一、外部形態觀察：
觀察及記錄新鮮材料和蠟葉標本為之外部形態特徵、採集地點及生育環 境，雌花序以解剖顯微鏡觀察並拍照紀錄之，惟蛇菰乾燥過後較難觀察，因 此以新鮮標本和浸液標本以掃描式電子顯微鏡觀察為主。
二、花粉形態(以掃描式電子顯微鏡觀察之材料處理)：
由於先前研究已提及三藥蛇菰屬植物之花粉若以醋酸分解法處理會被 分解 (Hansen 1972)，因此我們僅以序列脫水方式進行處理，處理過程如下：
A. 置入 1.5ml 離心管 70%酒精 (30 分鐘)、85%酒精 (30 分鐘)、90% 酒精 (30 分鐘)、95%酒精 (30 分鐘)、100%酒精 (30 分鐘)、100%丙酮 (30 分 鐘)、100%丙酮 (10 分鐘)，置換時以離心機離心 5 秒避免花粉流失。
B. 將序列脫水後的花粉滴上濾紙以碳膠帶黏上鋁臺 (Stub)以臨界點乾燥法 (Critical point drying)處理。
C. 將材料鍍金(Coating)後以掃描式電子顯微鏡觀察後拍照記錄。
三、雌花序剖面形態(以掃描式電子顯微鏡觀察之材料處理)觀察：
A. 將雌花序切為 5 x 5 x5 mm 之大小 4 塊，樣本過大過多會影響脫水及二 氧化碳置換效果；樣本過小花序軸易萎縮造成雌花及附屬物脫落。
B. 置入 1.5 ml 離心管 70%酒精 (30 分鐘)、85%酒精 (30 分鐘)、90%酒精 (30 分鐘)、95%酒精 (30 分鐘)、100%酒精 (30 分鐘)、100%丙酮 (30 分 鐘)、100%丙酮(10 分鐘)
C. 雌花序以碳膠帶黏上鋁臺以臨界點乾燥法(Critical point drying)處理 D. 將材料鍍金後以掃描式電子顯微鏡觀察後拍照記錄。
四、果實傳播、物候資料及採樣之地理分布：
在野外採集時記錄本屬植物之分布和海拔高度等地理資訊以及蛇菰被 取食的跡象和排遺。標本因為蛇菰乾燥後不易辨識，因此我們僅以有分子材 料樣本建構亞屬內之蛇菰製作概圖 (圖 3)。
五、分子材料及樣本處理：
1. 蛇菰花序及寄主根部材料：
DNA 萃取：以 CTAB DNA extraction protocol (Doyle and Doyle, 1987) 萃取去 氧核醣核酸(DNA)，萃取方式如下。
A. 取苞片或花序/乾淨的根系 0.5~1g 作為材料，以液態氮研磨後倒入已在 65oC 預熱好之 10 ml 2X CTAB + 30 μl β-mercaptoethanol 中
B. 加入 CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1) 15 ml，輕輕左右上下 搖晃翻轉確保溶液均勻混合後，置入離心機以 9000 rpm 離心 10 分鐘。
C. 離心後取上清液置入新的離心管再次加入 CIAA 10ml，輕輕左右搖晃確 保容液均勻混合後，置入離心機以 9000 rpm 離心 10 分鐘。
D. 離心後取上清液置入新的離心管，加入體積三分之二的 isopropanol 後置 入 -20oC 冰箱放置 30 分鐘。
E. 將離心管置入離心機以 10000 rpm 離心 10 分鐘後倒掉上清液，以冷凍 75%酒精 10mL 清洗沉澱物 5 分鐘。
F. 將離心管置入離心機以 9000 rpm 離心 5 分鐘後倒掉上清液，置入真空 乾燥機抽真空 5 分鐘。
G. 加入 2 ml TE 溶液以及 1 μl RNase 去除材料中的 RNA，置入 37oC 烘箱 30 分鐘。
H. 取出離心管加入 7.5 ml 100%酒精及 1 ml 7.5 M 醋酸胺溶液放入-20oC 冰箱 0.5~1 小時或隔夜。
I. 冰凍完成後將離心管置入離心機以 10000 rpm 離心 15 分鐘後倒掉上清
圖3、本研究採樣地點概圖
液，加入 5 ml 70%酒精清洗 5 分鐘。
因此使用 Genomic DNA Mini Kit (Plant) (Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Taiwan)或 EasyPure PCR/Gel Extraction Kit (Bioman Scientific Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan)進行 DNA 的再純化。
3. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、定序、序列排列(Sequence alignment)與 indel 處理：
A. 蛇菰花序材料
使用 PCR 擴增一個核基因片段，由部分 18S rRNA 到 internal transcribed spacer 4 片段(簡稱 ITS 片段)，使用的引子 (primer)如表三所示。
