國立臺灣大學生命科學院生態學與演化生物學研究所 碩士論文
Institute of Ecology and Evolutionary Biology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
蛇菰屬三藥蛇菰亞屬植物之系統分類研究
Systematics of Balanophora subgenus Balania (Balanophoraceae)
鄭憲燦
Shian-Tsan Geng
指導教授：胡哲明 博士 Advisor: Jer-Ming Hu, Ph.D.
中華民國 105 年 8 月
August 2016
致謝
這本碩士論文研究首先要感謝胡哲明老師的指導才得以完成，可以研究蛇菰 這麼有趣的植物真的是非常幸運，每當我和別人說我在研究這種植物的時候總是 投以驚訝而且疑問地眼光，讓我能和對方好好介紹這美麗又稀少的植物，真的很 感謝老師包容在我研究所期間擔任所學會長這麼的繁重職務，也讓我能參與臺大 兒童博物館的解說志工以及植物標本館運作，希望這本論文的完成老師會滿意；
第二要感謝王震哲老師，憲燦有幸在大學期間加入老師實驗室踏上植物分類的研 究，認識很棒的學長姐，也學到無比多的事務與知識，在未來的路上給我堅強的 後盾，論文修改期間老師給予很多建議與指正讓本研究更臻至完整；楊宗愈老師 在野外採集時總是非常幽默風趣，也不忘提點佛法的奧妙，在論文指導上也點出 我的盲點讓我能加以改進；蘇慧君學姐在研究期間給予我的鼓勵與支持，並在論 文修改都給我莫大的幫助。
由於蛇菰分布廣泛，植物採集與樣本處理方面必須要感謝各位老師、學長姊 的幫助才得以完成，中國科學院昆明植物所方偉先生、劉振穩先生、劉恩德老師 在雲南採集給予的幫助；福建師範大學生命科學院陳炳華老師甚至是親自開車帶 我們採集；林業試驗所植物標本館的鐘詩文老師提供本研究大量的 DNA 樣本，
昆蟲標本館蔡明諭先生在植物冷凍真空乾燥標本製作的幫助；中國科學院華南植 物園的張奠湘老師在廣州時給予的安排與協助；香港大學生命科學院的鄧展翔學 長在香港採集的幫忙；臺大生命科學院科技共同空間的陳香君老師、楊亞臻學姐 及吳佩穎學姐於 SEM 使用的協助。
接著要感謝就學期間的給予幫助的大家，臺大植物系統分類及演化研究室 的成員：徐馨怡學姐、張世白學長、黃俊溢學長、曾妤馨學姐、林奐宇學長、楊 承瑞學長、鄭怡如學姐、曾安妮學姐、于仁勇學長、韋志凌學長、謝傳愷學長、
謝昀臻學長、王錦堯、加藤詩邦、黃偉傑、林彥伯；臺大植物標本館：鄭淑芬老 師、高美芳學姐、王貴美阿姨、楊綉玉阿姨；師大植物系統分類研究室：梁珆碩 學長、楊智凱學長、呂長澤學長、鄭杏倩學姐、蔡思怡學姐、張元馨學姐、施福 隆學長、莊貴竣學長、邱妙楓學姐；臺大植物生理生態研究室：高文媛老師、蔡 孟穎學姐、吳泰中學長、洪麗智、張渼晨、王譯泯、何哲玲，李鳳鳴老師、吳聖 傑助教、楊富米助教、王芳緯助教、楊珺嵐助教、黃雅倫學姐在普植教學期間的 指導；還有生態演化所學會的夥伴，沒想到一起完成了這麼多的活動！最後是我 的家人，雖然對於我常出野外感到很莫名但還是很支持，甚至是陪伴我出外尋找 這怪奇的植物。原本我以為研究生的生活就只是單純研究而已，沒想到卻是我這 輩子最精采的生活，謝謝大家！
目次
目次...i
摘要...ii
Abstract ...iv
附圖目次...vi
附表目次...viii
第壹章、前言...1
第貳章、材料與方法...14
第參章、形態特徵...22
第肆章、物候資料及採樣之地理分布...51
第伍章、分子譜系關係...64
第陸章、寄主鑑定...70
第柒章、分類處理...75
第捌章、結論...90
第玖章、參考文獻...91
附錄一、杯莖蛇菰 (Balanophora subcupularis)雄花被片數統計...97
附錄二、蛇菰上拜訪昆蟲 (花粉及果實傳播)...98
摘要
蛇菰科蛇菰屬 (Balanophora)植物為無葉綠素的根寄生植物，蛇菰藉由吸器 汲取寄主養分及水分，花序在花期時才會從吸器抽長出來。蛇菰的花部器官十分 退化，雄花僅具一輪花被片以及不具花絲的聚藥雄蕊，雌花更是只剩雌蕊一個器 官 著 生 在 花 序 軸 或 是 附 屬 物 基 部 。 蛇 菰 屬 其 下 可 分 為 蛇 菰 亞 屬 (subgenus Balanophora)及三藥蛇菰亞屬 (subgenus Balania)。
根據先前研究所建構蛇菰屬內的分子譜系樹，確認過去被歸入三藥蛇菰亞屬 中 具 無 配 生 殖 的 日 本 蛇 菰 (Balanophora japonica) 是 蛇 菰 亞 屬 疏 花 蛇 菰 (B.
laxiflora)的近緣種，也確認三藥蛇菰亞屬是一具高支持度的單源類群，但使用此 亞屬分析的材料僅包含臺灣產之海桐生蛇菰 (B. tobiracola)與紅冬蛇菰族群 (B.
