天然植化素槲皮素與蘿蔔硫素對糖尿病大鼠的泌尿系統保護機轉

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(1)國⽴臺灣師範⼤學理學院⽣命科學系博⼠論⽂ Department of Life Science College of Science. National Taiwan Normal University Doctoral Dissertation. 天然植化素槲⽪素與蘿蔔硫素對糖尿病⼤⿏的泌尿系統保護機轉 The Mechanisms of Natural Phytochemicals Quercetin and Sulforaphane on Protection of Urinary System in Diabetic Rats. 林嘉發 Lin, Chia-Fa 指導教授：鄭劍廷博⼠ Advisor: Chien, Chiang-Ting, Ph.D.. 中華民國 109 年 1 ⽉ January 2020.

(2) 誌謝臨床中醫醫療⼯作近⼆⼗年，我常常宣導病⼈⾷⽤天然蔬果以保健⾝體，因為中醫的核⼼理念本就是「藥⾷同源」，運⽤天然植物的四氣五味，來調理相對應的臟腑以恢復健康，病重病急則⽤藥物，⽽病輕病緩當⽤⾷物。其中糖尿病患常常苦於不能吃太甜的⽔果，我的建議⾸選⽔果是番⽯榴。另外，對於容易發炎上⽕的體質，屬性偏涼的西蘭花則是上上之選。沒想到與恩師鄭劍廷院⾧談到這些中醫保健之道時，引發了迴響。臨床⼯作常是知其然⽽不知其所以然。鄭院⾧在分⼦細胞⽣物學領域的專精，或許可以為這些有⽤的資訊提供⼀個厚實的基礎，進⽽有助於理解中醫理論中藥物性味之現代奧義。於是在他的熱忱指導下，進⾏了博⼠研究⼯作。很榮幸在數年努⼒下，我們的研究成果表明，天然蔬果所蘊含的植化素，的確對於糖尿病⼤⿏的腎臟、膀胱有保護作⽤，可以有效地協助因糖尿病導致的泌尿系統改善其功能。中藥裡⾯使⽤天然植物的機會甚多，明代李時珍《本草綱⽬》就收錄了共計 1095 種植物，佔全部藥物總數的 58%，相信在此論⽂的基礎上，我們建⽴了有效的實驗模型 i.

(3) 以利後續的探討。再次感謝我的指導教授鄭劍廷⽼師，您那充滿創意、深具啟發的教導，讓我總有柳暗花明⼜⼀村的感受。無數的晨昏，伴隨著便當的氣味和著研討會議上幻燈⽚的明暗，讓這四年紮紮實實地學習了功課。還要感謝我碩⼠班的指導教授張恒鴻院⾧，不但幫助我建⽴完整的科研基礎，也是⼀代儒醫，以⾝作則教我安⾝⽴命之道。引薦我進⼊師⼤的陽明副校⾧楊慕華教授，提供了許多研究上的新指標，以及在⽣命科學的領域中，開拓我廣⼤視野的吳忠信教授與林豊益教授，更感謝⽣科院的師⾧與同學們互相勉勵與⽀持，沒有您們，沒有這份得來不易的成果！. ii.

(4) 中⽂摘要本論⽂主要在探討天然植化素（phytochemicals）對於糖尿病⼤⿏的泌尿系統保護作⽤，並研究有關細胞凋亡（apoptosis）、細胞⾃噬（autophagy）、發炎性細胞凋亡（pyroptosis），和粒線體功能的作⽤機轉。我們建⽴了兩種不同誘發糖尿病的動物模型，第 II 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）模型，與第 I 型糖尿病（Type I diabetes mellitus, T1DM）模型。T2DM 模型主要研究對象是第 II 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）之腎臟細胞損傷與保護，⽽ T1DM 模型則是⽤於研究糖尿病的排尿功能障礙，這通常會發⽣在較嚴重的 T1DM ⾼⾎糖狀態，因為 T1DM 模型可以快速誘導糖尿病膀胱（diabetic bladder）損傷。我們萃取富含槲⽪素（quercetin）的番⽯榴汁，並混合不同⽐例的海藻糖（trehalose），來研究其對於 T2DM ⼤⿏腎臟和胰臟損傷的保護作⽤，並採⽤⾼效液相⾊譜分析法以測定番⽯榴汁的有效成分。通過腹腔注射菸鹼醯胺（nicotinamide）和鏈脲佐菌素（streptozocin），結合⾼果糖飲⾷誘導 Wistar ⼤⿏ T2DM 模型，持續 8 周。⽤不同劑量的番⽯榴汁混和海藻糖餵養⼤⿏ 4 周，檢測⼝服葡萄糖耐量試驗（Oral Glucose Tolerance Test, OGTT）、⾎漿胰島素（insulin）、糖化⾎⾊素（glycated iii.

(5) hemoglobin, HbA1c）、胰島素抗性指數（Homeostasis Model AssessmentInsulin Resistance index, HOMA-IR）、β 細胞功能和胰島素分泌指數（Homeostasis Model Assessment of β-cell function, HOMA-β）。我們也使⽤了免疫組織化學染⾊法、螢光染⾊法和西⽅墨點法來測定氧化和發炎程度，⽤化學發光分析儀測定了⾎清和腎組織活性氧類（Reactive Oxygen Species, ROS）濃度。結果發現，番⽯榴汁中⾼含量的槲⽪素對過氧化氫（Hydrogen Peroxide, H2O2）和次氯酸（hypochlorous acid, HOCl）有清除作⽤，⽽海藻糖對 H2O2 有選擇性清除作⽤，⽽對 HOCl 無清除作⽤。對於 T2DM 的 OGTT、insulin、HbA1c、HOMA-IR 和 HOMA-β ⽔平均有影響，⽽番⽯榴混和海藻糖對 T2DM 改變的參數，除 HbA1c 外均有顯著改善。番⽯榴汁混和海藻糖能顯著降低 T2DM 所增強的腎臟 ROS 、 4hydroxynonenal 、 caspase-3/apoptosis 、 LC3-B/autophagy ，以及 IL1β/pyroptosis 的⽔平。研究結果顯⽰：番⽯榴汁混和海藻糖的攝取，對於因 T2DM ⽽損傷的胰臟和腎臟細胞，具有顯著的保護作⽤。嚴重的⾼⾎糖能誘發氧化壓⼒，造成糖尿病膀胱（diabetic bladder）, 進⽽引發排尿功能障礙。我們在論⽂中探討了蘿蔔硫素（sulforaphane），⼀種具有抗氧化⼒的轉錄因⼦ Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 iv.

(6) （Nrf2）激活劑，是否具有預防糖尿病因⾼⾎糖⽽併發膀胱功能障礙的功⽤。糖尿病誘導前給予鏈脲佐菌素和蘿蔔硫素，⽤化學發光分析儀測定膀胱活性氧類，另⽤西⽅墨點法檢測粒線體功能、粒線體 Bcl-2associated X protein（Bax）和胞漿細胞⾊素 cytochrome c、抗氧化防禦能⼒ Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ／ heme oxygenase-1 （Nrf2/HO-1）、內質網壓⼒標誌物 Activating transcription factor 6／ C/EBP Homologous Protein（ATF-6/CHOP）和 Caspase 3／poly ADPribose polymerase （Caspase 3/PARP）。糖尿病增加膀胱組織中 Keap1 的表現，並降低 Nrf2 的表現，與膀胱活性氧增加、粒線體 Bax 轉位、胞漿細胞⾊素（ cytochrome c ）釋放、 ATF-6/CHOP 、 Caspase 3/PARP/apoptosis 增加有關，通過增加排尿間隔時間和排尿時間導致排尿功能障礙。蘿蔔硫素能顯著活化 Nrf2/HO-1 軸的表現，減少膀胱活性氧、粒線體 Bax 轉位、細胞⾊素 C 釋放、ATF-6/CHOP 和 caspase 3/PARP/apoptosis，從⽽通過縮短排尿間期和排尿時間來改善排尿功能。根據研究結果，我們認為蘿蔔硫素通過激活 Nrf2/HO-1 信號通路保護了粒線體功能，並抑制糖尿病誘導的 ROS、內質網壓⼒、細胞凋亡和排尿功能障礙。研究顯⽰，天然植化素槲⽪素與蘿蔔硫素，的確具有保護糖尿病⼤ v.

(7) ⿏泌尿系統之效益。. 關鍵字：細胞凋亡；細胞⾃噬；發炎性細胞凋亡；粒線體；槲⽪素；海藻糖；蘿蔔硫素；氧化壓⼒；糖尿病；排尿功能；Nrf2 轉錄因⼦. vi.

(8) ABSTRACT In this study, we investigated the protective effects of natural phytochemicals on urinary system in diabetic rats, and investigated the mechanisms of apoptosis, autophagy, pyroptosis, and mitochondrial function. We have established two different animal models of diabetes, T2DM (Type II diabetes) model and T1DM (Type I diabetes) model. T2DM model is used to research the protection of T2DM rats on kidney cell damage by hyperglycemia. However, T1DM model is used to study the urination disorder occurred in the more serious hyperglycemia condition in T1DM because of diabetes mellitus bladder rapidly induced by T2DM model method. We extracted quercetin from psidium guajava, combined with trehalose to study the protective effect on kidney and pancreas injury in T2DM rats. Use high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis to determine the active components of guava juice. T2DM was induced in Wistar rats by intraperitoneal injection of nicotinamide and streptozocin combined with a high fructose diet for 8 weeks. Oral glucose tolerance test (OGTT), plasma insuin, glycated hemoglobin (HbA1c), homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) , homeostasis model assessment of the function of β cell in pancreas and insulin secretion index (HOMA-β) were vii.

(9) observed in rats fed with different doses of guava juice and trehalose for 4 weeks. The degree of oxidation and inflammation was determined by immunohistochemical staining, fluorescence staining and western blotting, and the serum and renal reactive oxygen species (ROS) were determined by chemiluminescence analysis. The results showed that quercetin in guava juice could scavenge H2O2 and HOCl, while trehalose could selectively scavenge H2O2, not for HOCl. T2DM had effects on OGTT, plasma insulin, HbA1c, HOMA-IR and HOMA-β, while guava and trehalose had significant effects on T2DM except HbA1c. Guava juice combined with trehalose significantly decreased T2DM-enhanced renal ROS, 3-nitrotyrosine, Caspase-3 / Apoptosis, LC3-B / autophagy and IL-1β / pyroptosis. We found that guava juice combined with trehalose had protective effects on cells of pancreas and kidney damaged by T2DM. Hyperglycemia evoked oxidative stress to induce diabetes voiding dysfunction. We explored whether antioxidant sulforaphane, a nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) activator, may ameliorate DM-induced bladder dysfunction. Streptozotocin and sulforaphane was administered before DM induction. Bladder ROS was determined by an ultrasensitive chemiluminescence analyzer. Mitochondrial function index, mitochondrial bax, cytosolic cytochrome c, antioxidant defense Nrf2/HO-1, endoplasmic viii.

