C. albicans 菌株之交配能力測試
3. RBY717 菌株的 HST6 基因缺失，並不影響於 NAG 誘導下 white-opaque
型之轉換
於前述實驗結果發現，P37005 之 MTLa/a 野生型菌株若剔除 HST6 基因時，
其 white-to-opaque 型態轉換比率於 NAG 誘導培養後，顯著減少 (圖十) 。為了 探討此現象是否亦存在於 Rhst6 突變株，本實驗同樣藉由 NAG 的誘導，觀測 Rhst6 突變株的 white-to-opaque 型態轉換效率。實驗將菌株均勻塗盤於含有 Phloxine B 染劑的 Lee's NAG 培養基上，於 25 °C 培養 4-5 天後，利用統計分析 菌株之 white-to-opaque 型態轉換率平均值及標準差，其中僅有 opaque 細胞所形 成的菌落會被 Phloxine B 染成粉紅色。實驗至少獨立操作三重複，結果如圖十三。
兩株 Rhst6 突變株的型態轉換率分別是 79.70 ± 12.29% 及 79.74 ± 15.18%，與 RBY717 菌株的 78.14 ± 11.11% 轉換率相比幾乎一致。故由結果可得知，剔除 HST6 基因並不影響 C. albicans MTLa/a 之 RBY717 菌株在 NAG 培養刺激下，
white-to-opaque 的型態轉換效率。
討論
為了適應多變的微環境，C. albicans 發展出多種的型態及獨特的型態轉換，
而本研究則主要著重於 white-opaque 型態。white 與 opaque 細胞之間最大的行為 差異在於有性生殖能力，只有 opaque 型態才具有交配能力。雖然 white 型態無法 a-pheromone 運輸蛋白質) 都呈現高度表現，而這兩者的功能皆與 a-pheromone
相關[53]。因此，本研究推測於 α-pheromone 所誘發的 white 細胞之細胞附著，
MFA1 與 HST6 也會參與其中。
過去研究認為 white 細胞費洛蒙訊息傳遞路徑的轉錄因子為 Tec1[51-52]。然
是透過相同的費洛蒙訊息傳遞路徑，且藉由相同的轉錄因子 Cph1 進行調控[53]。
本研究利用具有 selectable marker 的 opaque 菌株，進行 C. albicans 交配實驗，發 現 hst6 突變株的交配效率近乎於 0% (圖六)。由此結果顯示剔除 HST6 後，
而環境之中許多環境因子會影響 C. albicans 的 white-to-opaque 型態轉換，包 含氧化壓力、嗜中性白血球 (neutrophils)、低劑量的紫外線照射以及高濃度的二 氧化碳 (CO2) 等都可以促進 white 細胞轉換成 opaque 細胞[27]。本研究將各菌 株培養在含有 NAG (N-Acetylglucosamine) 的培養基，促使 white-to-opaque 型態 進行轉換時，意外地發現 hst6 突變株的型態轉換效率受到抑制 (圖十)。這暗示 著 Hst6 運輸蛋白質可能也會透過其他調控機制參與在 white-to-opaque 的型態轉 換。然而 Hst6 蛋白質為什麼與 white-opaque 型態轉換有關？其相關的調控機 制為何？本研究對此目前尚未有定論。僅可得知 Hst6 運輸蛋白質的功能，不單 只是運送 a-pheromone，對於 C. albicans 的多項生理反應、型態轉變等同樣具有
調控的潛力。 white-to-opaque 型態轉換，顯示其影響力可能只侷限於特定的 MTLa/a 菌株 (P37005)，具有菌株專一性。這些結果暗示著在 C. albicans 中即便擁有相同性狀 (如皆為 MTLa/a)，但品系 (strain) 不同的菌株之間，可能也會透過不同的調控
white-to-opaque 型態轉換。本次研究首度發現 a-pheromone 運輸蛋白質，Hst6 亦 會影響 white 細胞的費洛蒙誘導之細胞附著及 white-to-opaque 型態轉換，並提出 一個新的訊息調控模型，希望能有助於未來在 white 細胞費洛蒙反應之相關機制 的建立。
未來研究方向
1. 於實驗結果得知 HST6 基因的缺失會導致於 pheromone 刺激下，white 細胞的 細胞附著能力受損。而目前已知 Hst6 蛋白質的功能為 C. albicans MTLa/a 細 胞中負責分泌 a-pheromone 至胞外的 a-費洛蒙運輸蛋白質。因此對於 Hst6 運輸蛋白質如何參與在由 α-pheromone 所誘導的 white 細胞之細胞附著，提 出了幾個假設 (如討論所述)。其中針對剔除 HST6 基因可能導致成熟或未成 熟的 a-pheromone 累積在細胞內，進而造成 white 細胞的費洛蒙反應缺損之 假說，在未來希望能藉由建構同時缺乏 HST6 及 MFA1 基因的雙突變株 (hst6∆
/ mfa1∆)，以去除 hst6 突變株中造成 a-pheromone 累積的因素，並觀測其費 洛蒙誘導之細胞附著情形是否會回復至與野生株一致。
圖表
表一、本研究所使用之藥品
藥品名稱 製造商
Acetic acid Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Adenine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Agarose MDBio, Inc., Shandong, China
L-Alanine Acros Organics, Geel, Belgium
American bacteriological agar Laboratorios CONDA, Madrid, Spain L-Arginine monohydrochloride Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Boottel becto peptone Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA
Bovine serum Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
Chloramphenical Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
dATP MDBio, Inc., Shandong, China
dCTP MDBio, Inc., Shandong, China
dGTP MDBio, Inc., Shandong, China
DMSO MDBio, Inc., Shandong, China
dTTP MDBio, Inc., Shandong, China
Ethidium bromide solution (EtBr) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) MDBio, Inc., Shandong, China
D-glucose (dextrose) anhydrous Amresco LLC, Solon, OH, USA
Glycerol MDBio, Inc., Shandong, China
Glycine MDBio, Inc., Shandong, China
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
L-Isoleucine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
LB broth MDBio, Inc., Shandong, China
LB powderd MDBio, Inc., Shandong, China
