與儀器：同 HPLC 指紋圖譜研究之試劑與儀器部分。
3 高效液相層析法 (1)檢量線之繪製
取 atractylenolide Ⅲ及 lobetyolin 之標準品，以濃度 1 mg/mL 作為母液，再分 別稀釋成母液的1/2、1/4、1/8 倍等 4 個濃度之標準品溶液，各以 0.45 μm 之微孔 膜過濾，濾液用Autosampler 每次自動定量注射 10 μl 注入 HPLC 分析，每個濃 度處理重複 3 注射，將 3 次總和平均。以濃度及積分面積各為橫座標和縱座標，
利用線性迴歸分析獲得方程式，製成標準檢量線。
(2)精確度試驗
為了確認 atractylenolide Ⅲ及 lobetyolin 定量分析之精確性，因此於同日內 (Intraday)早、午、晚及連續三日內之間日內(Interday)進行精確性比較。以二十七 次 同 日 內 和 二 十 七 次 間 日 內 分 析 值 求 取 平 均 值( Mean) 、 標 準 差 (Standard deviation，S.D. )及變異係數(coefficient of variation，C.V.)。
(3)檢品之測定
將檢品依照上述檢品製備方法及分析條件，每次自動定量注 10 μl 於 HPLC 分析，依檢量線迴歸方程式計算atractylenolide Ⅲ及 lobetyolin 含量。
atractyolanolide
Y=31322427.8X-562561.3 R2=0.9997
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
lobetyolin
Y=53301644.8X-467962.5 R2=0.996
0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Fig. 3-2. 黨參類藥材 atractylenolide Ⅲ及 lobetyolin 檢量線
五、DDPH 抗氧化研究
(一)植物材料
六種不同種之黨參來源植物。並經由中國醫藥大學 陳忠川、郭昭麟教授鑑 定，確定後將各來源之科名、學名及相關文獻列於Table 3-1。
(二)萃取方法
依2004 年羅[353]及2007 年 Xu[354]發表之方法，加以修改。
1. 乙醇萃取法：
分別將乾重1 g 的已研碎藥材粉末，以 10 ml ethanol 在室溫下浸泡 24 小時，
再以超音波震盪20 分鐘後，過濾收集濾液，重複此步驟 3 次。將混合之濾液在 40°C 下減壓濃縮，並將濃縮之萃取物真空乾燥至恆重。將萃取物精確稱重後以乙醇回 溶，配製成5 mg/ml 的儲藏液，密封並存放在-20°C 備用。
2. 50 %乙醇（半酒水）萃取法：
分別將乾重1 g 的已研碎藥材粉末，以 5 ml ethanol 及 5 ml 蒸餾水（乙醇：水
=1：1）共 10 ml 在室溫下浸泡 24 小時，再以超音波震盪 20 分鐘後，過濾收集濾 液，重複此步驟3 次。將混合之濾液在 40°C 下減壓濃縮，並將濃縮之萃取物真空
=1：1）共 10 ml 在室溫下浸泡 24 小時，再以超音波震盪 20 分鐘後，過濾收集濾 液，重複此步驟3 次。將混合之濾液在 40°C 下減壓濃縮，並將濃縮之萃取物真空