harlandii)，而大陸地區所產的紅冬蛇菰族群、筒鞘蛇菰 (B. involucrata)、川藏蛇 菰 (B. fargesii)及杯莖蛇菰 (B. subcupularis)並未納入探討。
為了釐清本亞屬類群的分子譜系關係並比較其細部分類特徵，本研究針對三 藥蛇菰亞屬植物之雌花序及花粉形態，利用掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察，並以 部分 18S rRNA 與 ITS 序列建構譜系樹進行系統分類的探討，亦抽取寄主根部 DNA 分子資料以鑑定寄主。B. harlandii 其分類歷史有許多同物異名被發表，不 同族群之間亦存在種內變異；分子證據結果顯示原 B. harlandii 為多系群，我們 重新對各分支定名，分別是模式標本產自香港的紅冬蛇菰 (B. harlandii)、臺灣產 的筆頭蛇菰 (B. mutinoides)以及一未定名蛇菰 (B. sp.)，而該種需要更多模式標本 檢視以及雄花形態才能予以定名。川藏蛇菰及筒鞘蛇菰都是苞片基部相連成鞘狀 的類群，在分類歷史上有數次整併或分離，兩者之差別在於性別表現不同，根據 其花粉及附屬物等細微構造，發現兩者並無太大差異，分子證據則支持兩者為非 常相近但不同分支的姊妹群，本研究暫時將此二名保留，但不另外處理這兩種的 學名位階。海桐生蛇菰學名一直以來有兩個拉丁名混用的情形，根據發表文獻我 們認為 B. wrighti 是裸名，應該使用 B. tobiracola。而以往曾被分類至三藥蛇菰亞 屬的杯莖蛇菰 (B. subcupularis)，依據花被片多為 4 數、花粉具孔的蛇菰亞屬特 徵以及分子證據，支持杯莖蛇菰歸入蛇菰亞屬中。
根據本論文研究，雌花著生位置不能單獨作為區分亞屬的特徵，因此我們限 縮亞屬的定義：蛇菰亞屬花被片 4 數以上、有花粉孔、三藥蛇菰亞屬花被片 3 數、
無花粉孔，然而對於無配生殖的蛇菰尚無界定亞屬的特徵。
寄主的分子鑑定結果顯示筆頭蛇菰之寄主為五列木科紅淡比屬植物；紅冬蛇 菰之寄主為豆科之雞血藤屬植物；未定名蛇菰之寄主為八仙花科之繡球花屬植物；
花屬、五味子科之五味子屬植物；海桐生蛇菰之寄主為木犀科植物；筒鞘蛇菰之 寄主為薔薇科李屬植物、杯莖蛇菰之寄主為衛矛科南蛇藤屬和無患子科之楓屬植 物。
關鍵字：蛇菰屬、三藥蛇菰亞屬、系統分類、ITS 片段、SEM、DNA 條碼
Abstract
Balanophoraceae is a root parasitic plant without chlorophylls. Balanophora is the largest genus in Balanophoraceae, which had been divided into two subgenera, Balanophora and Balania. The first phylogenetic analysis of Balanophoraceae showed that, the agamospermic B. japonica is confirmed to be allied to B. laxiflora, which was treated under subgenus Balania taxa. In addition, the subgenus Balania species formed a monophyloetic clade with a high support. However, only two Balanophora subgenus Balania taxa B. tobiracola and B. harlandii from Taiwan in previous study were sampled, and others members such as like B. fargesii, B. involucrata, B. subcupularis and population of B. harlandii in China were not included.
The aims of this research are to study the phylogenetic relationships of subgenus Balania with more complete sampling, and also to examine their micro-morphological (spadicle top surface and female flower adhering area) and palynological characters.
The results from phylogenetic analysis and different micro-morphological characters, phenology and attitudinal distribution showed that B. harlandii samples is polyphyletic. According to their morphology and phylogeny, the separate bracts and diecious Balanophora harlandii should be treated as B. harlandii, B. mutinoides and a unknown species B. sp.. B. fargesii and B. involucrata are bracts sheath-like taxa formed a highly supported clade, and micro-morphological characters also showed high similarity, but due to their different sexual expression, we treated its as different taxa.
Balanophora subcupularis is obviously different from all other subgenus Balania taxa by its micro-morphological characters, and the result of phylogenetic tree showed that B. fungosa it is sistered. Hence, B. subcupularis should be restated and treated under the subgenus Balanophora. In this study, we redefine the characters of two subgenus.
Male flower 3-merous, pollen inaperture in subgenus Balania, male flower 4-merous above, pollen aperture in subgenus Balanopohra.
In addition, we applied DNA barcoding technique to identify the host of Balanophora. According to the result, the confirmed hosts of B. mutinoides is Cleyera sp. (Pentaphylaceae), the host of B. harlandii is Callerya sp. (Fabaceae), the host of B.
sp. is Hydrangea sp. (Hydrangeaceae), the hosts of B. fargesii include Acer sp.
(Sapindaceae), Berberis sp. (Berberidaceae), Rhododendron sp. (Ericaceae) ,Salix sp.
Oleaceae, the host of B. subcupularis are Acer sp. (Sapindaceae) and Celastras sp.
(Celastrasceae).
Key word :
Balanophora, Balanophora subgenus Balania, Systematics, ITS sequences, SEM, DNA barcoding.