(10) reticulum stress marker ATF-6/CHOP, and Caspase 3/PARP were evaluated by western blotting. DM increased Keap1 and reduced Nrf2 expression, associated with increase of bladder ROS, mitochondrial Bax translocation, cytosolic cytochrome c release, ATF-6/CHOP, Caspase-3/PARP in bladders which resulted in voiding dysfunction by increased intercontraction intervals and micturition duration. However, sulforaphane significantly increased nuclear Nrf2/HO-1 axis expression, decreased bladder ROS amount, mitochondrial Bax translocation, cytochrome c release, ATF-6/CHOP and Caspase 3/PARP/apoptosis, thereby improved the voiding function by the shortened intercontraction intervals and micturition duration. We suggested that. sulforaphane. via. activating. Nrf2/HO-1. signaling. preserved. mitochondrial function and suppressed DM-induced ROS, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and voiding dysfunction. In conclusion, these studies have shown that natural phytochemicals quercetin and sulforaphane have the benefit of protecting the urinary system in diabetic rats.. Keywords: apoptosis; autophagy; pyroptosis; mitochondria; quercetin; trehalose; sulforaphane; oxidative stress; diabetes mellitus; voiding function; Nrf2. ix.

(11) 縮寫 AGE, advanced glycation end products 晚期糖基化終產物 ARE, antioxidant responsive element 抗氧化反應元件 ATF-6, Activating transcription factor 6 活化轉錄因⼦ AUC, area under curve 曲線下⾯積 Bax, Bcl-2-associated X protein B 淋巴細胞瘤-2 基因關聯蛋⽩ CHOP, C/EBP Homologous Protein CHOP 蛋⽩ DM, diabetes mellitus 糖尿病 FBG, fasted blood glucose 禁⾷⾎糖 H2O2, Hydrogen Peroxide 過氧化氫 HbA1c, glycated hemoglobin A1c 糖化⾎⾊素 HO-1, heme oxygenase-1 ⾎鐵質氧化酶 HOCl, hypochlorous acid 次氯酸 HOMA-β ， homeostasis model assessment of the function of β cell in pancreas and insulin secretion index 胰臟 β 細胞功能和胰島素分泌指數 HOMA-IR, homeostasis model assessment of insulin resistance 胰島素抗性指數 x.

(12) IHC, immunohistochemisty 免疫組織化學 IR, insulin resistance 胰島素阻抗 IVGTT, intra venous glucose tolerance test 靜脈內注射葡萄糖耐受性試驗 Keap-1, Kelch-like ECH-associated protein 1 Keap-1 蛋⽩ NA, nicotinamide 菸鹼醯胺 Nrf2, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 核轉錄因⼦ E2 相關因⼦ OGTT, oral glucose tolerance test ⼝服葡萄糖耐受性試驗 PARP, poly ADP-ribose polymerase 多⼆磷酸腺苷核糖聚合酶 ROS, Reactive oxygen species 活性氧類 STZ, streptozotocin 鏈脲佐菌素 T1DM, type I diabetes 第 I 型糖尿病 T2DM, type II diabetes 第 II 型糖尿病. xi.

(13) ⽬次. 誌謝 ............................................................................................................... i 中⽂摘要 ..................................................................................................... iii ABSTRACT................................................................................................ vii 縮寫 .............................................................................................................. x ⽬次 ............................................................................................................ xii 第⼀章前⾔ ................................................................................................ 1 第⼀節第 II 型糖尿病 ......................................................................... 1 第⼆節糖尿病腎病 .............................................................................. 2 第三節糖尿病膀胱功能障礙 .............................................................. 3 第四節植物⽣化素 .............................................................................. 4 第五節番⽯榴與槲⽪素 ...................................................................... 8 第六節海藻糖 .................................................................................... 10 xii.

(14) 第七節西蘭花、蘿蔔硫素與 Nrf2 ................................................... 11 第⼋節研究⽬的 ................................................................................ 13 第⼆章材料與⽅法 .................................................................................. 14 第⼀節實驗動物 ................................................................................ 14 第⼀項實驗動物.......................................................................... 14 第⼆項糖尿病誘發模型.............................................................. 15 第⼆節番⽯榴萃取物製備 ................................................................ 17 第三節試驗⽅法、儀器與試劑 ........................................................ 18 第⼀項測定⾎糖.......................................................................... 18 第⼆項測定胰島素...................................................................... 18 第三項測定 HOMA-IR 和 HOMA-β ......................................... 18 第四項測定糖耐受性.................................................................. 19 第五項測定糖化⾎⾊素.............................................................. 20. xiii.

(15) 第六項測定活性氧...................................................................... 20 第七項測定槲⽪素...................................................................... 22 第四節粒線體蛋⽩質和胞漿分離的製備 ........................................ 23 第五節切⽚染⾊製備 ........................................................................ 23 第⼀項免疫組織化學（Immunohistochemistry, IHC） ............ 23 第⼆項⾺松染⾊法（Masson’s Stain） ..................................... 25 第三項螢光染⾊法（Fluorescent Stain） .................................. 26 第六節測量各種⽣理參數 ................................................................ 27 第⼀項以代謝籠記錄尿動⼒學和⽣理參數.............................. 27 第⼆項測量膀胱計量參數.......................................................... 27 第三項測量⾎流動⼒記錄.......................................................... 28 第七節西⽅墨點法 ............................................................................ 28 第⼀項腎臟和胰臟組織的檢測.................................................. 28. xiv.

(16) 第⼆項膀胱組織的檢測.............................................................. 29 第⼋節統計分析 ................................................................................ 31 第⼀項番⽯榴混和海藻糖實驗.................................................. 31 第⼆項蘿蔔硫素排尿功能實驗.................................................. 31 第三章結果 .............................................................................................. 33 第⼀節番⽯榴萃取物中槲⽪素的含量 ............................................ 33 第⼆節番⽯榴清除體外活性氧的能⼒ ............................................ 33 第三節海藻糖清除體外活性氧的能⼒ ............................................ 34 第四節⼝服番⽯榴汁耐受性試驗 .................................................... 34 第五節⼝服糖耐受性試驗 ................................................................ 35 第六節靜脈內注射葡萄糖和海藻糖耐受性試驗 ............................ 35 第七節糖化⾎⾊素的變化 ................................................................ 36 第⼋節⾎糖變化 ................................................................................ 36. xv.

(17) 第九節胰島素的變化 ........................................................................ 36 第⼗節 HOMA-IR 和 HOMA-β 的變化 ........................................... 37 第⼗⼀節切⽚染⾊的發現 ................................................................ 38 第⼀項胰臟切⽚.......................................................................... 38 第⼆項腎臟切⽚.......................................................................... 39 第三項膀胱切⽚.......................................................................... 40 第⼗⼆節活性氧的變化 .................................................................... 41 第⼀項體內腎臟活性氧⽔準...................................................... 41 第⼆項⾎清體外活性氧⽔準...................................................... 41 第三項體內膀胱活性氧⽔準...................................................... 42 第⼗三節西⽅墨點法分析結果 ........................................................ 42 第⼀項番⽯榴混和海藻糖實驗.................................................. 42 第⼆項蘿蔔硫素對排尿功能實驗.............................................. 43. xvi.

(18) 第⼗四節蘿蔔硫素對⼤⿏尿流動⼒學參數的影響 ........................ 45 第⼗五節綜合結果論述 .................................................................... 46 第四章討論 .............................................................................................. 49 第⼀節番⽯榴中槲⽪素與海藻糖保護腎臟的討論 ........................ 49 第⼆節蘿蔔硫素與膀胱排尿功能研究的相關討論 ........................ 54 第三節研究限制 ................................................................................ 60 第四節結論與未來展望 .................................................................... 62 參考⽂獻附錄. xvii.

(19) 第⼀章前⾔第⼀節第 II 型糖尿病第 II 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）是⼀種代謝性疾病，儼然成為已開發國家和開發中國家的主要健康議題1，儘管有很多關於糖尿病的研究，但是全世界患有糖尿病的⼈數仍在增加2 3。世界衛⽣組織的報告指出，迄⾄ 2016 年，全世界有 4.22 億⼈患有糖尿病（其中 T2DM 約 90%），國際糖尿病聯盟（International Diabetes Federation, IDF）預期 2035 年全世界糖尿病患者將增加⾄ 5.92 億⼈。此外在亞洲地區，糖尿病患者的增⾧率並沒有減緩的跡象4，依據我國衛⽣福利部國民健康署 103-106 年國民營養健康狀況變遷調查，臺灣 18 歲以上國⼈糖尿病盛⾏率為 10.1% (男性 10.9%、⼥性 9.4%)。其所耗費的醫療費⽤不貲，根據中央健康保險署統計資料，2018 年健保⽀出醫療費⽤，糖尿病排⾏⾼達第⼆，就醫⼈數 145.9 萬⼈，費⽤約佔 291 億元，僅次於慢性腎臟疾病。因此，預防和治療 T2DM 在研究上的重要性不容忽視。 T2DM 患者會出現胰島素阻抗性，這與胰臟功能隨時間下降有關。在正常情況下，胰島素是調節⾎糖的主要激素, 胰島細胞在不同情況 1.

(20) 下調節胰島素的作⽤，胰島素的作⽤減弱時，胰島素分泌會增加5。胰島素阻抗是 T2DM 的特徵之⼀，⼀般會在糖尿病的早期或中期開始發⽣，當糖尿病基因、脂肪激素、發炎、⾼⾎糖、游離脂肪酸等因素引起胰臟 β 細胞功能障礙，導致⾎液循環中的糖份和脂肪酸升⾼，便會進⼀步造成胰島素阻抗6。. 第⼆節糖尿病腎病除了⾼⾎糖的損害，糖尿病患者還會發⽣許多併發症，包括動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變和糖尿病腎病7，在這些併發症中，慢性腎臟疾病是主要的併發症。根據統計，糖尿病已成為造成末期腎衰竭最常⾒的原因8。⾧期、慢性的⾼⾎糖濃度，是腎臟肥⼤、腎⼩球硬化和腎⼩管間質纖維化的重要因素，這些是終末期腎功能衰竭的常⾒形態。⾼⾎糖會增加組織中造成氧化壓⼒的活性氧，⽽氧化壓⼒被認為是影響糖尿病腎病的主要因素。細胞內和細胞外的⾼濃度葡萄糖都會導致活性氧產⽣，並引起組織損傷9。細胞外⾼葡萄糖⽔準促進晚期糖基化終產物（Advanced Glycation End Product, AGE）的形成，並進⼀步與 AGE 受體相互作⽤。同樣地，細胞內增加的葡萄糖⽔準促 2.

