以 Mini PlusTM Plasmid DNA Extraction System (Viogene BioTek Corp., New Taipei, Taiwan) 進行質體 DNA 萃取。由培養基挑取單一菌落的 E. coli ，接種 到 3 mL 的 LB/Chloramphenicol 培養液中，以 37 °C 震盪培養 12-16 小時。以 2600 rpm 轉速於室溫下將菌液離心 10 分鐘，移除上清液，加入 200 µL 的 MX1 solution 回溶菌體，並移至新的微量離心管中。加入 250 µL 的 MX2 solution，溫 和晃動微量離心管使溶液均勻混合，並靜置 2-5 分鐘作用。加入 350 µL 的 MX3 solution，溫和晃動微量離心管使溶液均勻混合，並靜置 2-5 分鐘作用。高速離心 10 分鐘後，小心取出上清液至管柱中，以高速離心 1 分鐘後去除廢液，接著加 入 500 µL 的 WN solution ，高速離心 1 分鐘以去除廢液，再加入 700 µL 的 WS solution，高速離心 1 分鐘去除廢液。最後再次高速離心 1 分鐘，將殘餘的酒 精完全去除。管柱移至新的微量離心管，靜置晾乾後，取 50 µL 的無菌水加到管 柱濾膜中心處，回溶質體 DNA。靜置一段時間後，以高速離心收集質體 DNA ， 並儲存於 -20 °C 下備用。
質體的構築
本研究使用 pSFS2A 質體建立突變株質體，用以後續建構所需的 C. albicans 突變株及互補株[62]。而 C. albicans SC5314 標準序列來自線上資料庫 (Candida Genome Database, CGD. http://www.candidagenome.org/)。實驗中所使用之引子列於 表二，由生物工程 (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China ) 合成。建構過程 使用的限制酶酵素來自 New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA 及 Thermo
Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA。
建構 pSFS-HST6 KO 質體
分別使用引子對 NO. 291/292 及 NO. 293/294 以 PCR 擴增 HST6 基因的 5’
flanking (435 bp) 和 3’ flanking (550 bp) 基因片段。再利用限制酶 ApaⅠ/XhoⅠ 及 SacⅡ/SacⅠ分別對 5’ flanking 及 3’ flanking 基因片段進行酵素截切反應，並 與被相同限制酶截切的 pSFS2A 質體接合，建構出 pSFS-HST6 KO 質體。
建構 pSFS-MFA1 KO 質體
利用引子對 NO. 531/532 以及 NO. 658/659 分別放大出 5’ flanking (480 bp) 和3’ flanking (511 bp) 兩種基因片段。以限制酶 ApaⅠ/XhoⅠ及 NotⅠ/ SacⅡ分 別針對 5’ flanking 及 3’ flanking 基因片段進行酵素截切，再與相同限制酶截切 過的 pSFS2A 質體接合，建構出 pSFS-MFA1 KO 質體。
建構 pSFS-HST6 AB 質體
使用引子對 NO. 575/576 擴增出包含 HST6 啟動子的 DNA 片段 (4723 bp) 。再以限制酶 ApaⅠ/XhoⅠ進行酵素截切，與相同限制酶截切過的 pSFS2A 質體接合後建構出 pSFS-HST6 AB 質體。
構築 C. albicans 突變菌株
本研究中所使用及構築之 C. albicans 菌株列於附錄表三，各基因型皆構築兩 株獨立菌株進行後續的實驗操作。
所有的 C. albicans 轉形作用都利用相同的實驗方式進行，在此以構築 MTLa/a 之 hst6/hst6 突變株為例說明。將 P37005 菌株接種至 YPD 培養液，於 30 °C 培養過夜。取出 200 µL 過夜培養之菌液接種至 10 mL YPD 培養液，於