附圖目次
圖 1. Hansen (1972)所建構蛇菰屬的形態譜系樹...7
圖 2. 根據 18S rRNA 與 nrITS 序列所建構的蛇菰屬譜系樹...8
圖 3. 本研究採樣地點概圖...17
圖 4. Balanophora fargesii 植株照片...24
圖 5. Balanophora harlandii 雌株照片...25
圖 6. Balanophora harlandii 雄株照片...26
圖 7. Balanophora involucrata 雌株照片...27
圖 8. Balanophora involucrata 雄株照片...28
圖 9. Balanophora mutinoides 雌株照片...29
圖 10. Balanophora mutinoides 雄株照片...30
圖 11. Balanophora subcupularis 植株照片...31
圖 12. Balanophora tobiracola 植株照片...32
圖 13. Balanophora sp. 植株照片...33
圖 14. 本研究分類群吸器形態...35
圖 15. 本研究分類群苞片表面...38
圖 16. 本研究分類群雌花序剖面...42
圖 17. 本研究分類群雌花序俯視...43
圖 18. 本研究分類群棍棒狀附屬物頂端表面紋飾...45
圖 19 本研究分類群花粉形態-全花粉粒...48
圖 20. 本研究分類群花粉形態-局部放大...49
圖 21. 本研究於臺灣採樣地點詳圖...54
圖 22. 本研究於福建採樣地點詳圖...55
圖 23. 本研究於香港採樣地點詳圖...55
圖 24. 本研究於雲南採樣地點詳圖...56
圖 25. 本研究於貴州採樣地點詳圖...57
圖 26. 本研究於廣西採樣地點詳圖...57
圖 27. 蛇菰屬分子譜系樹...67
圖 28. 蛇菰屬蛇菰亞屬分子譜系樹...68
圖 29. 蛇菰屬三藥蛇菰亞屬分子譜系樹...69
附表目次
表一、蛇菰屬三藥蛇菰亞屬植物學名沿革表...11
表二、本研究聚合酶鏈鎖反應 (PCR)所使用之引子序列...21
表三、本研究蛇菰屬植物學名及中文名對照表...23
表四、本研究分類群棒形附屬物形質測量...44
表五、本研究分類群花粉形質測量...50
表六、本研究分類群標本紀錄之花期及海拔分布...53
表七、本研究分子序列樣本之證據標本資訊...58
表八、本研究花期紀錄之證據標本資訊...61
表九、本研究以 ITS 或 matK 片段經由 BLAST 後所鑑定的蛇菰寄主列表....72
表十、文獻紀錄之蛇菰可能寄主與本研究經分子鑑定結果比較...73
第壹章、前言
蛇菰科 (Balanophoraceae)植物為一至多年生肉質不具葉綠素的全寄生植物，
其形態高度特化不具一般根、莖、葉的構造且不具氣孔，而是寄生在根上以吸器 吸取寄主養分，(Kuijt, 1969)。過去蛇菰科被處理為蛇菰目 (Kuijt, 1969；Hansen, 1972；Takhtajan, 1997)，而 APG III (2009)與 APG IV (2016)分類系統依據分子譜 系關係置入檀香目，而根據 Su et al. (2015) 研究指出本科不為單系群，而需要更 多分子證據分析屬間關係。目前本科全世界約有 16 個屬 45 種，分布在熱帶非 洲、中南美洲、北起亞熱帶亞洲南部至澳洲北部及紐西蘭北部地區。蛇菰屬為本 科中最多種之分類群，屬內約 15-19 種 (Hansen, 1972；Huang & Jin, 2003)，分布 於中非、馬達加斯加、印度、大陸南方、台灣、日本、東南亞、大洋洲但集中於 東亞、東南亞地區 (Hansen, 1972)。
一、形態簡介
蛇菰屬屬名來自於希臘文 Balano- (橡實)和-phora (著生的)組成，意指如橡實
般著生的雌花序，而蛇菰的中文俗名由來則是「如蛇頭的菇類」，而菇為菰之異
體字，大眾也常誤認蛇菰為真菌。蛇菰的構造簡單，植株可分為兩個構造，分別 是花序以及吸器 (haustoria)，吸器是蛇菰與寄主根系維管束所組成的構造，幫助 蛇菰吸取宿主之水分及養分。吸器可由一或多個合生，有時呈分支狀，常含有黏 質，表面常有疣或星狀皮孔，其表面由兩種細胞組成：針刺細胞 (armature cell) 及星狀突起細胞 (stellate wart cells) (Kuijt & Dong, 1990)，當蛇菰進入花期，吸器 會在靠近表面處的組織會瓦解並形成一離生腔 (Schizogenous cavity)，下表皮細 胞轉形成分生組織發育為花序始原組織，最後花序突破吸器表面在基部形成稱為 托鞘(volva)的環形空腔 (Hansen, 1972；Heide-Jorgensen, 2008)。蛇菰花序為肉穗 花序，花序軸分為兩區：著生花朵的花序區 (floriferous region)與苞片區 (bracteate region)。苞片肉質無柄成鱗片狀，對生、互生、旋生或癒合成鞘狀包覆著花序軸
基部，而在過往文獻則有時被稱為葉 (leaf；Hansen, 1972、Huang & Murata, 2003) 或鱗苞片(bract；Tam, 1988)。
雌花序及部分雄花序軸於花序區時會膨大成卵形至披針形或近圓形、圓柱形，
顏色則可從黃色、橘、紅、深紅到紫紅色，花序軸於花序區會在結果期時抽長、
膨大。蛇菰屬植物為單性花，其性別表現為雌雄同株或雌雄異株，而雌雄同株之 雄 花 著 生 的 位 置 有 多 種 變 化 ， 多 數 種 類 位 於 雌 花 區 下 方 ， 而 Balanophora tobiracola 中雄花散生於雌花區中間，B. wildri 則雄花位在整個花序頂端，於雌花 區之上 (Kuijt, 1969；Hansen, 1972；Takhtajan, 1996)。
蛇菰的花部器官十分退化，雄花僅具一輪花被片以及不具花絲的聚藥雄蕊 (synandrium)，雌花更是只剩一枚一個子房的雌蕊，部分蛇菰雌花會著生在棒形 附屬物 (spadicle or claviform body；Hansen, 1972)或是在花序軸上(axis)，當雌花 期時柱頭會突出棒形附屬物用以授粉，而在 Hansen (1972)與 Murata (1990)提出 雌花著生位置與棒形附屬物形狀、頂端表面紋飾可作為分類依據。染色體基數主 要為 n=16, 18 (Hansen, 1972)。
二、花粉與果實傳播
在早期蛇菰屬植物的授粉與果實傳播機制並不清楚 (Kujit, 1969；Hansen, 1972)，Govindappa and Shivamurthy (1975)觀察到蜜蜂 (Apis florea)以及無螫蜂 (Meliphona sp.)取食 Balanophora abbreviata 花序的蜜滴以及花粉，並且腳上的花 粉籃有其花粉，認為蛇菰為蟲媒花。2002 年 Kawakita and Kato 研究日本產 B.