(21) 進了蛋⽩激酶 C 和 Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate （NADPH）氧化酶的活性，從⽽提⾼了活性氧的產⽣和⼀些轉錄因⼦的表現，如 kappa B10。. 第三節糖尿病膀胱功能障礙糖尿病性膀胱功能障礙是糖尿病的主要後遺症之⼀，其症狀隨著糖尿病的嚴重程度和進展⽽變化11。糖尿病早期膀胱功能障礙表現為膀胱過度活動症狀，排尿頻率增加，後期轉變為膀胱不活動症狀 11。糖尿病狀態下的⾼⾎糖會導致氧化壓⼒和發炎反應，從⽽導致糖尿病性膀胱功能障礙 12 。來⾃受損粒線體增加的活性氧類 Reactive oxygen species（ROS）可以促進細胞凋亡，通過將胞漿 Bax 轉移到粒線體，形成外粒線體電壓依賴的陰離⼦電導（VDAC）通道，釋放粒線體細胞⾊素 C 進⼊胞漿13，以增加 caspase 3 activity/poly-（ADPribose）-polymerase （PARP） cleavage/apoptosis 路徑的形成14. 3. 。. 15.

(22) 另⼀個胞器－內質網細胞器（ER），也可能參與了氧化壓⼒下的細胞損傷16。內質網恆定態的紊亂可能導致內質網壓⼒，這已涉及到多起病理⽣理學上的改變，以及整合多種細胞的反應，包括發炎反應和細胞凋亡17。然⽽，氧化壓⼒在糖尿病性膀胱功能障礙中的作⽤機制還有待進⼀步闡明；在這項研究中，我們認為增加糖尿病的氧化壓⼒可能導致粒線體功能障礙和內質網壓⼒，因⽽導致糖尿病性膀胱功能障礙。. 第四節植物⽣化素植物⽣化素（Phytochemicals）是存在於植物內的天然化學成分，也是植物通過初級或次級代謝產⽣的化學物質。通常在植物體內具 4.

(23) 有⽣物活性，並在植物⽣⾧中發揮作⽤，或對競爭者、病原體或捕⾷者起到防禦作⽤。植化素提供植物⾃我保護的功能，阻抗昆蟲、細菌、真菌、病毒的感染傷害，對紫外線，輻射線，空氣及⼟壤污染，化學藥物等種種傷害，起保護作⽤。許多傳統醫學使⽤天然植物做為治療疾病的藥物，包括中國傳統醫學（Traditional Chinese Medicine, TCM）以及印度吠陀醫學（Indian Ayurvedic Medicine, IAM）。在中醫數千年發展所集結的經典著作中，明代李時珍所著作的《本草綱⽬》，就收錄了 1095 種植物，佔全部藥物總數的 58%，天然植物在當代的中醫臨床治療上，更是常⾒有效⽅劑之重要組成，居功厥偉。常⾒的植物⽣化素種類有：⼀、類⿈酮素（Flavonoids）：（1）槲⽪素（Quercetin）；（2）兒茶素（Catechin）；（3）花青素（Anthocyanidin）、前花青素（Oligomeric Proantho Cyanidins, OPC）；（4）檸檬⿈素（Hesperidin）；（5）芸⾹素（Rutin）； 5.

(24) （6）芹菜素（Apigenin）等。. ⼆、有機硫化物（Organosulfides）：（1）蘿蔔硫素（Sulforaphane）；（2）⼤蒜素（Allicin）；（3）麩胱⽢肽（Glutathione, GSH）；（4）吲哚（Indole）；（5）異硫氰酸酯（Isothiocyanates）等。. 三、類胡蘿蔔素（Carotenoids）：（1）β-胡蘿蔔素（β-Carotenes）、α-胡蘿蔔素（α-Carotenes）；（2）葉⿈素（Lutein）；（3）⽟⽶⿈素（Zeaxin）；（4）茄紅素（Lycopene）；（5）辣椒素（Capsaicin）等。. 四、酚酸類（Phenolic acids）：（1）綠原酸（Chlorogenic acid, CGA）；（2）鞣花酸（Sourtacid）； 6.

(25) （3）沒⾷⼦酸（Gallic acid）；（4）對⾹⾖酸（p-Coumaric acid）；（5）阿魏酸（Ferulic acid）；（6）⽔楊酸（Salicylic acid）等。. 五、植物雌激素：（1）異⿈酮（Isoflavones）；（2）薯芋皂苷（Diosgenin）；（3）⽊酚素（Xyphenolin）等。. 六、其他：（1）薑⿈素（Curcumin）；（2）葉綠素（Chlorophylls）；（3）苦⽠苷（Charantin）；（4）咖啡酸（Caftaric acid）；（5）檸檬酸烯（Limonene）、檸檬苦素（Limonin）；（6）植物皂素（Plant saponins）；（7）⽩藜蘆醇（Resveratrol）；. 7.

(26) （8）迷迭⾹酸（Rosemary acid）等。. 本論⽂主要研究植化素中的「槲⽪素（quercetin）」（屬於類⿈酮素），以及「蘿蔔硫素（sulforaphane）」（屬於有機硫化物）兩種天然植化素，對於糖尿病⼤⿏泌尿系統中腎臟與膀胱的保護作⽤。. 第五節番⽯榴與槲⽪素番⽯榴（Psidium guajava）屬於桃⾦孃科（Myrtaceae）番⽯榴屬（Psidium），是⼀種熱帶⽔果，在亞洲和臺灣都很受歡迎18。番⽯榴含有多種營養成份，特別是豐富的維⽣素 C、類⿈酮類（如槲⽪素）和多酚類化合物19。番⽯榴葉萃取物中含多元酚成分，能刺激脂肪細胞上胰島素受體的磷酸化及葡萄糖轉運蛋⽩的轉位，具有類似胰島素的功能，有助於糖尿病的控制。⽽番⽯榴萃取物可以降低第 I 型糖尿病⼩⿏腎臟中的氧化壓⼒、⽩細胞介素-6（interlukin-6）、腫瘤壞死因數-α（tumor necrosis factor-α）和⽩細胞介素-1β（interlukin-1β）的⽔準20。Li P.Y. 等的研究還發現番⽯榴具有抗氧化、抗炎和抗糖尿病作⽤，這些特性使番⽯榴受到廣泛關注21。 8.

(27) T2DM 占糖尿病總病例的 90%以上。雖然已有研究涉及番⽯榴葉萃取物與 T2DM 之間的相互作⽤22，但很少有研究報導番⽯榴的⾷⽤⽐例與 T2DM 之間的關係，這也是我們⼤感興趣的地⽅。我們在研究中萃取番⽯榴，發現它主要含有深具抗氧化⼒的⼀種⿈酮類植化素－槲⽪素（Quercetin），也稱作五羥⿈酮，是⼀種存在於天然⽔果、蔬菜和穀物等植物中的植源性⿈酮類化合物。其英⽂名 “quercetin”最早出現於 1857 年，其來源於“quercetum”，意為櫟樹林。⽂獻回顧中，Laura K.等⼈研究表明槲⽪素可能具有抗炎特性23，J. Mark Davis 等認為槲⽪素具有調節⼈體的潛在療效，24 Balabolkin 等認為槲⽪素可減輕花粉熱的症狀。25 Nothlings U.等⼈在⼀項⾧達⼋年的研究發現，槲⽪素可以降低吸煙者罹患胰腺癌的⾵險。26 槲⽪素已被 Laura K.等研究證明可增加⼤⿏的能量代謝，但僅限於短期（短於 8 週）。23 Davis JM 的研究指出，槲⽪素對⼩⿏運動耐受性的影響與增加線粒體⽣物合成有關，⼩⿏⼝服 12.5 ⾄ 25 mg/kg 濃度依次增加的槲⽪素，可增加線粒體⽣物標誌物的基因表達，並可改善運動耐受性。27 美國國⽴衛⽣研究院（NIH）的⽂獻回顧中，廣泛收錄了槲⽪素對於結節病、哮喘、肥胖相關的研究，特別是收錄了與糖尿病的葡萄糖吸收有關的初步研究，28有鑑於此，我們設計實驗以進⼀步研 9.

(28) 究番⽯榴中的槲⽪素，是否可以改善糖尿病因⾼⾎糖及氧化損傷所造成的腎臟傷害，是否能藉由槲⽪素對於腎臟細胞的保護作⽤，進⽽改善腎臟功能。. 第六節海藻糖除了番⽯榴，我們還對海藻糖（Trehalose）很感興趣。早在 1984 年的著名期刊《科學》（Science）中指出，許多能夠撐過無⽔狀態的⽣物，正是因為體內有海藻糖存在，才得以在無⽔的困難環境下存活。29 海藻糖能幫助⽣物度過艱困環境的海藻糖，也因此被稱為「⽣命之糖」。海藻糖是⼀種天然雙糖，廣泛存在於各種⽣物體中，包括植物、細菌、酵母和無脊椎動物30。這種雙糖是⾮還原性的，它將兩個葡萄糖單位以α,α-1,1-glycosidic ⽅式連接在⼀起31。海藻糖在這些⽣物體中起著保護作⽤，通過防⽌蛋⽩質變性來幫助細胞阻抗環境壓⼒，如⾼溫、低溫、乾燥、脫⽔和氧化32。由於其獨特的性質，海藻糖已被⽤於深低溫環境保存哺乳動物細胞、亨頓⽒病33和阿茲海默⽒病上。 Eroglu, A.等⼈研究表明海藻糖可以⼤⼤提⾼哺乳動物細胞在深低溫保存期間的存活率34。Cheng Xu 等的⽂獻指出，海藻糖可以藉由修 10.

(29) 正母體糖尿病所壓抑的細胞⾃噬與神經新⽣（neurogenesis），以避免胎兒的神經管缺陷（neural tube defects）。35 糖尿病患者的飲⾷受限，降低了⽣活品質，我們希望能開發⼀種好喝⼜有效的糖尿病保健飲料。番⽯榴汁喝起來有點澀，恐怕民眾接受度不太好，如果加上⼀種糖以增加⼝感，的確會讓飲⽤者接受度增加。但這種糖必須具有細胞保護作⽤，⼜不會明顯上昇⾎糖，依據⽂獻海藻糖是⾸選。所以實驗設定以番⽯榴汁混和海藻糖，研究其對 II 型糖尿病⼤⿏腎臟和胰臟病理⽣理的影響及其機制。. 第七節西蘭花、蘿蔔硫素與 Nrf2 餐桌上常⾒的西蘭花（Brassica oleracea var. italica），也稱綠花椰菜，屬於⼗字花科（Brassicaceae）芸薹屬（Brassica），是深受⼤眾喜愛的⼀種蔬菜。除了顏⾊翠綠好看，其營養價值也甚⾼，特別是含有蘿蔔硫素（sulforaphane），在各種芸薹屬蔬菜中，蘿蔔硫素含量約為 50∼2000μg/g，其中以西蘭花的含量最⾼。蘿蔔硫素是⼀種紅細胞核相關因⼦ 2（nuclear erythroid 2-related factor 2, Nrf2）激活劑，具有抗氧化性與抗癌性。在先前的研究中， Tai HC 等已將 Nrf2 激活劑⽤於改善缺⾎性膀胱損傷 17，對於降低糖 11.