L-Leucine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Lithium acetate dehydrate (LiOAc) Acros Organics, Geel, Belgium
L-Lysine monohydrochloride Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 • 6H2O) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA D(+) - Maltose monohydrate Acros Organics, Geel, Belgium
D-Mannitol Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
L-Methionine Amresco LLC, Solon, OH, USA
N-acetyl-D-glucoseamine (NAG) Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA Nourseothricin (NAT or LEXSY NTC) Jena Bioscience, Jena, Germany
Nutrient broth Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA
Pepsin 1:3000 Bio Basic Inc. Ontario, Cannada
Pheloxine B Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Poly (ethylene glycol) (PEG) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Showa Chemical Industry Co., St. Louis, MO, USA
L-Proline Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
RNase A Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
L-Serine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Sodium chloride (NaCl) MDBio, Inc., Shandong, China Sodium hydroxide (NaOH) MDBio, Inc., Shandong, China
Tetracyclin hydrochloric acid, 37 % Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
L-Theronine Amresco LLC, Solon, OH, USAhydrate
Tris base MDBio, Inc., Shandong, China
L-Tryptophan Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
L-Tyrosine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Uracil MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, USA
L-Valine Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Yeast extract Laboratorios CONDA, Madrid, Spain
Yeast nitrogen base without amino acid Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Zinc sulfate heptahydrate Showa Chemical Industry Co., St. Louis, MO, USA
表二、本研究所用之引子序列 Number Sequence (5’ to 3’)
2 CCTTC AATTG CATCG TAAGT ACC 3 GAAGA TGACT CAGGT CATGC 4 GTGGT CAATG GAGCT GATAC 5 ACATG TGGTC GCCCA ACTCC 6 CTCAA CCATA GCAAT CATGG 7 GCGAA AAAGT GGGCA CTAAG 112 GGGTG GTCGT TTCAC CGG 113 CCCGT TCAAG AATTG CCGT
291 GGAGC GGGGC CCGTC CTGTC CCAAT TAGGA AATAG 292 GGAGC GCTCG AGGGG AAAGA CAGTT TTTCA GATTT 293 GGAGC GCCGC GGGGG AATAT TCGCC AAGAG ATAGC 294 GGAGC GGAGC TCCAA GGTTG TTGAT GGTAA AGACG 295 GTTGT AGTGG TGGTG GTGGC
296 CGCTG GTAAG ATCAT TCCAG C 297 GTGAC GACTG ACAAT GATAC GC 298 CTATC AAATT ATCGG CAATA CGC
531 GGAGC GGGGC CCCTT GGTTG ATCCA TACTT GATGC A 532 GGAGC GCTCG AGCTC TATTT TTCGC AATTA CCCCC 533 AAAAT GGCTG CTCAA CAACA ATC
534 GGCGG TGGCT ATTAC ATAAC AGA 537 TTAAA ACAAA GAACC CACAT GCG 538 TGACA GTGAC AGTGG CTTGA TTG 541 TGGAC TTGTG TTGTT ATCTG GACT 542 CTTGC TGTGT TTGTG TTTGT GTTG
575 GGAGC GGGGC CCAAC CGATA CAAAC AAACA GAGGA 576 GGAGC GCTCG AGTTG CTGTG ATGAT GAAGA AGGTG 658 GGAGC GGCGG CCGCT CCCAC ATATT GTTCA ACATT TGG 659 GGAGC GCCGC GGGGT CAACT CTGGG TGAAA CCATT 660 TCAAC AAGGA TTCCG TGGTA ATG
661 TGTAG AAAGT AGCAC CTGGA GTAA 699 GCTGT GGTGT AAGTT CAGTT AGAA 700 GCGTA TCATT GTCAG TCGTC AC 701 TACCA GCAGA TGTCG CACTA C 702 AATGG TCCTC GTGGT GTAAT TGA 703 TCACA ACTGC TCAAT ACTTC ATTA 704 AAGGG TGTTG GCTAT TATGC
735 CCGAT TTAAG AAATT TGAAA TGTGG 736 AGTGT ACTCC GGTGA CGATT TTTC 737 CGACA AAAAC CAAGA AGCAG AATA 738 CCCAA AAAAA AATAA TGAGA AACGA 739 GAACT CCCAT TAGAA AGACT TTGGG 740 CAAAG GATTG CCCGA GTGTT T
表三、本研究所使用及構築之 C. albicans 菌株
Strain MTL Genotype White/Opaque Ref.