kuroiwai (= B. fungosa ssp. fungosa)以及 B. tobiracola 的授粉生物學，此研究乃首 次對於蛇菰屬植物授粉進行詳細的紀錄觀察。根據結果，B. kuroiwai 的傳粉者為 螟 蛾 (Assara sp., Nacoleia sp.) 、 大 蚊 (Limonia sp) 、 蠅 類 (Homoneura sp., Drosophila sp.)、姬蜚蠊 (Onychostyus notulatus)、寄生蜂 (Phanerotoma sp.)與螞 蟻 (Leptothorax sp.)；B. tobiracola 為土蠊 (Margattea satsumana)、日本蜚蠊
及金小蜂 (Pteromalidae sp.)。
Kawakita and Kato (2002)認為螞蟻和蜚蠊是蛇菰同株異花的傳粉者，另外也 發現到螟蛾會在蛇菰花序軸產卵，此外 Goto et al. (2012)發現蒼蠅會產卵在蓮花 菰 (Thonningia sanguinea)的雄花序，儘管螟蛾與蛇菰並沒有非常高的專一性，但 這種以取食植株作為孵育傳粉者幼蟲的方式與榕樹與榕果小蜂 (Janzen, 1979)、
饅頭果與細蛾(Kato et al., 2003)、絲蘭與絲蘭蛾(Pellmyr, 2003)的共生關係相似。
數篇文獻紀錄到的傳粉者包含 Heide-Jorgensen (2008)報導的蒼蠅；2012 年 Hsieh 觀察到螞蟻、蜜蜂、食芽蠅及胡蜂拜訪 B. laxiflora；2014 年 Wong 記錄到蜜蜂 (Apis sp.)、胡蜂 (Vespa velutina)、蠅類 (Chrysomya sp., Drosophila sp.)為其傳粉 者，另外 Wong 也分析了 B. harlandii 的氣味組成，包含乙酸乙酯 (ethyl acetate) 可 吸 引 麗 蠅 (Casana-Giner et al., 1999) ； 十 九 烷 (nonadecane) 、 二 十 二 烷 (docosane)為蜜蜂(Apis mellifera)的費洛蒙；二十二烷為多數果蠅 (Drosophila sp.) 的費洛蒙 (Howard et al., 2003；Mas and Jallon, 2005)；萘 (naphthalene)為蜜蜂 (Apis dorsata)的費洛蒙 (Blum et al., 2000)。因此蛇菰為了吸引傳粉者除了以蜜滴 以及花粉做為回饋以外，散發出的氣味也是因素之一。
蛇菰的果實非常小被認為可能是世界上最小的種子 (Hansen, 1972)，推測其 傳播媒介可能為風媒、水媒或動物傳播，然而沒有研究證實。目前觀察到蛇菰最 簡單的傳播方式是果實成熟後直接從花序表面剝落，而關於蛇菰果實的傳播方式 的研究非常缺乏僅兩篇研究提及。一是 2012 年 Conran and Li 報導雲南西雙版納 之 B. harlandii 花序被取食，推論是小型齧齒類動物所為，認為有可能是傳播果 實的媒介，然而根據該圖片筆者認為不似 B. harlandii，而可能為 B. japonica 或 B. laxiphora 之誤認，然而大陸地區是否有產日本蛇菰尚未有文獻紀錄。二是 2014 年 Wong 拍攝到赤腹松鼠 (Callosciurus erythraeus) 取食香港產 B. harlandii 花序 的影像，然而動物消化排出後的種子尚無研究是否仍能萌發。
三、蛇菰屬三藥蛇菰亞屬分類群分類歷史
蛇 菰 屬 是 J. R. & G. Forster 於 1776 年 所 提 出 ， 模 式 種 為 粗 穗 蛇 菰 (Balanophora fungosa J. R. & G. Forst.) ， 直 到 1856 年 Hooker 針 對 蛇 菰 族 (Balanophoreae)進行整理，同時發表 Balanophora involucrata Hook. f.及其四個變 種 var. rubra、var. flava、var. gracilis、var. cathcartii，然而在 20 世紀初期不同學 者對於本屬有不同看法或是從蛇菰屬中拆分成立不同屬，1935 年 Harms 針對蛇 菰科進行整理確立蛇菰屬的位階及種類，Hansen 於 1972 年發表蛇菰屬專論，依 據花被片 3 或 4 數以上、花粉孔有無、花藥是否橫裂以及雌花是否僅著生在花序 軸作為亞屬界定特徵，三藥蛇菰亞屬所包含的分類群，指出本類群分布在華南、
圖博、日本、臺灣及中南半島北部地區，本研究以此為依歸進行研究，其學名沿 革表請見表一。
1859 年 Hook. f. 發表香港產之蛇菰，命名為 Balanophora harlandii Hook. f.。
1894 年 Hemsley 發表湖北產之 Balanophora henryi Hemsley 和 B. minor Hemsley。
1896 年 Tieghem 依據 Balanophora polyandra 建立 Polyplethia 屬、Balanophora involucrata 建立 Balania 屬，成立新組合 Balania involucrata (Hook. f.) Tieghem。
1902 年 Makino 發表日本產 Balanophora japonica Makino 及 B. kuroiwai Makino。
1906 年 Leveille 發表貴州產 Balanophora esquirolii Leveille 其形態描述簡單，
僅提及該種與 B. indica 形態不同。1907 年 Tieghem 針對蛇菰科進行分類研究並 發表一個產自四川城口 (現屬重慶)的新種 Balanophora ceracea，描述兩個族 Balanophoreae、Bivolveae，Balanophoreae 族下有 Balanophora、Polyplethia、
Balaniella、Balania 屬。Tieghem 依據 Balanophora harlandii 建立 Balania 屬但為 一不合法屬名，因為 Tieghem 已於 1896 年用 B. involucrata 成立 Balania 屬，
Tieghem 將 Balanophora. henryi、B. japonica 移入該屬並發表 Balania ceracea Tieghem；Bivolveae 族下有 Bivolva 屬，依據 Balanophora involucrata 建立 Bivolva 屬也為一不合法屬名，因為 Tieghem 已於 1896 年用 B. involucrata 成立 Balania 屬，並將其下三個雌雄異株的變種 B. involucrata var. flava、var. gracilis、var.