(30) 尿病所引發的氧化損傷和發炎損傷，深具未來發展性。 Wang XJ 等的研究指出， Kelch-like ECH-associated protein （Keap1）/ NF-E2-related factor （Nrf2）信號，可以作為氧化壓⼒的傳感器36。我們發現，Nrf2 是⼀種可誘導的轉錄因⼦，可以調節抗氧化反應元件介導的解毒和抗氧化酶的表現，如 heme oxygenase-1 （HO-1），以提供抗氧化保護作⽤37。 Bcl-2 家族成員中，Bax 和 Bcl-2 與調節細胞凋亡有關38。抗凋亡 Bcl-2 存在於粒線體中，通過阻斷粒線體通透性轉換孔（mitochondria permeability transition pore, MTP）開放 39 ，或是作為⼀種對接蛋⽩（docking protein）40，以阻⽌效應因⼦ Caspases 的激活。胞漿中的 Bax 轉運到粒線體，會促使粒線體中的細胞⾊素 C 釋放到胞質中誘導細胞凋亡。相反地，Bcl-2 可以抑制粒線體細胞⾊素 C 的釋放，因⽽抑制細胞凋亡41。我們假設 Nrf2 轉位的減少，可能通過 Bcl-2 在糖尿病膀胱中的相關機制，⽽促進氧化壓⼒和粒線體功能障礙的增加。此外，糖尿病誘導的氧化壓⼒，可能通過粒線體功能障礙和 Nrf2/HO-1 信號通路的抑制，促進受損膀胱內質網壓⼒和細胞凋亡的形成。抗氧化劑蘿蔔硫素藉由激活 Nrf2/HO-1 信號通路，可能阻⽌粒線體細胞⾊素 C 釋 12.

(31) 放到胞漿中，從⽽減輕糖尿病患者的膀胱功能障礙。在本論⽂中，我們先探討蘿蔔硫素本⾝對於糖尿病⿏膀胱的功能促進作⽤。未來的計畫中，再進⼀步研究如何從其他植物（如西蘭花或中藥）有效率地萃取出蘿蔔硫素。. 第⼋節研究⽬的本⽂主要探討⽇常⽣活中常⾒的天然蔬果，如番⽯榴、西蘭花，其中所含的植物⽣化素槲⽪素、蘿蔔硫素，是否能對糖尿病併發的泌尿系統病變，如腎臟損傷與膀胱功能障礙，具有保護及功能增進作⽤，並討論其細胞分⼦⽣物學的作⽤機制。. 13.

(32) 第⼆章材料與⽅法第⼀節實驗動物第⼀項實驗動物第⼀⽬番⽯榴海藻糖實驗實驗動物是在 BioLASCO 臺灣有限公司購買的，出⽣ 7 周齡雌性 Wistar ⼤⿏，在臺灣國⽴臺灣師範⼤學動物實驗中⼼飼養，溫度恒定，光週期⼀致（光照時間為 07:00ー 18:00）。所有⼿術和實驗操作均經臺灣師範⼤學動物護理和使⽤委員會批准，並符合中華民國國家科學委員會（NSC1997）的指導⽅針。將動物隨機分為 6 組: 1. CON：對照組 2. DM：II 型糖尿病組 3. T1：T2DM 番⽯榴汁 4 ml/kg＋海藻糖 2 ml/kg 組 4. T2：T2DM 番⽯榴汁 8 ml/kg＋海藻糖 4 ml/kg 組 5. T5：T2DM 番⽯榴汁 20 ml/kg＋海藻糖 1 ml/kg 組 6. B1：T2DM 番⽯榴汁 4 ml/kg 14.

(33) 第⼆⽬蘿蔔硫素對排尿功能實驗實驗動物是在 BioLASCO 臺灣有限公司購買的 12 週雌性 Wistar ⼤⿏（200-250 克），在臺灣國⽴臺灣師範⼤學動物實驗中⼼飼養，溫度恒定，光週期⼀致（光照時間為 07:00 ー18:00）。所有⼿術和實驗操作均經台灣師範⼤學⽣命科學學院動物護理與使⽤委員會批准，並符合中華民國國家科學委員會（NSC1997）的指導⽅針。飼料（LabDiet 5001）和⾃來⽔可以任意供其使⽤。所有的努⼒都是為了盡量減少動物的痛苦，以及減少實驗過程中使⽤的動物數量。將⼤⿏隨機分為 4 組，每組 10 隻，其中 SF 代表蘿蔔硫素（Sulforaphane）預先處理: 1. CON：對照組：只⽤⽟⽶油 2. DM：糖尿病組，⽤ STZ 處理 3. CON+SF：對照組先⽤蘿蔔硫素處理 4. DM+SF：糖尿病組先⽤蘿蔔硫素處理. 第⼆項糖尿病誘發模型第⼀⽬第 II 型糖尿病誘發模型 15.

(34) CON 對照組採⽤標準飲⾷和正常飲⽔。另 5 組採⽤⾼果糖飲⾷誘導 T2DM，腹腔注射菸鹼醯胺（NA）（Sigma， Missouri，USA）（230mg/kg）和鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma， Missouri，USA）（65mg/kg ）。⾼果糖飲⾷包括 21%果糖⽔和 60%果糖飲⾷（TD. 89247, Harlan Teklad）。⾼果糖飼料餵養 8 周後，給⼤⿏注射 NA 和 STZ，發現⾎糖⾼於 230 mg/dl 的⼤⿏即誘導成功為 T2DM。. 第⼆⽬第 I 型糖尿病誘發模型以鏈脲佐菌素（STZ，Sigma）為原料，在檸檬酸鈉緩衝溶液中加⼊ STZ，在⿊暗中⽤冰浴溶解，得到 1%（pH 4.24.4）的 STZ 原液。糖尿病模型組於 10 分鐘內給予腹腔注射單次 STZ 65mg/kg，建⽴糖尿病模型。對照組則注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液（5.5 ml/kg）。在誘導糖尿病之前三天，⼤⿏先使⽤ Nrf2 活化劑－蘿蔔硫素預先處理（SF，12.5 mg/kg/d 溶於⽟⽶油中，i.p.）。步驟請參⾒圖 8（A）。使⽤此模型可快速誘發糖尿病，並伴有多尿，當尾靜脈 16.

(35) ⾎糖濃度⼤於 250 mmol/l（One Touch II; LIFESCAN），即誘導成功為 T1DM42。. 第⼆節番⽯榴萃取物製備以臺灣產的兩種番⽯榴，即泰國番⽯榴（G1）和珍珠番⽯榴（G2）為原料，研製出番⽯榴汁。將 50 克可⾷部分（去籽部分）的新鮮果實與 150 ml ⽔或 50%⼄醇混合。在室溫（25 °c）下保存 24 ⼩時後，我們⽤紗布過濾⼀次，再⽤ Whatman No. 1 濾紙過濾⼀次 20。C18-E 管柱（6 ml）⾸先⽤ 12 ml 甲醇沖洗，然後⽤ 12 ml ddH2O 沖洗。在柱中加⼊ 24 ml ⽔萃取液，或 48 ml ⼄醇萃取液（⽤ ddH2O 稀釋 2 倍）。待萃取液滴完後，⽤ 12 ml ddH2O 清洗管柱。我們⽤ 12 ml 甲醇沖洗最後的濃縮萃取物。最後得到：番⽯榴⽔萃取物 G1（GWE1）、G2（GWE2）番⽯榴⼄醇萃取物 G1 (GEE1)、G2 (GEE2) 並貯存在 -20 °C。. 17.

(36) 第三節試驗⽅法、儀器與試劑第⼀項測定⾎糖⾎糖濃度測定（mg/dl）儀器，是使⽤ Bayer Ascencsia ELITE XL (Bayer Healthcare, Whippany, USA)。空腹⾎糖（FBG）的測量是隔夜採⾎，經 14 ⼩時禁⾷後測量。. 第⼆項測定胰島素胰島素⽔平是由 Mercodia ⼤⿏胰島素酶聯免疫試劑盒（Mercodia Rat Insulin ELISA kit, Mercodia, Uppsala, Sweden）測定。實驗資料按曲線下⾯積（min x μg/l）顯⽰。. 第三項測定 HOMA-IR 和 HOMA-β 對於糖尿病患者要測量胰島素阻抗性，恆定態模型評估胰島素阻抗. （ Homeostasis Model Assessment-Insulin. Resistance, HOMA-IR）是⼀種廣⽤的指標。HOMA-β 的數值則代表胰島 β 細胞的功能和胰島素分泌指數。若以 mg/dl 為單位， HOMA-IR 的計算公式為： [禁⾷胰島素（μU/ml）x 空腹⾎糖（mg/dl）] / 405。 18.

(37) HOMA-β 的計算公式為: （360 x 禁⾷胰島素（μU/ml）/（空腹⾎糖（mg/dl）－ 63）。. 我們分別在第 0 周（4 周番⽯榴汁處理實驗開始）和第 4 周（4 周番⽯榴汁處理實驗結束）計算這 2 個數值。. 第四項測定糖耐受性第⼀⽬靜脈內注射糖耐受性試驗：隔夜禁⾷後，⽤阿維丁 avertin (200 mg/kg BW, i.p.) (Sigma, Missouri, USA) 進⾏⿇醉。⽤ PE50 管對頸動脈和頸靜脈進⾏插管，採集⾎液標本進⾏⾎糖測定，並注⼊葡萄糖（0.5 g/kg）。我們注射海藻糖（0.5 g/kg）⽤以⽐較與葡萄糖昇⾼⾎糖的能⼒差異。分別于注射前、注射後 1、5、 10、20、30、50、75 分鐘記錄⾎糖值。. 第⼆⽬⼝服糖耐受性試驗 19.

(38) 在隔夜禁⾷後進⾏⼝服糖耐受性試驗（OGTT）。⼝服葡萄糖負荷量（2 g/kg）採⽤灌胃法。從尾靜脈收集⾎液樣本，以試驗⾎糖⽔準。分別于灌胃前（0 min）和灌胃後 30、60、 90、120 min 採集標本。除了測量番⽯榴汁對⾎糖的影響，我們也測量了對番⽯榴汁的耐受性。. 第五項測定糖化⾎⾊素採⽤陽離⼦交換⾼效液相⾊譜法（ Cation-Exchange HPLC （ HLC-723 G7 HPLC analyzer, Tosoh bioscie nce, Belgium））檢測糖化⾎⾊素 HbA1c。. 第六項測定活性氧第⼀⽬體外活性氧（in vitro）使⽤化學發光分析系統（CLD-110, Tohoku Electronic In . Co., Sendai, Japan），在⼀個完全⿊暗的空間進⾏測量體外活性氧。這種儀器可以檢測到 luminol-amplified ROS 發出的化學發光43。. 第⼆⽬體內活性氧（in vivo） 20.