P37005 a/a Wild type White [33]
SC5314 a/α Wild type White [68]
RBY717 a/a Sorbose-induced from SC5314 isolate White [68]
RBY722 α/α Sorbose-induced from SC5314 isolate White [68]
DSY211 α/α leu2::hisG/leu2::hisG
his1::hisG/his1::hisG::SAT1 Opaque [63]
YL224, YL225 a/a cph1/cph1 White [53]
YL242 a/a tec1/tec1::SAT White [53]
YL769, YL770 a/a hst6/hst6::SAT (in RBY717) White This study
YL915, YL916 a/a hst6/hst6::SAT (in P37005) White This study
YL1089, YL1090 a/a hst6/hst6::HST6 (in P37005) White This study
YL1247, YL1248 a/a mfa1/mfa1::SAT (in P37005) White This study
YL1304, YL1305 a/a Opaque P37005 Opaque This study
YL1308, YL1309 a/a Opaque hst6/hst6 Opaque This study
YL1408, YL1409,
YL1432, YL1433 a/a/α/α Zygote of P37005 x DSY211 White This study
YL1434-YL1441 a/a/α/α Zygote of hst6∆ x DSY211 White This study
表四、GoTaq® DNA polymerase PCR 反應之溶液組成
Component Volume Final concentration
5x GoTaq® Flexi Buffer 5 μL 1x
表五、Phusion® High-Fidelity DNA polymerase PCR 反應之溶液組成
Component Volume Final concentration
5x Phusion® HF Buffer 10 μL 1x Forward primer (5 μM) 1 μL 0.1 μM Reverse primer (5 μM) 1 μL 0.1 μM dNTP mixture (10 mM each) 1 μL 0.2 mM each dNTP Phusion® High-Fidelity DNA
polymerase 0.5 μL 0.001 U
Extension 72 °C 30 sec/kb for GoTaq® DNA polymerase
15-30 sec/kb for Phusion® High-Fidelity DNA polymerase Final extension 72 °C 10 min
Soak 10 °C overnight
表七、iScript reverse transcriptase 反轉錄 PCR 反應之溶液組成
Component Volume
5x iScript reaction mix 4 μL iScript reverse transcriptase 1 μL RNA template (1 µg total RNA) X μL
Nuclease-free water to final 20 μL
表八、反轉錄 PCR 反應程序
Step Temp Time
Priming 25 °C 5 min
Reverse transcription 42 °C 30 min RT inactivation 85 °C 5 min
Soak 4 °C overnight
表九、iQ™ SYBR® Green supermix qRT-PCR 反應之溶液組成
Component Volume Final concentration 2x iQ™ SYBR® Green supermix 10 μL 1x
圖一、 hst6、mfa1 突變株及 hst6 互補株之構築與鑑定。於編號為 P37005 之 MTLa/a 野生型菌株中，建構 (A) hst6 突變株、 hst6 互補株及 (B) mfa1 突變 株。以 PCR 進行鑑定時，hst6、mfa1 突變株不具有 ORF 的基因片段，但會出 現 5’與 3’ check 之 PCR 產物。野生株在此作為實驗控制組，具有 ORF 之 PCR 產物，但不會產生 5’與 3’ check 之 PCR 產物。而將 HST6 基因互補回 P37005 MTLa/a 之 hst6 突變株中，則可得到 hst6 互補株。PCR 鑑定時，只有互補成 功的 hst6 互補株具有 ORF 的基因片段。