名 Bivolva fargesii Tieghem。
1909 年 Makino 發表日本產 B. nipponica Makino。1910 年 Makino 發表日本 產 B. tobiracola Makino 及 B. wrightii Makino。1913 年 Valenton 發表臺灣產 Balanophora kawakamii Valenton 並將 Balania ceracea 轉移至 Balanophora，同年 Hayata 發 表 臺 灣 產 B. mutinoides Hayata 。 1931 年 Yamamoto 發 表 臺 灣 產 Balanophora kudoi Yamamoto。
1932 年 Setchell 以 Tieghem 的分類架構處理香港及鄰近地區的 Balanophora harlandii 以及其近似類群，Setchell 提及 Tieghem 以 B. involucrata 的所建立的 Bivolva 屬是一不合法名，因此將 Bivolva 屬全部轉移至 Balania 屬並且依據吸器 表面是否有星狀凸起 (pustulate)以及苞片形態進行種的歸併，包含將有吸器有星 狀凸起且苞片合生的 Bivolva involucrata、B. flava、B. gracilis 併入 Balania involucrata (Hook. f.) Setechell；吸器無星狀凸起且苞片合生的 Bivolva cathcartii、
B. fargesii 組合為 Balania cathcatii Setechell。吸器無星狀凸起且苞片分離之的 Balania harlandii、B. henryi、B. ceracea、B. kawakamii、Balanophora mutinoides 組合為 Balania harlandii (Hook. f.) Setchell；另將雄花散生雌花區間的 Balania tobiracola 及 B. wrightii 成立 Balaneikon 屬並轉移至該屬。
1932 年 Yamamoto 將臺灣產的 Balanophora kudoi 轉移至 Balania 屬。1933 年 Masamune 將臺灣產的 B. kawakamii、B. mutinoides 及日本產 B. nipponica 轉移 至 Balania 屬，1933 年 Diels 發表植株形態較 B. harlandii 大，產自廣東的 Balanophora valida Diels。
1935 年 Harms 對蛇菰科進行整理，將 Tieghem 所訂的 Balaniella、Polyplethia、
Balania 屬 降 至 Balanophora 亞 屬 位 階 ， 原 是 Balanophora 屬 的 類 群 成 立 Balanophorotypus 亞屬，而三藥蛇菰亞屬包含原 Setchell (1932) 的 Balania 屬及 Balaneikon 屬類群，並重新將 Setchell (1932) 併入 Balanophora harlandii 的異名 再分離出來。1965 年 Ohwi 發表日本產 Balanophora kiusiana Ohwi 並將 B.
nipponica 降為 B. japonica 之變種。
1972 年 Hansen 年針對本屬進行整理 (詳見圖 1) ，並依據花被片、花粉孔 有無以及雌花是否著生於花序軸的特徵分出屬下 2 個亞屬：蛇菰亞屬(Subgenus Balanophora) 與三藥蛇菰亞屬(Subgenus Balania)，其中蛇菰亞屬內有 4 個節及 17 個分類群，三藥蛇菰亞屬內有 2 個節及 4 個分類群。Hansen 認為三藥蛇菰亞 屬相較於蛇菰亞屬應為演化較早的類群，包含輻射對稱的 3 數花被片，數量較少 的花藥以及雌花僅著生於花序軸的特徵，Hansen 根據這些特徵將 Balanophora harlandii、B. wrightii (=B. tobiracola)、B. involucrata (含 B. fargesii)以及 B. japonica 歸入三藥蛇菰亞屬當中。同時對於具苞片分離、花被片 3 數、聚藥雄蕊扁平及雌 雄異株的蛇菰類群全部歸併至 Balanophora harlandii 下。Balanophora fargesii 及 B. involucrata 為苞片形成鞘狀的類群，其性狀相似，主要差別在於其性別表現為 雌雄同、異株，因此 Hansen 在專論中將 B. fargesii 併入 B. involucrata 的異名，
並將 B. involucrata 兩個變種 var. flava、var. cathcartii 併回該名，其中 var. gracilis 則併為 B. fungosa ssp. indica 的異名。此外 Balanphora tobiracola 與 B. wrightii 非 常相似，故併入後者名。B. japonica 雖為孤雌生殖類群，但 Hansen 認為其附屬 物為圓錐狀且雌花僅著生在花序軸，因此將之歸入三藥蛇菰亞屬中。
1976 年 Liu & Lai 於 臺 灣 植 物 誌 第 一 版 處 理 蛇 菰 科 ， 將 模 式 產 於 臺 灣 的 Balanophora kawakamii、B. kudoi、B. mutinoides 併入 B. harlandii，而將 B. wrightii 併入 B. tobiracola。
1982 年 Akuzawa 依據附屬物形狀及顏色將被併入 Balanophora japonica 的 B. nipponica 獨立出來。1982 年 Tam 發表雲南產之 Balanophora subcupularis Tam，
其花被片雖多為 4 片但沒有明確數據證實，其雄蕊聚藥且扁平橫裂，此特徵屬三 藥蛇菰亞屬。1985 年 Tam 另外發表一廣東產苞片旋生之新變種 Balanophora harlandii Hook. f. var. spiralis Tam (旋生蛇菰)。
1988 年 Tam 撰寫中國植物誌蛇菰科部分並做以下的處理：因性別表現不同 將 B. fargesii 從 B. involucrata 再次獨立出來；因吸器及苞片形態不同將 B. henryi
與 B. mutinoides 從 B. harlandii 獨立出來；認為 B. wrightii 為裸名採用 B. tobiracola。
1992 年 Xing and Li 對於中國產之蛇菰屬進行修訂，將雄花散佈在雌花序的 B. harlandii var. spiralis 併入 B. tobiracola；因為 B. abbreviata 的形態變異較大且 分布廣泛將 B. subcupularis 併為其異名；將 B. henryi 併為 B. harlandii 的同物異 名；而 Xing and Li 認為 B. mutinoides 的花序和吸器形態和 B. harlandii 不同，認 為其形態是 B. harlandii 中的穩定變異類型，而降為其變種 Balanophora harlandii Hook. f. var. mutinoides (Hayata) Xing。
1996 年 Qian 發表一雲南瀾滄產蛇菰 Balanophora langcangensis Qian，認為 其形態與花序不易與吸器分離的特徵和 B. mutinoides 不同。1996 年臺灣植物誌 第貳版發表，Hsiao & Huang (1996)在 B. harlandii 與 B. wrightii 處理方式同 Hansen (1972)，並提及 B. wrightii 雖然在中國植物誌 (1988) 被認為是裸名，但根據發表
圖 1、Hansen (1972)所建構蛇菰屬的形態譜系樹 (修改自 Hansen, 1972)。
1.雄花輻射對稱、2.雄花兩側對稱、3.雌花著生於附屬物及花序軸、4. 雌花僅 著生花序軸、5. 花粉三孔成三角形、6.花粉三孔成圓形、7.花粉多孔、8.花粉 無孔、9.雌雄同株同花序、10.雌雄異株
時有指名的發表文獻，在命名法規是為有效名，因此使用 B. wrightii。
1999 年 Hansen 整併主要於日本和中國從 1971 至 1998 年所發表的蛇菰，包 含將 B. subcupularis 併入 B. harlandii，認為 4 數花被片為 B. harlandii
的變異範圍；將 B. harlandii 的兩個變種 var. mutinoides、var. spiralis 併回 B.