(39) 根據之前研究報告制定的⽅法，我們測定了⼤⿏腎活性氧⽔準 43。檢測腎臟化學發光的⽅法，是從股靜脈連續輸注（0.01ml/min）0.4. mg/ml MCLA（2-methyl-6-(4-. methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo-(1, 2-a)- pyrazin-3-one hydrochloride）。MCLA 與超氧陰離⼦⾃由基反應會⽣成化學發光。在活性氧測定後犧牲動物，收集組織⽤於其他實驗。. 第三⽬膀胱活性氧：膀胱活性氧量是從膀胱表⾯測量44。簡要地說，從靜脈注射超氧陰離⼦探針 MCLA (0.2 mg/ml/hr, TCI-Ace)，即可測量體內膀胱表⾯超氧陰離⼦活性氧反應，並⽤化學發光分析系統（CLD-110，Tohoku Electronic inc.）記錄。為了排除膀胱以外來源的光⼦發射，⿇醉動物被放置在⼀個帶屏蔽板的暗箱中。只有膀胱沒有被屏蔽，被放置在⼀個反射器下⾯，這個反射器可以將暴露在外的膀胱表⾯的光⼦反射到探測器區域。來⾃膀胱表⾯的 MCLA 增強的化學發光信號，被化學發光分析儀連續記錄。超氧陰離⼦活. 21.

(40) 性氧（ROS）值的總量乃由曲線下⾯積法測定。⾃ 0.2 mL ⽣理鹽⽔+ 1 ml MCLA（0.2 mg/mL）所獲得的超氧陰離⼦活性氧數值做為負對照組，⽽⾃ 0.2 ml ⿈嘌呤 xanthine（0.75 mg/kg）/⿈嘌呤氧化酶 xanthine oxidase（24.8 mu/kg）+ 1 ml MCLA（0.2 mg/mL）所獲得的氧陰離⼦活性氧數值做為正對照組。每 10 秒連續記錄⼀次 MCLA 增強的化學發光。實時顯⽰的化學發光信號被識別為來⾃膀胱的 ROS 數值。. 第七項測定槲⽪素我們使⽤由⾼效液相⾊譜泵、⼆極體陣列吸收檢測器所組成的⾼效液相⾊譜系統（Ultimate 3000 HPLC system），在 200-600nm 波⾧範圍內對番⽯榴汁樣品進⾏分析。⽤ Synergi RP-Max 管柱（Phenomenex, Macclesfield, UK），在 0.1%甲酸⽔溶液中，以 10-80%⼄腈 acetonitrile 為梯度，以 0.2 ml/min 的流速進⾏分離 40 分鐘。通過⼆極體陣列檢測器後，管柱洗脫液被導向裝有電噴霧介⾯（ Thermo Finnigan ）的 LXQ 離⼦阱質譜儀（ LXQ ion trap mass 22.

(41) spectrometer）。分析採⽤陰離⼦模式，適合槲⽪素的檢測。. 第四節粒線體蛋⽩質和胞漿分離的製備此節描述如何從新鮮膀胱製備胞漿和粒線體蛋⽩質45。為獲得粒線體蛋⽩，將膀胱組織切成⼩⽚，懸浮在緩衝液中（210 mM mannitol、 70 mM sucrose、10 mM Tris-HCl、ph 7.5、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、 5 mM EDTA、0.5 mM dithiothreitol、1 mM Na3VO4），輕輕混合均勻。勻合後經過濾，在 4 °C 的環境，先以 800 G 離⼼ 10 分鐘，取上清液再以 1200 G 離⼼ 10 分鐘，最後傾析後，以 15000 G 再次離⼼ 20 分鐘，這些固態顆粒屬於粒線體分離部份。上清液⽤超速離⼼儀（Beckman Coulter, Fullerton, CA) 在 100000 G 下進⼀步離⼼ 60 分鐘，上清液屬於胞漿分離部份。. 第五節切⽚染⾊製備第⼀項免疫組織化學（Immunohistochemistry, IHC）第⼀⽬腎臟與胰臟組織將組織切⽚、脫蠟，進⾏免疫組織化學處理 43。腎臟組 23.

(42) 織冷凍在 Tissue-Tek 最適切割溫度複合物（ Tissue-Tek optimal cutting temperature compound (Sakura Finetek)）中，並切成 50μm 切⽚。染⾊前處理，包含脫蠟、去除內⽣性還原酶，再加⼊初級抗體反應。初級抗體包括⼩⿏ anti IL-1β (1:1000; Cell Signaling Technology,. Denver, MA, USA),. 兔 anti Caspase-3 (1:500; Cell Signaling Technology, Denver, MA, USA), 及兔 anti 4-HNE (1:500; Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA)。之後將載玻⽚浸泡在 DAB（ImmPACT DAB Peroxidase Substrate; Vector, Burlingame, California, USA）中 3-5 秒鐘，⽤ ddH2O 洗滌，並將載玻⽚浸泡在蘇⽊精 hematoxylin 中 5 分鐘。切⽚在⼄醇脫⽔，並安置在固定介質上（Leica, Wetzlar, Germany）。. 第⼆⽬膀胱組織膀胱組織冷凍在 Tissue-Tek 最適切割溫度複合物中，並切成 50μm 切⽚, ⽤於氧化壓⼒和發炎反應的檢查。使⽤螢光顯微鏡（DMRD）檢查膀胱切⽚。為評估細胞凋亡，摘取. 24.

(43) 膀胱並固定於甲醛中，經切⽚、脫蠟，蘇⽊精-伊紅染⾊（HE stain），採⽤末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的缺⼝末端標記（the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL)）⽅法進⾏分析 17。. 第⼆項⾺松染⾊法（Masson’s Stain）腎臟切⽚，厚度為 5μm，組織固定於 Bouin ⽒液，流⽔沖洗⼀晚，常規脫⽔包埋。切⽚放⼆甲苯中脫蠟 10min 三次，⽤吸⽔紙吸乾液體。再分別以 100% ⼄醇泡 5 分鐘、 95% ⼄醇泡五分鐘各⼆次，再以流⽔沖洗 2 分鐘，⽤吸⽔紙吸乾⽔分。使⽤ Weiger ⽒鐵蘇⽊素染 5-10 分鐘，流⽔沖洗，再以 0.5% 鹽酸酒精分化 15 秒，流⽔沖洗 3 分鐘。接下來⽤麗春紅（Ponceau S）酸性品紅（acid fuchsin）染 8 分鐘，蒸餾⽔稍沖洗。使⽤ 1% 磷鉬酸（phosphomolybdic acid ）⽔溶液處理約 5 分鐘，不⽤⽔洗，直接⽤苯胺藍（aniline blue ）或亮綠（light green）染 5 分鐘。再⽤ 1% 冰醋酸處理 1 分鐘。以 95% ⼄醇脫⽔ 5 分鐘⼆次、 100% ⼄醇 5 分鐘⼆次， 25.

(44) ⽤吸⽔紙吸乾液體。最後以中性樹膠封⽚。經⾺森染⾊後，細胞質會呈現紅⾊，細胞核呈現藍⿊⾊⽽我們重點觀察的硬化區的結締組織，會呈現藍⾊。. 第三項螢光染⾊法（Fluorescent Stain）切⽚以⼆甲苯進⾏組織脫蠟 2 次各 10 分鐘，以濃度漸降酒精（100, 95, 80, 70%）進⾏組織回⽔之後，以抗原修復鍋做抗原修復 15 分鐘。接著做蛋⽩質封閉（protein block），在室溫下與 5 %⽜⾎清⽩蛋⽩（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）⾮特異性結合 1 ⼩時。經清洗後與初級抗體作⽤，在 4℃孵育 18 ⼩時，初級抗體包括 bs-2912R-Cy5 (rabbit anti MAP1A/M AP1B LC3 B polyclonal antibody ， Cy5 conjugated, 1: 500, Woburn, MS, USA) 和 bs-0081R-FITC (rabbit anti-Caspase-3 polyclon al antibody, FITC conjugated, 1: 500,Woburn, MS, USA)，核染⾊⽤ Hoechst 33342 (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 在室溫下染⾊ 1 ⼩時。⽤ PBS 清洗後，組織切⽚⽤安置在固定介質（Leica, Wetzlar, Germany）。⽤ Leica 徠卡 TCS. 26. SP3 鐳射共軛焦顯微鏡對.

(45) 載玻⽚進⾏掃描。. 第六節測量各種⽣理參數第⼀項以代謝籠記錄尿動⼒學和⽣理參數為了評估糞便和尿量以及排尿頻率，每只⼤⿏在⼿術前⼀天被放置在代謝籠 R-2100 代謝籠（R-2100 metabolic cage）中。在代謝籠研究期間，⽼⿏可以⾃由獲得飼料和⽔。. 第⼆項測量膀胱計量參數我們⽤⼀個經膀胱測量尿流動⼒學模型來評估所有⼤⿏的排尿反應，該⽅法先前在我們實驗室得到了很好的成果. 。簡要來說，⽤⼿術⼑將⼤⿏膀胱通過腹部中線切⼝. 44. 暴露，將 PE-50 導管（膀胱導管）通過膀胱圓頂頂端插⼊，通過 T 管連接輸液泵（0.02 ml/min）和壓⼒傳感器（GouldStatham）。膀胱內壓（The intravesical pressure , IVP）由 ADInstruments 數位記錄分析系統（PowerLab 16/35）連續記錄。（圖 14）除此之外，採⽤尿流動⼒學試驗⽅法，我們測量各組的 27.

(46) 膀胱反應變數如下：尿流間隔時間（intercontraction interval, ICI）收縮>15mm Hg 基準膀胱壓（baseline bladder pressure, BP）排尿時間（micturition time, MT）最⼤排尿壓（maximal voiding pressure, MVP）排尿收縮幅度（contractile amplitude, Am=MVP-BP）. 第三項測量⾎流動⼒記錄外科⼿術⽅式如前 44，將動物以 urethane（1.2g/kg）⽪下注射⿇醉後，把 PE-50 導管置於左側股動脈，以測量動脈⾎壓（ABP），左側股靜脈為藥物投⼊處。記錄動脈⾎壓使⽤儀器為 ADI system (Power-Lab/16S, ADI Instruments)，傳感器為 Gould-Statham 產品。（參照圖 14）. 第七節西⽅墨點法第⼀項腎臟和胰臟組織的檢測在腎臟和胰臟的蛋⽩質表現，我們使⽤西⽅墨點法來做 28.

(47) 檢測46. 47. 。分別採取腎臟和胰臟的組織檢體放⼊研鉢和研. 杵，並加上萃取緩衝液混合均勻。緩衝液的組成為 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)，140 mM NaCl, 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride, 1% Nonidet P-40 ， 0.5% deoxycholate, 2% βmercaptoethanol ， 10 μg/ml pepstatin A, 和 10 μg/ml aprotinin。將混合物進⾏均勻化處理，並在 4。C 溫度下保溫 30 分鐘。12000G 離⼼ 12 分鐘，收集上清液，⽤ BioRad 蛋⽩分析儀（BioRad Laboratories）測定蛋⽩質含量。初級抗體包括 IL-1β, LC3-β (MBL, Naka-ku, Nagoya, Japan), caspase 3, Bax, Bcl-2, Beclin-1 ( 由 Cell Signaling Technology，Denver, MA, USA), 和 β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。次級抗體包括 HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgG、HRP-conjugated donkey anti-goat IgG, 和 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (皆為 1:10000;. Sigma. Aldrich St. Louis, MO, USA)。. 第⼆項膀胱組織的檢測採⽤西⽅墨點法和密度測定法檢測膀胱組織 Bax、Bcl29.