(B)
(A)
圖二、 剔除 HST6 基因導致費洛蒙誘導 MTLa/a (P37005) 細胞附著能力下 降。將 white 細胞接種至 Spider 培養液中，於 30 °C 培養過夜。取 5 x 107個 細胞與新鮮的 1 mL Lee’s 培養液均勻混合，並移入 12 孔盤內。分別加入 DMSO (-MFα) 或 α-pheromone (+MFα) 於其中，與菌液混勻後靜置於室溫下 24 小時。將上清液去除，以 phosphate-buffered saline (PBS) 小心清洗並拍照 記錄。接著蒐集吸附於 12 孔盤底的菌體，將其回溶於 1 mL 去離子水中，利 用分光光度計測定 OD600吸光值以測量菌數。實驗至少進行三重複獨立操作，
以student’s t-test 分析統計結果。於 α-pheromone 誘導下，僅 hst6 突變株之細 胞附著量與野生株相比有明顯的下降。***p<0.001。
圖三、 定量即時聚合酶鏈鎖反應分析在費洛蒙誘導下，野生株、hst6 突變株 及 mfa1 突變株的 PBR1 基因表現。以 Spider 培養液培養菌株之 white 細胞過 夜，取 5 x 107個細胞與1 mL Lee’s 培養液均勻混合，移入 12 孔盤內。分別 加入 DMSO (-MFα) 或 α-pheromone (+MFα)，並靜置於室溫誘導 4 小時。收 集菌株 (每組約 3 x 108個細胞) 進行 RNA 萃取，利用反轉錄聚合酶鏈鎖反應 轉錄為互補 DNA，再藉由 qRT-PCR 分析菌株之 PBR1 基因表現程度。在此以 ACT1 基因作為內部校正點 (internal control) ，未受 α-pheromone (-MFα) 刺激 的野生株 PBR1 基因表現值則為實驗基準點。實驗至少進行三重複獨立操作。
同樣地 hst6 突變株與 α-pheromone 作用後，PBR1 的基因表現和野生株相比有 明顯下降。*p< 0.05
圖四、 hst6 突變株於費洛蒙誘導下，STE2 及 CEK1 的基因表現與野生株相比 皆顯著下降。將 white 細胞之菌株株接種至 Spider 培養液培養過夜，取 5 x 107 個細胞與1 mL Lee’s 培養液混勻，移入 12 孔盤內。分別加入 DMSO (-MFα) 或 α-pheromone (+MFα)，並靜置於室溫誘導 4 小時。收集菌株 (每組約 3 x 108 個細胞) 進行 RNA 萃取，反轉錄為互補 DNA 後，再藉由 qRT-PCR 分析菌株 之 (A) STE2 及 (B) CEK1 的基因表現程度。在此以 ACT1 基因作為內部校正 點 (internal control)，而未受 α-pheromone (-MFα) 刺激野生株的基因表現值作 為實驗基準點，設為 1。實驗至少進行三重複獨立操作。受 α-pheromone 作用
(A)
(B)
圖五、 定量即時聚合酶鏈鎖反應分析於費洛蒙刺激後，野生株、tec1 突變株 及 cph1 突變株的 HST6 基因表現。以 Spider 培養液培養菌株過夜，取 5 x 107 個細胞與 1 mL Lee’s 培養液均勻混合，並移入 12 孔盤。分別加入 DMSO (-MFα) 或 α-pheromone (+MFα)，靜置於室溫誘導 4 小時。收集菌株 (每組約 3 x 108個細胞) 進行 RNA 萃取，反轉錄為互補 DNA 後，利用 qRT-PCR 分析 菌株之 HST6 基因表現程度。實驗以 ACT1 基因作為內部校正點 (internal control)，而未受 α-pheromone (-MFα) 刺激之野生株的基因表現值則設為實驗 基準點。實驗至少進行三重複獨立操作。於 cph1 突變株中幾乎觀測不到 HST6 基因的表現，暗示著 Hst6 運輸蛋白質主要是受到轉錄因子 Cph1 的調控。
**p<0.01
Mating cross
圖六、 交配效率測試。將 MTLα/α 及 MTLa/a 的 opaque 細胞接種至 Spider 培養液，置於 25 °C 培養過夜。分別從兩菌液中取出 2 x 107個細胞均勻混合，
圖六、 交配效率測試。將 MTLα/α 及 MTLa/a 的 opaque 細胞接種至 Spider 培養液，置於 25 °C 培養過夜。分別從兩菌液中取出 2 x 107個細胞均勻混合，