harlandii；此外也將 B. langcangensis 併入 B. harlandii。
2003 年 Huang & Murata 撰寫中國植物誌英文修訂版對本亞屬處理如下：B.
involucrata、B. fargesii、B. tobiracola、B. subcupularis 延續 Tam (1988)於中國植 物誌的處理；B. harlandii 則依照 Hansen (1972, 1999)、Huang & Murata (2003) 處 理方式，B. harlandii var. spiralis 與 B. wrightii 併入 B. tobiracola。
2012 年 Su et al.首次以 18S rRNA 與 ITS 片段建構蛇菰屬植物分子譜系樹，
確立 Balanophora wrightii (=B. tobiracola) 及 B. harlandii 為一高支持度分支(圖 2)，而被 Hansen 歸入至三藥蛇菰亞屬之 B. japonica 則與 B. yakushimensis 互為姊 妹群且為 B. laxiflora 之近緣種，因此 B. japonica 應歸入蛇菰亞屬。就此結果，雌 花是否僅著生花序軸用來區分亞屬的特徵不再，應該重新界定分亞屬之特徵。
在 Hansen (1972, 1999) 的處理之下 B. harlandii 有十數個同物異名，Hansen (1999) 提及在可行的方法下盡量減少物種的數目，三藥蛇菰亞屬之 B. harlandii 圖 2、根據 18S rRNA 與 nrITS 序列所建構的蛇菰屬譜系樹。(改自 Su et al, 2012。
支持度為 MP/ML 底線下為 BI，雄花圖片來自 Kuijt, 1969)
在 Su et al. (2012)的分子譜系樹中僅有臺灣的族群，而不同 B. harlandii 族群在形 態與花期確實有差異，然系統性的研究觀察本類群卻付之闕如，因此本研究擴大 採樣的地點，並以掃描式電子顯微鏡觀察不同形態的族群其細微形態是否存有差 異，以分子譜系樹探討是否有隱蔽種的可能。
Balanophora fargesii 與 B. involucrata 在分類歷史上有數次整併或分離，除性 別表現不同以外作為分類依據，本研究增加觀察其花粉及附屬物等細微構造以及 分子證據釐清其分類地位。
Balanophora subcupularis 其聚藥扁平且為橫裂，屬於三藥蛇菰亞屬特徵，而 其花被片大多為 4 數。1999 年 Hansen 將之整併到 B. harlandii 中，認為 4 數花 被片只是族群變異不足以獨立處理為種的分類階層，然筆者認為其除了雌雄同異 株差別外，其外部形態及生育海拔相差非常大，而且其花粉及附屬物構造並未報 導過，因此增加樣本觀察與分子譜系等證據可以較客觀的處理本類群分類地位。
為了解決 Balanophora tobiracola 與 B. wrightii 學名一直懸而未決的情形，經 過筆者詳查，Makino 僅在 B. tobiracola 發表文獻 (1910) 指出 Ito (1887)為 B.
wrightii 之原始發表文獻，然檢視該文獻並無特徵描述，此時就需要查閱過往文 獻學名使用以確定其學名。
綜觀本亞屬植物分類處理看法歧異問題，筆者推估其原因為：
本屬植物形態退化，辨識特徵少且不易觀察，以往觀察苞片著生方式以及與 吸器著生、形態的差異作為鑑別特徵，但也有部分學者認為這些特徵皆屬變異範 圍，尤以 Balanophora harlandii 不同學者處理差異最大。Murata (1990)與 Su et al.
(2012) 經過觀察，認為附屬物形狀、雌花著生情形以及附屬物頂端紋飾可作為穩 定且可信的分類依據，然而過往許多研究在學名發表時僅描述巨觀形態，而未對 上述重要鑑別特徵進行觀察，特徵形態的多樣性導致分類學者無法掌握分類特徵，
然而 Hansen (1972, 1999)歸併方式是否過於人為而沒有譜系上的支持都還需要進 一步研究。
觀察標本是植物分類學者最重要的研究依據，蛇菰經過烘乾及擠壓上述細微 特徵幾乎消失，因此也僅能以巨觀形態作為分類特徵，此外吸器形態可作為分類 依據之一，然筆者檢視腊葉標本大多不具吸器，其原因是吸器與寄主相連的吸器 隨著蛇菰成長也會變大，與宿主連接會更緊密變得難以拔出，因此常可以看到有 較大花序的蛇菰標本沒有吸器。目前所觀察之蛇菰花期僅約 15 天 (Wong, 2014)，
數量稀少僅生長在原始林中，植株從土壤冒出易被其他植物所遮蔽，加上原始林 砍伐環境破壞嚴重造成採集者以至於難以採集，而且蛇菰在採集過後容易腐敗也 是標本稀少的原因。
根據臺灣維管束植物紅皮書指出臺灣產海桐生蛇菰為易危物種(VU)，而隨 著原始林砍伐加上蛇菰可做為中藥使用面臨強大採集壓力，不同種蛇菰也有不同 的化學物質與藥性 (陳等, 2010：Wang et al. 2012)。以往分類學者對於本亞屬植 物分類觀念的歧異甚巨，本論文希冀藉分子譜系證據確立三藥蛇菰亞屬植物的分 類特徵，以及整理基礎生態資料，對於未來醫藥使用與保育十分重要。
另外我們好奇蛇菰寄主為何且是否具有寄主專一性，因此抽取寄主根部的 DNA 分子資料以 DNA barcoding 的方式鑑定寄主，比較過往的文獻所報導的寄 主是否有差異。
1856185918941896190219061907 / 1909190919101913191319131925 Hook f.Hook f.HemsleyTieghemMakinoLeveilleTieghemMakinoMakinoHayataValetonYamamotoMakino & Nemoto B. involucrata*Balania involucrataBivolva involucrata B. involucrata var. flava*Bivolva flava B. involucrata var. gracilis*Bivolva gracilis B. involucrata var. cathcartii*Bivolva cathcartii B. involucrata var. rubra*Bivolva fargesii B. harlandii*Balania harlandii B. henryi*Balania henryiB. henryi Balania ceracea*B. ceracea B. kawakamii* B. mutinoides* B. minor*B. minor B. esquirolii* B. kudoi* B. tobiracola*B. tobiracolaB. tobiracola B. wrightii*B. wrightiinum. nud.B. wrightii B. japonica*Balania japonica B. nipponica*
表一、蛇菰屬三藥蛇菰亞屬植物學名沿革表 (B.：Balanophora；*：新種或新種下分類群；#：移至蛇菰亞屬)