(48) 2、Caspase-3、PARP、Nrf2、Keap-1 和 HO-1 的表現 17。將膀胱組織檢體放⼊研鉢和研杵，並加上萃取緩衝液混合均勻。緩衝液的組成為 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)，140 mM NaCl, 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride, 1% Nonidet P-40， 0.5% deoxycholate, 2% β-mercaptoethanol， 10 μg/ml pepstatin A, 和 10 μg/ml aprotinin。將混合物進⾏均勻化處理，並在 4。 C 溫度下保溫 30 分鐘。12000G 離⼼ 12 分鐘，收集上清液，⽤ BioRad 蛋⽩分析儀（BioRad Laboratories）測定蛋⽩質含量。所有以下抗體都與各⾃的⼤⿏抗原發⽣交叉反應。包括 rabbit monolclonal to Bax (Abcam)，rabbit polyclonal to Bcl2 (Abcam)， ployclonal rabbit antihuman caspase 3 (Upstate Biotechnology) ， monoclonal mouse antihuman PARP (Promega) ， rabbit polyclonal to Nrf2 (Abcam), Keap-1 polyclonal antibody (Proteintehc)，rabbit polyclonal to HO-1 (Abcam) 和 monoclonal mouse antimouse β-actin (Sigma)。胞漿的 Bax 轉位到粒線體，以及細胞⾊素 C 由粒線體滲漏到胞漿，是觸發細胞凋亡通路的必要條件 14。胞漿和 30.

(49) 粒線體組份，已在「粒線體蛋⽩質和胞漿組份的製備」⼀節描述。蛋⽩質濃縮液由 BioRad 蛋⽩質分析（BioRad Laboratories），使⽤ 10μg 蛋⽩質電泳來測定。初級抗體⽤ polyclonal rabbit antihuman cytochrome c（Santa Cruz Biotechology）和 polyclonal rabbit antihuman Bax (Chemicon) used at 1:1000。. 第⼋節統計分析第⼀項番⽯榴混和海藻糖實驗數據以平均值 ± 標準差（SEM）表⽰。為了在各組資料間進⾏⽐較，我們使⽤單因⼦獨⽴變異數分析（Analysis of Variance, ANOVA ）和學⽣未配對 t 檢驗（ Student’s unpaired t-test）。p < 0.05 具有統計學意義。統計學分析採⽤ SPSS 18.0 統計軟件（SPSS inc.）。. 第⼆項蘿蔔硫素排尿功能實驗數據以平均值±標準差（SEM）表⽰。⽣化和⽣理數據使⽤單因⼦獨⽴變異數分析（Analysis of Variance, ANOVA） 31.

(50) 來做統計分析。成對分析使⽤雙向學⽣ t 檢驗（two-way Student’s t tests）。p < 0.05 具有統計學意義。統計學分析採⽤ SPSS 18.0 統計軟件（SPSS inc.）。. 32.

(51) 第三章結果第⼀節番⽯榴萃取物中槲⽪素的含量我們試驗了番⽯榴汁中主要的抗氧化類⿈酮—槲⽪素的含量（結構⾒圖 1 A）。在標準混合物中鑒定了鞣花酸、阿魏酸、迷迭⾹酸、槲⽪素和柚⽪苷元等 5 種化學成分，番⽯榴汁中只發現了槲⽪素（含量⾒圖 1 B）。以⾼效液相⾊譜法測定番⽯榴汁萃取物中槲⽪素的含量（⾒圖 1 C），槲⽪素在 GWE1 中的濃度為 182.3 ng/ml，在 GWE2 中為 133.4 ng/ml，在 GEE1 中為 223.1 ng/ml，在 GEE2 中為 244.5 ng/ml。亦即珍珠番⽯榴以⼄醇萃取出的槲⽪素濃度最⾼。根據番⽯榴汁的濃度和體積，計算出番⽯榴汁中槲⽪素的含量為 0.633 μg/mL。在我們的研究中，每組⼤⿏每天攝⼊不同劑量的槲⽪素。T1 和 B1 組⼤⿏每天攝⼊ 2.5 μg/kg，T2 組⼤⿏每天攝⼊ 5.0 μg/kg， T5 組⼤⿏每天攝⼊ 12.6 μg/kg。. 第⼆節番⽯榴清除體外活性氧的能⼒以 H2O2 和 HOCl 為外源活性氧來源，評價番⽯榴汁清除活性氧的能⼒。結果表明，不同濃度的番⽯榴汁（圖 1 D, E），及不同種類 33.

(52) 的番⽯榴萃取物（圖 1 H, I）在體外對清除 H2O2、HOCl 活性氧⽔準的影響也不同。以 ddH2O 為參考對照，番⽯榴汁含量為 5-40%時，發現 H2O2 和 HOCl 的含量明顯地隨著番⽯榴汁的劑量降低。四種番⽯榴萃取物均能顯著降低 H2O2 和 HOCl 的含量（p < 0.05）。但 GWE1 和 GWE2 在清除 H2O2 和 HOCl 活性⽅⾯顯著⾼於 GEE1 和 GEE2（p＜0.05）。也就是說，番⽯榴⽔萃取物⽐⼄醇萃取物具有更⾼的活性氧清除能⼒。. 第三節海藻糖清除體外活性氧的能⼒結果發現，海藻糖在濃度 10%-50%時可以選擇性地降低 H2O2 數值，並且具有劑量依賴性（圖 1 F）。相反地，海藻糖在相同濃度範圍時，對 HOCl 數值沒有影響（圖 1 G）。海藻糖對活性氧的清除能⼒似乎是有選擇性的。. 第四節⼝服番⽯榴汁耐受性試驗如圖 2 所⽰，為了測定三種番⽯榴汁對正常動物⾎糖⽔準的影響，我們以⼝服餵⾷正常⼤⿏ 4 ml/kg 番⽯榴汁，分別含有 12 %海藻糖、8 %蔗糖或 40 %的番⽯榴汁（無糖）。結果顯⽰，這 3 種番⽯ 34.

(53) 榴汁對⾎糖無明顯升⾼作⽤。此外，他們之間沒有顯著性差異。. 第五節⼝服糖耐受性試驗在 CON 對照組⼤⿏中，⾎糖⽔準保持在⼀個相對較⼩的範圍（圖 2 D）。無論是 0 周、2 周還是 4 周，CON 對照組⼤⿏的⾎糖值均未超過 150 mg/dl。其他 5 組間差異無顯著性（圖 2 E 和 2 F）。⾎糖值在 30 和 60min 最⾼，在 500-600 mg/dl 之間。補充番⽯榴汁混和海藻糖並不能降低⾎糖。. 第六節靜脈內注射葡萄糖和海藻糖耐受性試驗為了評估靜脈注射葡萄糖或海藻糖後⾎糖⽔準的變化，我們通過靜脈注射 0.5 g/kg 體重葡萄糖或海藻糖。靜脈注射葡萄糖後 1 分鐘，⾎糖⽔準顯著升⾼⾄ 302.4 mg/dl（圖 2 B）。然⽽，靜脈注射海藻糖後 1 分鐘，⾎糖並沒有明顯升⾼。給予葡萄糖 1 分鐘後，昇⾼的⾎糖就開始下降。然⽽在第 75 分鐘時，⾎糖仍然⾼於開始時禁⾷的⾎糖。另⼀⽅⾯，正常動物經海藻糖處理後，⾎糖沒有明顯變化。. 35.

(54) 第七節糖化⾎⾊素的變化 DM 糖尿病⼤⿏糖化⾎⾊素⽔準為 CON 對照組⼤⿏的兩倍。在 T2 和 T5 ⼤⿏中，HbA1c ⽔準略有下降，但沒有統計學差異（圖 2 C）。. 第⼋節⾎糖變化在實驗第四週，對各組⼤⿏進⾏⼝服葡萄糖耐量試驗。我們⽐較了禁⾷ FBG（0 分鐘），與⼝服葡萄糖後（120 分鐘）的⾎糖（圖 3 A）。在 CON 對照組⼤⿏中，0 min 和 120 min 的⾎糖值均低於 100 mg/dl，且 0 min 和 120 min 之間無顯著性差異。糖尿病⼤⿏於 OGTT 試驗結束時⾎糖未下降，0 min 和 120 min 的⾎糖值差異有顯著性（p < 0.05）。其他各組（T1、T2、T5、B1）⼤⿏ 120 min 時的⾎糖反應仍較⾼，但差異性不顯著，這表明番⽯榴汁有助於 OGTT 的⾎糖控制。. 第九節胰島素的變化胰島素⽔準是以曲線下⾯積指數（AUC = min x μg/L）表⽰（圖 3 B）。CON 對照組胰島素⽔準的 AUC 為 66.6 ± 2.1 min x μg/L。由 36.

(55) 於 T2DM 的細胞損傷，DM 的 AUC 下降到 21.9 ± 1.4 min x μg/L。 AUC 在 T1、T2 和 T5 組都是升⾼的， T1（36.0 ± 0.5 min x μg/L）、 T2（38.2 ± 1.1 min x μg/L）和 T5（41.5 ± 4.5 min x μg/L）升⾼。B1 的 AUC 為 28.9 ± 0.8 min x μg/L。實驗結果表明，番⽯榴汁混和海藻糖對第 II 型糖尿病⼤⿏胰島素分泌功能有明顯的保護作⽤。. 第⼗節 HOMA-IR 和 HOMA-β 的變化 CON 對照組⼤⿏ HOMA-IR 值在第 0 周和第 4 周約為 2（圖 3 C）。在糖尿病⼤⿏，這⼀數值升⾼（⾼達 4.9），並在第 0 周⾄第 4 周保持穩定。T1、T2、T5、B1 各組⼤⿏ HOMA-IR 均在第 4 周低於第 1 周。T2、T5 兩組⽐較，差異有統計學意義（p < 0.05）。⽤番⽯榴汁混和海藻糖處理 T2 和 T5 ⼤⿏，不僅可以維持胰島素分泌功能，⽽且可以降低胰島素阻抗值。在 CON 對照組⼤⿏，HOMA-β 值約為 20，在第 0 周和第 4 周數值很接近（圖 3 D）。所有 T2DM ⼤⿏的 HOMA-β 值（低於 5）均低於 CON 對照組。糖尿病⼤⿏的 HOMA-β 值在第 0 周⾄第 4 周仍然較低。⽽其他 4 組（T1、T2、T5 和 B1）在第 4 周⽐第 1 周有升⾼ HOMA-β 值的趨勢。其中 T1 組與 DM 組⽐較差異有統計學意義（p 37.

