第⼀項 測定⾎糖
⾎糖濃度測定(mg/dl)儀器,是使⽤ Bayer Ascencsia
ELITE XL (Bayer Healthcare, Whippany, USA)。空腹⾎糖
(FBG)的測量是隔夜採⾎,經 14 ⼩時禁⾷後測量。
第⼆項 測定胰島素
胰島素⽔平是由 Mercodia ⼤⿏胰島素酶聯免疫試劑盒
(Mercodia Rat Insulin ELISA kit, Mercodia, Uppsala, Sweden)
測定。實驗資料按曲線下⾯積(min x μg/l)顯⽰。
第三項 測定 HOMA-IR 和 HOMA-β
對於糖尿病患者要測量胰島素阻抗性,恆定態模型評估 胰 島 素 阻 抗 ( Homeostasis Model Assessment-Insulin
Resistance, HOMA-IR)是⼀種廣⽤的指標。HOMA-β 的數 值則代表胰島 β 細胞的功能和胰島素分泌指數。若以 mg/dl 為單位, HOMA-IR 的計算公式為:
[禁⾷胰島素(μU/ml)x 空腹⾎糖(mg/dl)] / 405。
HOMA-β的計算公式為:
(360 x 禁⾷胰島素(μU/ml)/(空腹⾎糖(mg/dl)-
63)。
我們分別在第 0 周(4 周番⽯榴汁處理實驗開始)和第 4 周(4 周番⽯榴汁處理實驗結束)計算這 2 個數值。
第四項 測定糖耐受性
第⼀⽬ 靜脈內注射糖耐受性試驗:
隔夜禁⾷後,⽤阿維丁 avertin (200 mg/kg BW, i.p.)
(Sigma, Missouri, USA) 進⾏⿇醉。⽤ PE50 管對頸動脈和 頸靜脈進⾏插管,採集⾎液標本進⾏⾎糖測定,並注⼊葡 萄糖(0.5 g/kg)。我們注射海藻糖(0.5 g/kg)⽤以⽐較與 葡萄糖昇⾼⾎糖的能⼒差異。分別于注射前、注射後 1、5、
10、20、30、50、75 分鐘記錄⾎糖值。
第⼆⽬ ⼝服糖耐受性試驗
在隔夜禁⾷後進⾏⼝服糖耐受性試驗(OGTT)。⼝服葡 Belgium))檢測糖化⾎⾊素 HbA1c。
第六項 測定活性氧
第⼀⽬ 體外活性氧(in vitro)
使⽤化學發光分析系統(CLD-110, Tohoku Electronic In .
Co., Sendai, Japan),在⼀個完全⿊暗的空間進⾏測量體外 活性氧。這種儀器可以檢測到 luminol-amplified ROS 發出 的化學發光43。
第⼆⽬ 體內活性氧(in vivo)
根據之前研究報告制定的⽅法,我們測定了⼤⿏腎活 性氧⽔準43。檢測腎臟化學發光的⽅法,是從股靜脈連續
輸注(0.01ml/min)0.4 mg/ml MCLA(2-methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo-(1, 2-a)- pyrazin-3-one hydrochloride)。MCLA 與超氧陰離⼦⾃由基反應會⽣成 化學發光。在活性氧測定後犧牲動物,收集組織⽤於其他 實驗。
第三⽬ 膀胱活性氧:
膀胱活性氧量是從膀胱表⾯測量44。簡要地說,從靜 脈注射超氧陰離⼦探針 MCLA (0.2 mg/ml/hr, TCI-Ace),即 可測量體內膀胱表⾯超氧陰離⼦活性氧反應,並⽤化學發 光分析系統(CLD-110,Tohoku Electronic inc.)記錄。為 了排除膀胱以外來源的光⼦發射,⿇醉動物被放置在⼀個 帶屏蔽板的暗箱中。只有膀胱沒有被屏蔽,被放置在⼀個 反射器下⾯,這個反射器可以將暴露在外的膀胱表⾯的光
⼦反射到探測器區域。來⾃膀胱表⾯的 MCLA 增強的化 學發光信號,被化學發光分析儀連續記錄。超氧陰離⼦活
性氧(ROS)值的總量乃由曲線下⾯積法測定。
⾃ 0.2 mL ⽣理鹽⽔+ 1 ml MCLA(0.2 mg/mL)所獲 得的超氧陰離⼦活性氧數值做為負對照組,⽽⾃ 0.2 ml ⿈ 嘌呤 xanthine(0.75 mg/kg)/⿈嘌呤氧化酶 xanthine
oxidase(24.8 mu/kg)+ 1 ml MCLA(0.2 mg/mL)所獲得 的氧陰離⼦活性氧數值做為正對照組。每 10 秒連續記錄
⼀次 MCLA 增強的化學發光。實時顯⽰的化學發光信號 被識別為來⾃膀胱的 ROS 數值。
第七項 測定槲⽪素
我們使⽤由⾼效液相⾊譜泵、⼆極體陣列吸收檢測器所 組成的⾼效液相⾊譜系統(Ultimate 3000 HPLC system),
在 200-600nm 波⾧範圍內對番⽯榴汁樣品進⾏分析。⽤
Synergi RP-Max管柱(Phenomenex, Macclesfield, UK) , 在 0.1%甲酸⽔溶液中,以 10-80%⼄腈 acetonitrile 為梯度,
以 0.2 ml/min 的流速進⾏分離 40 分鐘。通過⼆極體陣列檢 測器後,管柱洗脫液被導向裝有電噴霧介⾯(Thermo Finnigan)的 LXQ 離⼦阱質譜儀(LXQ ion trap mass
spectrometer)。分析採⽤陰離⼦模式,適合槲⽪素的檢測。