19321932193319331933193519651972197619821982 SetchellYamamotoMasamuneYamamotoDielsHarmsOhwiHansenLiu & LaiTamAkuzawa Balania involucrataB. involucrataB. involucrata Balania carthcartii B. fargesii Balania harlandiiB. harlandiiB. harlandiiB. harlandii B. henryi B. ceracea Balania kawakamiiB. kawakamii Balania mutinoidesB. mutinoides B. minor Balania kudoiBalania kudoi B. valida*B. valida B. subcupularis* Balaneikon tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracola Balaneikon wrightiiB. wrightiiB. wrightii B. japonicaB. japonicaB. japonica Balania nipponicaB. japonica var. nipponicaB. nipponica B. kiusiana*
(續)、蛇菰屬三藥蛇菰亞屬植物學名沿革表
1984198819921996199619992003200720122016 Tam & FangTamXing & LiQianHsiao & HuangHansenHuang & MurataIwatsuki et al.Su & HuPresent Study B. involucrataB. involucrataB. involucrata B. fargesiiB. fargesiiB. fargesii B. harlandii var. harlandiiB. harlandii var. harlandiiB. harlandiiB. harlandiiB. harlandiiB. harlandiiB. harlandii B. hernyi B. sp. B. mutinoidesB. harlandii var. mutinoidesB. mutinoides B. harlandii var. spiralis*B. harlandii var. spiralis B. langcangensis* B. subcupularisB. subcupularisB. subcupularis# B. tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracolaB. tobiracola B. wrightii nom. nud.B. wrightiiB. wrightiinom. nud. B. japonicaB. japonicaB. japonica#B. japonica# B. nipponicaB. nipponica# B. kiusiana# B. abbreviata
表一(續)、蛇菰屬三藥蛇菰亞屬植物學名沿革表
第貳章、材料與方法 壹、研究材料
由於本屬植物外觀十分相似，必須透過觀察雌花序的附屬物以及雌花著生 的位置作為分類依據，只是標本經過烘乾擠壓便難以觀察。因此我們在野外拍 照和紀錄生育地類型、地理位置等，並採集成熟的花序以 70%酒精固定以供雌 花序形態、花粉形態研究之用，在採集的過程中將將蛇菰之吸器以及宿主之根 系完整留下以作為寄主鑑定之材料；並將部分植株攜回實驗室觀察以矽膠乾燥 製作臘葉標本、置入 70%酒精固定作為浸液標本以及掃描式電子顯微鏡觀察樣 本製備使用，部分標本委託林業試驗所昆蟲標本館蔡明諭博士製作冷凍真空乾 燥標本，存放在國立臺灣大學植物標本館(TAI)。
除採集新鮮標本以外，亦檢視國內外各大標本館藏之腊葉標本及國外模式 標本照片，檢視或取樣之標本館代號如下：
英國愛丁堡皇家植物園 (E) 福建師範大學 (FNU) 哈佛大學植物標本館 (GH)
中央研究院生物多樣性研究中心植物標本館 (HAST) 香港植物標本室 (HK)
中國科學院廣西植物所 (IBK) 中國科學院華南植物園 (ISBC) 英國邱皇家植物園 (K)
中國科學院昆明植物研究所 (KUN) 首都大學東京 牧野植物標本館 (MAK) 法國國立自然史博物館 (P)
國立臺灣大學生命科學院植物標本館 (TAI) 林業試驗所植物標本館(TAIF)
貳、研究方法：
一、外部形態觀察：
觀察及記錄新鮮材料和蠟葉標本為之外部形態特徵、採集地點及生育環 境，雌花序以解剖顯微鏡觀察並拍照紀錄之，惟蛇菰乾燥過後較難觀察，因 此以新鮮標本和浸液標本以掃描式電子顯微鏡觀察為主。
二、花粉形態(以掃描式電子顯微鏡觀察之材料處理)：
由於先前研究已提及三藥蛇菰屬植物之花粉若以醋酸分解法處理會被 分解 (Hansen 1972)，因此我們僅以序列脫水方式進行處理，處理過程如下：
A. 置入 1.5ml 離心管 70%酒精 (30 分鐘)、85%酒精 (30 分鐘)、90% 酒精 (30 分鐘)、95%酒精 (30 分鐘)、100%酒精 (30 分鐘)、100%丙酮 (30 分 鐘)、100%丙酮 (10 分鐘)，置換時以離心機離心 5 秒避免花粉流失。
B. 將序列脫水後的花粉滴上濾紙以碳膠帶黏上鋁臺 (Stub)以臨界點乾燥法 (Critical point drying)處理。
C. 將材料鍍金(Coating)後以掃描式電子顯微鏡觀察後拍照記錄。
三、雌花序剖面形態(以掃描式電子顯微鏡觀察之材料處理)觀察：
A. 將雌花序切為 5 x 5 x5 mm 之大小 4 塊，樣本過大過多會影響脫水及二 氧化碳置換效果；樣本過小花序軸易萎縮造成雌花及附屬物脫落。
B. 置入 1.5 ml 離心管 70%酒精 (30 分鐘)、85%酒精 (30 分鐘)、90%酒精 (30 分鐘)、95%酒精 (30 分鐘)、100%酒精 (30 分鐘)、100%丙酮 (30 分 鐘)、100%丙酮(10 分鐘)
C. 雌花序以碳膠帶黏上鋁臺以臨界點乾燥法(Critical point drying)處理 D. 將材料鍍金後以掃描式電子顯微鏡觀察後拍照記錄。
四、果實傳播、物候資料及採樣之地理分布：
在野外採集時記錄本屬植物之分布和海拔高度等地理資訊以及蛇菰被 取食的跡象和排遺。標本因為蛇菰乾燥後不易辨識，因此我們僅以有分子材 料樣本建構亞屬內之蛇菰製作概圖 (圖 3)。
五、分子材料及樣本處理：
1. 蛇菰花序及寄主根部材料：
DNA 萃取：以 CTAB DNA extraction protocol (Doyle and Doyle, 1987) 萃取去 氧核醣核酸(DNA)，萃取方式如下。
A. 取苞片或花序/乾淨的根系 0.5~1g 作為材料，以液態氮研磨後倒入已在 65oC 預熱好之 10 ml 2X CTAB + 30 μl β-mercaptoethanol 中