(56) < 0.05）。. 第⼗⼀節切⽚染⾊的發現第⼀項胰臟切⽚第⼀⽬胰臟切⽚的 HE 染⾊在胰臟切⽚中，我們發現糖尿病⼤⿏的胰臟的蘭⽒⼩島（islet of Langerhans）直徑較⼩（圖 4），這與胰島萎縮有關。糖尿病⼤⿏的胰臟排列不規則，細胞邊界模糊或消失，細胞壞死。與糖尿病⼤⿏相⽐，T1、T2、T5 和 B1 ⼤⿏的胰島較⼤。此外，T1、T2、T5 和 B1 ⼤⿏的胰島細胞排列⽐ DM ⼤⿏更加規則。. 第⼆⽬胰臟切⽚的 IHC 和螢光染⾊糖尿病⼤⿏胰臟 4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表現明顯⾼於其他實驗組與對照組⼤⿏（圖 6）。番⽯榴汁加海藻糖（T1，T2，或 T5）或不加海藻糖（B1），均能顯著降低胰臟 4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表現。與 T1、T2 和 T5 相⽐，B1 組⼤⿏胰臟組織中 4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表 38.

(57) 現⽔準最⾼。在糖尿病⼤⿏胰臟切⽚中亦可⾒較⾼⽔準的 Caspase3 和 LC3-B 表現（圖 6）。 Caspase3 表現⾼於 LC3-B，提⽰ T2DM ⼤⿏細胞凋亡多於細胞⾃噬。T1、T2 和 T5 降低了 T2DM ⼤⿏胰臟切⽚中 Caspase3 和 LC3-B 的表現。與 T1、T2 或 T5 相⽐，B1 明顯具有更多的 Caspase3 和 LC3-B 的表現，說明番⽯榴汁中加⼊海藻糖可以進⼀步保護 DM 所致的胰臟損傷。. 第⼆項腎臟切⽚第⼀⽬腎臟切⽚的 HE 染⾊在腎切⽚中，糖尿病⼤⿏有出⾎的現象。糖尿病⼤⿏腎臟切⽚也出現中性顆粒細胞。T1、T2、T5、B1 ⼤⿏出⾎較少，中性粒細胞聚集較少，表明 T2DM 對腎臟的炎性損傷得到了消除。T1、T2 和 T5 ⼤⿏的這些特徵較 B1 ⼤⿏明顯減弱。. 第⼆⽬腎臟切⽚的⾺松染⾊⾺松染⾊可使硬化區染成藍⾊。我們發現硬化主要發⽣. 39.

(58) 在 T2DM ⼤⿏的腎⼩管，⽽不是腎⼩球（圖 4）。T1、T2、 T5、B1 組⼤⿏腎臟切⽚藍區明顯少於 DM 組。T2 和 T5 組⼤⿏的硬化⾯積較 B1 組⼩。. 第三⽬腎臟切⽚的 IHC 和螢光染⾊糖尿病⼤⿏腎⼩管 4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表現明顯⾼於 CON 對照組（圖 5）。番⽯榴汁加海藻糖（T1，T2，或 T5）或不加海藻糖（B1）的⼤⿏，4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表現較少。B1 組⼤⿏ 4-HNE、IL-1β 和 Caspase3 的表現⽔準均⾼於 T1、T2 和 T5。綠⾊螢光代表 Caspase3 介導的細胞凋亡，⽽紅⾊螢光代表 LC3-B 介導的細胞⾃噬。在腎臟切⽚中，糖尿病組胞漿中 Caspase3 和 LC3-B 的表現⾼於 CON 對照組（圖 5），我們還發現這兩種蛋⽩在糖尿病腎臟的腎⼩管中共存。Caspase3 和 LC3-B 蛋⽩在 T1、T2、T5 和 B1 的表現明顯降低。. 第三項膀胱切⽚第⼀⽬膀胱切⽚的 IHC 和 TUNEL 染⾊. 40.

(59) 我們使⽤ TUNEL 檢測（ Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)，來測定 4 組⼤⿏的平滑肌層，評價了蘿蔔硫素對 Nrf2 ⽔平、免疫組織化學和細胞凋亡的影響（圖 12 H-J）。我們發現，與對照組膀胱相⽐，糖尿病膀胱中 Nrf2 的螢光強度顯著降低（圖 12 I）， TUNEL 陽性細胞顯著增加（圖 12 J）。蘿蔔硫素能夠恢復部份 DM 誘導的 Nrf2 表現下降（圖 12 I），並減少 DM+SF 膀胱內 DM 觸發 TUNEL 染⾊出的凋亡細胞數（圖 12 J）。. 第⼗⼆節活性氧的變化第⼀項體內腎臟活性氧⽔準原始資料（圖 5 F）和統計資料（圖 5 G）都顯⽰糖尿病⼤⿏腎臟 CL 數值最⾼。T1、T2、T5 和 B1 的 CL 數值⽐ DM 低。. 第⼆項⾎清體外活性氧⽔準 DM ⼤⿏⾎清 ROS ⽔準明顯⾼於 CON 對照組⼤⿏（p < 0.05）（圖 5 H）。T1、T2、T5、B1 組⼤⿏的 CL 數值均顯 41.

(60) 著低於 DM 組（p < 0.05）。T1、T2 和 T5 的活性氧⽔準低於 B1。雖然 T1 和 B1 的差異不顯著，但 T2 和 T5 的⾎清活性氧明顯低於 B1（p < 0.05）。. 第三項體內膀胱活性氧⽔準蘿蔔硫素通過降低超氧陰離⼦ ROS 介導的內質網壓⼒、細胞⾃噬和⼤⿏膀胱細胞凋亡，來改善缺⾎誘導的逼尿肌過度活動 17。我們評估了蘿蔔硫素對 4 組⼤⿏體內膀胱超氧陰離⼦⾃由基⽔平的影響，使⽤ MCLA 增強的化學發光分析儀。分別給出四組⼤⿏膀胱超氧陰離⼦活性氧顯⽰的代表性原圖和統數值據（圖 9 A）。我們的數據顯⽰，與 CON 對照組和 CON+SF 組相⽐，DM 膀胱中觀察到較⾼的超氧陰離⼦活性氧值（圖 9 B）。此外，DM+SF 組的超氧陰離⼦活性氧⽔平明顯低於 DM 組。. 第⼗三節西⽅墨點法分析結果第⼀項番⽯榴混和海藻糖實驗與對照組相⽐，糖尿病組細胞⾃噬相關蛋⽩ Beclin-1, LC342.

(61) B，發炎性細胞凋亡相關蛋⽩ IL-1β，和細胞凋亡相關蛋⽩ Bax, Bcl-2, Caspase3 的表現明顯升⾼，T1、T2 和 T5 組細胞⾃噬相關蛋⽩表現明顯降低（p < 0.05）。番⽯榴汁加海藻糖（T1，T2，或 T5）或不加海藻糖（B1）均可顯著降低腎臟和胰臟細胞⾃噬標誌物 Beclin-1, LC3-B, 發炎性細胞凋亡標誌物 IL-1β，和細胞凋亡標誌物 Bax, Bcl-2, Caspase3 的表現。B1 ⼤⿏腎臟和胰臟細胞⾃噬標誌物 Beclin-1, LC3-B, 發炎性細胞凋亡標誌物 IL-1β, 細胞凋亡標誌物 Bax, Bcl-2, Caspase3 的表現明顯⾼於 T1、T2 和 T5。（⾒圖 7）. 第⼆項蘿蔔硫素對排尿功能實驗為了探討糖尿病膀胱的粒線體反應和 Nrf2/Keap1 信號轉導，我們檢測了糖尿病膀胱不同時間段粒線體 Bax、細胞⾊素 C、整個組織 Nrf2 和 Keap1 的表現⽔平。我們的數據表明，與對照組相⽐，粒線體 Bax 轉位在誘導 DM 後第 2 天顯著增加（圖 11 A）。與對照組相⽐，誘導 DM 後第 4 天 Cytosolic 細胞⾊素 C 釋放量顯著增加（圖 11 B）。與對照組相⽐，DM 誘導後第 6 天 Nrf2 表現顯著下降（圖 11 C），Keap1 表現顯著增加（圖 11 D）。 43.

(62) 這些數據表明，糖尿病可以導致粒線體功能障礙和 Nrf2 防禦機制受到抑制。我們進⼀步確定了蘿蔔硫素對這些⼤⿏粒線體 Bax、 Bcl-2，和細胞⾊素 C 表現的可能影響。圖 11E 顯⽰了四組⼤⿏膀胱蛋⽩表現的初始印跡。我們的結果顯⽰，與 CON 對照組膀胱相⽐，DM 膀胱中粒線體 Bax/HSP60（圖 11 F）和細胞⾊素 C/ β-肌動蛋⽩（圖 11 I）顯著升⾼，與 Bcl-2/HSP60（圖 11 G）和細胞⾊素 C/HSP60（圖 11 H）顯著降低有關。蘿蔔硫素能有效地保留粒線體 Bcl-2 和細胞⾊素 C，顯著抑制因 DM ⽽增強的粒線體 Bax 和細胞⾊素 C 的表現（圖 11 F-I）。這些數據表明，蘿蔔硫素可部分改善 DM 引起的粒線體功能障礙。如圖 12 所⽰，我們通過西⽅墨點法檢測這四組⼤⿏的整個組織，探討了蘿蔔硫素對糖尿病膀胱的 Nrf2, HO-1, ATF-6, CHOP 和 casp3, PARP 信號轉導的可能保護機制。四組⼤⿏的膀胱蛋⽩⽔平呈現典型的初始印跡(圖 12 A)。與 CON 對照組相⽐， DM 組 Nrf2/β-actin ⽐值(圖 12 B)和 HO-1/β-actin ⽐值(圖 12 C) 顯著降低，ER 應激標誌物 ATF-6/β-actin(圖 12 D)和 CHOP/βactin(圖 12 E)顯著升⾼，凋亡標誌物 caspase3(casp3c/casp3u;圖 12 F)和 PARP/β-actin ⽐值(圖 12 G)顯著升⾼。然⽽，蘿蔔硫素 44.

(63) 處理顯著恢復 DM 誘導的 Nrf2/β-actin 和 HO-1/β-actin 的下降(圖 12 B-C)，並顯著抑制 DM+SF 膀胱中 DM 觸發的 ATF-6 和 CHOP(圖 12 D-E)、casp3c/casp3u 和 PARP/β-actin(圖 12 F-G)的增加。. 第⼗四節蘿蔔硫素對⼤⿏尿流動⼒學參數的影響⾸先，我們測定了蘿蔔硫素對四組⼤⿏排尿參數的影響。圖 8 B 顯⽰了四組⼤⿏典型的原始圖像和排尿參數：包括膀胱收縮間期（ICI）、膀胱收縮幅度（Am）和排尿時間（MD）測定。我們的數據表明，蘿蔔硫素處理不影響 CON 對照組和 CON+SF 組之間的排空參數。與 CON 對照組相⽐，DM 組 ICI（圖 8 C）和 MD（圖 8 E）⽔平顯著升⾼，但對 Am 無明顯影響（圖 8 D）。與 DM 組相⽐，蘿蔔硫素處理能顯著降低 DM+SF 組 DM 增⾧的 ICI 和 MD（圖 8 C 和圖 8 E）。實驗結果顯⽰：蘿蔔硫素處理後，可以縮短兩次排尿收縮間期、縮短每次排尿持續時間，且不影響膀胱收縮幅度。此外，我們還觀察了蘿蔔硫素對四組⼤⿏膀胱容量的影響。圖 10 A 顯⽰了四組⼤⿏膀胱容量測定的典型原始圖。我們的數據顯⽰ CON 對照組和 CON+SF 組的膀胱容量沒有顯著差異。與 CON 對照 45.