PCR 反應混合溶液成分如下：39.5 μl ddH2O、5 μl 10x Taq PCR 溶液 (containing 15 mM MgCl2) (MDBio, Taipei, Taiwan)、2 μl 2 mM dNTPs 溶液、
各 1 μl 18S rRNA 1050f 與 18S RNA 1769r / 18S rRNA 1660f 與 ITS4 引子、
0.5U Taq DNA polymerase (MDBio, Taipei, Taiwan)。
部分 18S rRNA 到 ITS4 片段反應如下：先以 94oC 處理 5 分鐘；再以 94
oC 變性處理 (denaturation) 30 秒，56 oC 合成處理 (annealing) 45 秒，72 oC 展延處理 (extension) 45 秒，以此循環進行 40 次擴增處理，最後以 72oC 展 延處理 2 分鐘後再 4 oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反應產物加入 1 μl DNA 染劑，混和後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066% HealthView Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5 x TBE 溶液電泳槽中，電泳後以紫外光 照膠觀察。
將 PCR 擴增過後的樣本先以 Viogene PCR Clean Up system kit (Viogene,
New Taipei City, Taiwan) 或 Bioman 純化後送至國立臺灣大學生物技術研究 中 心 (Center of Biotechnology, National Taiwan University) 以 ABI PRISM3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, California, USA)進行定序作 業，所得序列資料由 Sequencer 4.7 (Gene Codes Corporation, Missouri, USA) 軟體進行人工判讀。以 MEGA7 軟體內的 clustal X 進行序列排序，再以手動 調整和處理 indel。
B. 寄主根系材料：
所有的寄主根材料均以 nrITS 片段進行擴增，但由於 ITS 片段引子有機 會擴增到真菌 nrITS 片段，因此部分擴增到真菌的樣本以具有高解析力的 matK 片段作為寄主分子鑑定之片段 (CBOL, 2009；Yu, et al., 2011)，使用的 引子 (primer)如表二所示。
ITS5 到 ITS4 片段反應如下：先以 94 oC 處理 5 分鐘；再以 94 oC 變性 處理 (denaturation) 30 秒，56 oC 合成處理 (annealing) 30 秒，72 oC 展延處理 (extension) 45 秒以此循環進行 40 次擴增處理，最後以 72 oC 展延處理 2 分 鐘後再 4oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反應產物加入 1 μl DNA 染劑，
混和後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066% Health View Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5x TBE 溶液電泳槽中進行電泳觀察，確定反應產物大小。
matK472F 到 matK1248R 片段反應同 Yu, et al. ( 2011)其反應如下：先以 94 oC 處理 3 分鐘；再以 94 oC 變性處理 (denaturation) 30 秒，48oC 合成處理 (annealing) 40 秒，72 oC 展延處理 (extension) 60 秒以此循環進行 40 次擴增 處理，最後以 72 oC 展延處理 10 分鐘後再 4 oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反 應 產物 加入 1 μl DNA 染劑，混和 後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066%
HealthView Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5 x TBE 溶液電 泳槽中，電泳後以紫外光照膠觀察。