B. 加入 CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1) 15 ml，輕輕左右上下 搖晃翻轉確保溶液均勻混合後，置入離心機以 9000 rpm 離心 10 分鐘。
C. 離心後取上清液置入新的離心管再次加入 CIAA 10ml，輕輕左右搖晃確 保容液均勻混合後，置入離心機以 9000 rpm 離心 10 分鐘。
D. 離心後取上清液置入新的離心管，加入體積三分之二的 isopropanol 後置 入 -20oC 冰箱放置 30 分鐘。
E. 將離心管置入離心機以 10000 rpm 離心 10 分鐘後倒掉上清液，以冷凍 75%酒精 10mL 清洗沉澱物 5 分鐘。
F. 將離心管置入離心機以 9000 rpm 離心 5 分鐘後倒掉上清液，置入真空 乾燥機抽真空 5 分鐘。
G. 加入 2 ml TE 溶液以及 1 μl RNase 去除材料中的 RNA，置入 37oC 烘箱 30 分鐘。
H. 取出離心管加入 7.5 ml 100%酒精及 1 ml 7.5 M 醋酸胺溶液放入-20oC 冰箱 0.5~1 小時或隔夜。
I. 冰凍完成後將離心管置入離心機以 10000 rpm 離心 15 分鐘後倒掉上清
圖3、本研究採樣地點概圖
液，加入 5 ml 70%酒精清洗 5 分鐘。
J. 將離心管置入離心機以 9000 rpm 離心 5 分鐘後倒掉上清液，置入真空 乾燥機抽真空 5 分鐘。
K. 以 100 μl TE 溶液回溶後存放於-20oC 冰箱。
2. DNA 純化：
由於蛇菰花序和根系蓄積大量次級代謝物易影響後續聚合酶連鎖反應，
因此使用 Genomic DNA Mini Kit (Plant) (Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Taiwan)或 EasyPure PCR/Gel Extraction Kit (Bioman Scientific Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan)進行 DNA 的再純化。
3. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、定序、序列排列(Sequence alignment)與 indel 處理：
A. 蛇菰花序材料
使用 PCR 擴增一個核基因片段，由部分 18S rRNA 到 internal transcribed spacer 4 片段(簡稱 ITS 片段)，使用的引子 (primer)如表三所示。
PCR 反應混合溶液成分如下：39.5 μl ddH2O、5 μl 10x Taq PCR 溶液 (containing 15 mM MgCl2) (MDBio, Taipei, Taiwan)、2 μl 2 mM dNTPs 溶液、
各 1 μl 18S rRNA 1050f 與 18S RNA 1769r / 18S rRNA 1660f 與 ITS4 引子、
0.5U Taq DNA polymerase (MDBio, Taipei, Taiwan)。
部分 18S rRNA 到 ITS4 片段反應如下：先以 94oC 處理 5 分鐘；再以 94
oC 變性處理 (denaturation) 30 秒，56 oC 合成處理 (annealing) 45 秒，72 oC 展延處理 (extension) 45 秒，以此循環進行 40 次擴增處理，最後以 72oC 展 延處理 2 分鐘後再 4 oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反應產物加入 1 μl DNA 染劑，混和後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066% HealthView Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5 x TBE 溶液電泳槽中，電泳後以紫外光 照膠觀察。
將 PCR 擴增過後的樣本先以 Viogene PCR Clean Up system kit (Viogene,
New Taipei City, Taiwan) 或 Bioman 純化後送至國立臺灣大學生物技術研究 中 心 (Center of Biotechnology, National Taiwan University) 以 ABI PRISM3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, California, USA)進行定序作 業，所得序列資料由 Sequencer 4.7 (Gene Codes Corporation, Missouri, USA) 軟體進行人工判讀。以 MEGA7 軟體內的 clustal X 進行序列排序，再以手動 調整和處理 indel。
B. 寄主根系材料：
所有的寄主根材料均以 nrITS 片段進行擴增，但由於 ITS 片段引子有機 會擴增到真菌 nrITS 片段，因此部分擴增到真菌的樣本以具有高解析力的 matK 片段作為寄主分子鑑定之片段 (CBOL, 2009；Yu, et al., 2011)，使用的 引子 (primer)如表二所示。
ITS5 到 ITS4 片段反應如下：先以 94 oC 處理 5 分鐘；再以 94 oC 變性 處理 (denaturation) 30 秒，56 oC 合成處理 (annealing) 30 秒，72 oC 展延處理 (extension) 45 秒以此循環進行 40 次擴增處理，最後以 72 oC 展延處理 2 分 鐘後再 4oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反應產物加入 1 μl DNA 染劑，
混和後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066% Health View Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5x TBE 溶液電泳槽中進行電泳觀察，確定反應產物大小。
matK472F 到 matK1248R 片段反應同 Yu, et al. ( 2011)其反應如下：先以 94 oC 處理 3 分鐘；再以 94 oC 變性處理 (denaturation) 30 秒，48oC 合成處理 (annealing) 40 秒，72 oC 展延處理 (extension) 60 秒以此循環進行 40 次擴增 處理，最後以 72 oC 展延處理 10 分鐘後再 4 oC 下停止反應。最後以 5 μl PCR 反 應 產物 加入 1 μl DNA 染劑，混和 後以 1.2%洋菜膠 (含有 0.066%
HealthView Nucleic Acid Stain, Genomics, Taipei, Taiwan)於 0.5 x TBE 溶液電 泳槽中，電泳後以紫外光照膠觀察。