(64) 組⼤⿏相⽐，DM ⼤⿏的膀胱容量顯著增加（圖 10 B）。與糖尿病⼤⿏相⽐，糖尿病+糖尿病組⼤⿏的膀胱容量明顯減少。. 第⼗五節綜合結果論述番⽯榴汁中主要抗氧化物只發現了槲⽪素（鞣花酸、阿魏酸、迷迭⾹酸、槲⽪素和柚⽪苷元），其中以珍珠番⽯榴⼄醇萃取出的槲⽪素濃度最⾼。番⽯榴汁含量為 5-40%時，清除活性氧（H2O2、HOCl）能⼒隨著劑量⽽增加。番⽯榴⽔萃取物⽐⼄醇萃取物具有更⾼的活性氧清除能⼒。⽽海藻糖在濃度 10%-50%時，清除活性氧（H2O2）能⼒隨著劑量⽽增加。實驗中所⽤的各組番⽯榴汁⼝服、靜脈注射海藻糖對⾎糖無明顯升⾼作⽤，在⼝服糖耐受性試驗 OGTT 中，亦不能有效降低⾎糖，對 HbA1c 亦無統計學差異，但有助於⼝服葡萄糖後⼆⼩時的⾎糖控制。番⽯榴汁混和海藻糖對 T2DM 胰島素分泌功能有明顯的保護作⽤。不僅可以維持胰島素分泌功能（insulin 昇⾼），⽽且可以降低胰島素阻抗值（HOMA-IR 降低），並提昇胰臟β細胞功能（HOMA-β昇 46.

(65) ⾼）。腎臟切⽚顯⽰，番⽯榴汁可以清除 T2DM 腎臟活性氧⽔準，減少腎臟的炎性損傷，包括減少腎出⾎與中性顆粒細胞聚集。番⽯榴汁加或不加海藻糖可以減少腎⼩管細胞程序死亡的相關蛋⽩，包括：4-HNE（脂質過氧化和氧化應激標誌物）、Caspase3（細胞凋亡標誌物）、LC3-B（細胞⾃噬標誌物）、IL-1β（發炎性細胞凋亡標誌物）。有關蘿蔔硫素的作⽤原理闡釋如下：糖尿病誘導後，將會依天數⽽發⽣：粒線體 Bax 轉位，細胞⾊素 C 釋放⾄胞質量增加，粒線體 mBcl-2 減少，Nrf2 表現顯著下降， Keap1 表現顯著增加，顯⽰出糖尿病能導致粒線體功能障礙和 Nrf2 防禦機制受到抑制。蘿蔔硫素能有效地保留粒線體 mBcl-2 和細胞⾊素 C（mCyt C），顯著抑制因 DM ⽽增強的粒線體 mBax 和胞質細胞⾊素 C（cCyt C）的表現。這些數據表明，蘿蔔硫素可部分改善 DM 引起的粒線體功能障礙。蘿蔔硫素處理後顯著地恢復 Nrf2 和 HO-1 數值，表⽰激活 Nrf2 系統。並且抑制 ATF-6 和 CHOP 數值，代表內質網壓⼒獲得緩解。 47.

(66) ⼜能增加 casp3c 和 PARP 數值，表⽰抑制細胞凋亡，事實證明在 TUNEL 染⾊出的凋亡細胞數有效地減少。蘿蔔硫素對⼤⿏尿流動⼒學參數的影響，實驗結果發現可以縮短兩次收縮間期（ICI），且不影響膀胱收縮幅度 (Am)，亦能縮短每次排尿持續時間(MD)。⽽ DM ⼤⿏的膀胱容量顯著增加，顯⽰有尿瀦留現象，以蘿蔔硫素預處理的⼤⿏容量明顯改善。. 48.

(67) 第四章討論第⼀節番⽯榴中槲⽪素與海藻糖保護腎臟的討論本研究證明番⽯榴汁混和海藻糖，對 T2DM 引起的腎臟和胰臟功能障礙有明顯的保護作⽤。此研究成果得到了各種⽣理參數改善的證據⽀持，反映在⼤⿏腎臟與胰臟中 HOMA-IR、HOMA-β、氧化壓⼒、發炎反應和細胞程序死亡的數值的改變上。遺傳傾向、衰⽼、肥胖和飲⾷⽣活⽅式是 T2DM 的主要病因48。本研究所使⽤的動物模型與現今⼈類的⽣活⽅式相似。⾼熱量和⾼脂肪飲⾷是引起代謝症候群和慢性疾病的主要飲⾷⽣活⽅式。這項研究中使⽤的⾼果糖飲⾷模仿了⼈類這種不健康的⽣活⽅式。已證實⾼果糖與胰島素阻抗、⾼⾎糖和⾼⾎壓有關49。它從肝臟誘導脂質形成，產⽣⼤量的三酸⽢油酯，進⽽降低胰島素敏感性50。傳統的 T2DM 模型，如 yellow A(vy/-)⼩⿏、db/db ⼩⿏，是轉基因和⾃發誘導的動物，它們具有穩定性和節省時間的優點，但成本也很⾼。這類動物的 T2DM 發展主要是遺傳的，不符合⼈類罹患 T2DM 真實飲⾷⽣活型態的模式51。STZ 注射液是誘發 T1DM 的⼀種傳統、簡便的⽅法，STZ 是⼀種氨基葡萄糖-亞硝基脲類化合物，通過葡萄 49.

(68) 糖轉運系統進⼊胰島細胞，烷基化損傷 DNA，引起胰島素分泌損傷和細胞死亡。相⽐之下，NA 提供 NAD，由於 STZ 引起的 DNA 損傷⽽被消耗。給予 STZ 和 NA 的動物似乎更接近 T2DM52，這就是我們在研究中使⽤這個模型的原因。番⽯榴及番⽯榴葉皆具有抗氧化性能，過去的⽂獻多著重在番⽯榴葉的抗氧化機制上，較少著墨於番⽯榴果實上。53 番⽯榴葉萃取物中含多元酚成分，能刺激脂肪細胞上胰島素受體的磷酸化及葡萄糖轉運蛋⽩的轉位，具有類似胰島素的功能，有助於糖尿病的控制54。番⽯榴果實含維⽣素 A、C 等營養物質及磷、鈣、鎂等微量元素，主要的抗氧化成份，是槲⽪素。維⽣素 C 在番⽯榴含量為 2.283 mg/g，雖然亦具有抗氧化功能，但由於左旋維他命 C 本⾝不安定且易衰減，容易因實驗時間致劑量減低，在本實驗未列⼊檢測。未來可以加測維⽣素 C 含量及其抗氧化能⼒，以了解其在番⽯榴汁具有清除活性氧能⼒中，所扮演的⾓⾊。研究結果表明，番⽯榴汁清除 H2O2 和 HOCl 的能⼒較強，與前⼈的研究結果⼀致。這種能⼒可以經由⼝服後發揮作⽤。體外⾎清活性氧⽔準測定結果表明番⽯榴的抗氧化作⽤能清除活性氧，腎臟和胰臟切⽚的 4-HNE IHC 染⾊結果也顯⽰了同樣的結果。 50.

(69) 另外，我們發現海藻糖的加⼊可以提⾼番⽯榴的抗氧化性能。有⼀種來⾃海藻糖缺陷突變體的⽩⾊念珠菌細胞，其對重度氧化壓⼒暴露（H2O2）極為敏感；⽽在無海藻糖缺陷的細胞中，暴露 H2O2 環境下可以誘導其細胞內的海藻糖積累，進⽽增加它的存活率 31。研究⼈員還認為，海藻糖可能是⼀種具有發展前瞻性的⾃由基清除劑，可協助哺乳動物器官⾃由基的清除 31。在我們的研究中，⾎清活性氧⽔準⾮常低，特別是 T2 和 T5 ⼤⿏，甚⾄低於 B1 ⼤⿏。雖然 B1 與 T1 之間沒有顯著差異，但 T1 仍顯⽰較 B1 低的 ROS ⽔準。這⼀發現與 4-HNE 染⾊結果⼀致。我們建議使⽤番⽯榴汁，經由⾼含量的槲⽪素混和海藻糖來減少 ROS 誘導的氧化損傷。我們將 T1 與 B1 進⾏⽐較，觀察海藻糖是否對 T2DM 有影響。 HOMA-β 結果表明，T1 組⼤⿏對胰島β細胞功能的控制優於 B1 組。 T1 組⼤⿏ HOMA-β 在第 4 周略⾼於第 0 周，⽽ B1 保持不變。然⽽，這種保護作⽤在 HOMA-IR 和胰島素⽔準上並不持續。HOMA-IR 不僅可以作為診斷胰島素阻抗的有效⽅法，⽽且可以作為 T2DM 患者治療期間的隨訪指標55。T1 和 B1 之間 HOMA-IR 沒有差異，添加海藻糖對 T1 和 B1 之間的胰島素敏感性沒有增加。隨著番⽯榴汁劑量 51.

(70) 的增加，胰島素分泌量略有增加，HOMA-IR 降低。這些結果表明，加⼊海藻糖有助於保護胰島β細胞功能，但不能改善胰島素阻抗。然⽽，番⽯榴汁有助於提⾼胰島素敏感性，劑量可能要⼤於 8 ml/kg BW/day（T2 和 T5 組）。. 糖尿病腎病與腎⼩球硬化等結構異常有關 8，⾺松染⾊結果顯⽰腎臟膠原沉積情況，腎切⽚顯⽰多數硬化發⽣在腎⼩管區，⽽不是腎⼩球區。實驗證明，T2 和 T5 ⼤⿏ DM 所致的硬化性損傷，可以使⽤番⽯榴汁處理。此外，番⽯榴汁處理保護了腎臟的溶⾎和發炎反應，以及胰臟的細胞排列。糖尿病最基本的特徵是⾼⾎糖。Huang, C.S.的⽂獻指出，番⽯榴具有抗⾼⾎糖的特性56。然⽽，在我們的研究中，⾎糖並沒有明顯的改善，糖尿病⼤⿏與其他⼤⿏經番⽯榴汁混和海藻糖處理後的⾎糖差異很⼩。這可能的原因是：Huang, C.S.等⼈⽤的動物模型與我們的模型不同，我們使⽤的動物模型更可能發⽣在 T2DM 的後期，因為它缺乏細胞的胰島素代償，⽽這種代償發⽣在初級階段。我們成功地定義了 T2DM 來誘導 FBG 超過 230 mg/dl。這種情況似乎⽐其他情況更嚴重。例如，在以前的研究中，在注射 STZ 和 NA 的⼤⿏中， FBG ⼤於 11.1 mmol/l，相當於 200mg/dl，定義 T2DM2。此外，在 STZ 52.