30 °C 培養 5 小時。室溫下離心 10 分鐘收集菌液，轉速為 2400 rpm。去除上清
及 3’ check 基因片段 (898、1025 bp)，即可得轉形成功之 hst6::SAT1/HST6 菌株。
將 hst6::SAT1/HST6 菌株塗盤至 Maltose 培養基上，麥芽糖 (maltose) 會活化 MAL2p 啟動子，使下游 CaFLP 基因表現，而 Flp 蛋白質可作用在 FRT 切位的兩 端，以去除 CaSAT1 基因，得到不具有 NAT 抗性的 hst6/HST6 菌株。重複上述之 步 驟 進 行 第 二 次 轉 形 作 用 ， 將 經 酵 素 截 切 後 的 pSFS-HST6 KO 質 體 送 入 hst6/HST6 菌株，利用引子對 6/295、7/296 及 297/298 進行 PCR 反應，分別確認 5’、3’ check 及 ORF 片段 (898、1025、802 bp) ，即可得到轉形成功之 hst6/hst6::SAT1 菌株 (YL915、YL916)。於 RBY717 MTLa/a 菌株所構築的 Rhst6 突變株所使用之質體與轉型方法，和上述過程相同。經過 2 次 C. albicans 轉形作 用後，利用引子對 6/295、7/296 及 297/298 進行 PCR 反應，獲得 3 段基因片段 (5’
check、3’ check 及 ORF)，確認 C. albicans 雙套染色體上的目標基因是否成功被 剔除。最後即可得轉形成功之 hst6/hst6::SAT1 菌株 (YL769、YL770)。
構築 mfa1/mfa1 突變株時，以限制酶 ApaⅠ 及 SacⅡ 截切 pSFS-MFA1 KO
質體，進行轉形作用，送入 P37005 菌株中。第一次轉形後，利用引子對 6/537、
7/538 分 別 確 認 轉 形 基 因 之 5’ 及 3’ check 片 段 (1090 、 1044 bp) ， 得 到 mfa1::SAT1/MFA1 菌株。將 mfa1::SAT1/MFA1 菌株塗盤至 Maltose 培養基上，去 除 CaSAT1 基因，得到不具有 NAT 抗性的 mfa1/MFA1 菌株。重複第二次的轉形 作用，利用引子對 6/537、7/538 及 533/534，分別確認 5’、3’ check 及 ORF 片段 (1090、1044 、143 bp) ， 最後即可獲得 mfa1/ mfa1::SAT1 菌株 (YL1247 、 YL1248) 。
構築 hst6/hst6::HST6 互補株
從 E. coli 的 GM48 菌株中抽取 pSFS-HST6 AB 質體，以去除質體之甲基 化，接者利用限制酶 PfoⅠ進行截切，轉形送入已不具有 NAT 抗性的 hst6/hst6 突變株 (YL915、YL916)。將生長出的菌落以引子對 297/298 進行 PCR 反應，
確認 ORF 片段 (802 bp)，即獲得 hst6/hst6::HST6 互補株 (YL1089、YL1090)。
費洛蒙誘導之細胞附著 (Pheromone-induced cell adhesion)
將 white 細胞接種至 Spider 培養液中，於 30 °C 培養過夜。取 5 x 107個細 胞與新鮮的1 mL Lee’s 培養液均勻混合，並移入 12 孔盤內。分別加入 DMSO 或α-pheromone (胜肽序列為 GFRLTNFGYFEPG，由 GMbiolab Co, Ltd. 合成) 於 其中，使最終濃度各別為 0.01 % 及 10 µg/mL，與菌液混勻後靜置於室溫下 24 小時。將上清液去除，以 phosphate-buffered saline (PBS) 小心清洗 2-3 次並拍照 記錄。接著刮取蒐集吸附於 12 孔盤底的菌體，將其回溶於 1 mL 去離子水中，
利用分光光度計測定 OD600吸光值以測量菌數。實驗至少進行三重複獨立操作，
以student’s t-test 分析統計結果。