質體 (Plasmid) pMD2.G

帶有以 CMV 啟動子表現 VSV 套膜醣蛋白之表現質體，用於包裹慢病毒。此質 體由陽明大學王學偉老師惠贈。

p8.91

帶有以 CMV 啟動子表現 HIV-1 gag、pol、tat、rev 之表現質體，用於包裹慢病毒。

此質體由陽明大學王學偉老師惠贈。

pMD.G

帶有以 CMV 啟動子表現 VSV 套膜醣蛋白之表現質體，用於包裹慢病毒。此質 體購自中研院 RNAi core 核心設施。

pCMVΔR8.91

帶有以 CMV 啟動子表現 HIV-1 Gag、Pol、Tat、Rev 之表現質體，用於包裹慢病 毒。此質體購自中研院 RNAi core 核心設施。

表現載體，以 SV40 啟動子表現目標基因，且具有 ampicillin 抗藥基因。(Stratagene) pSG5-LMP1

以 SV40 啟動子表現 LMP1 之表現質體。此載體由英國伯明罕大學 Dr. Alan B.

Rickinson 惠贈。

pLKO AS2.neo

慢病毒表現載體，以 CMV 啟動子表現目標基因，且具有 neomycin 抗藥基因。

此載體購自中研院 RNAi core 核心設施。

pLKOAS2.neo-DUSP6

以 CMV 啟動子表現人類 DUSP6 基因的慢病毒質體，由本實驗室董姿巡學姊構 築。

pLKOAS2.neo-DUSP6 C293S

以 CMV 啟動子表現人類具有催化區域突變 DUSP6 之基因的慢病毒質體，其 DUSP6 之催化區域第 293 位點由 cysteine 突變為 serine。由本實驗是董姿巡學姊 構築。 籤，載體上具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。

pCMV-Tag2B-DUSP6

以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類 DUSP6 基因的表現質體。由美國 西北大學 Jonathan D. Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。

pCMV-Tag2B-DUSP6 C293S

以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類具有催化區域突變 DUSP6 之基因 的表現質體，其 DUSP6 之催化區域第 293 位點由 cysteine 突變為 serine，由美國 西北大學 Jonathan D. Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。

pCMV-Tag2B-DUSP8

以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類 DUSP8 之基因的表現載體(附錄

來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現蛋白質的基因載體。(Oehrl et al., 2013)

pMT-SM-myc-M3/6 WT

來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現人類之野生型 DUSP8 (又稱為 M3/6)基因的基因載體。(Oehrl et al., 2013)

pMT-SM-myc-M3/6 CS

來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現人類之催化區域突變型之 DUSP8(又稱為 M3/6)基因的基因載體。

其 DUSP8 催化區域第 246 位點由 cysteine 突變為 serine。(Oehrl et al., 2013) pEGFP-C1

以 CMV 啟 動 子 表 現 綠 色 螢 光 蛋 白 質 (GFP) 之 表 現 質 體 ， 具 有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(Promega)

pGL3-basic

帶有表現 Luciferase 之報導基因載體，但不具啟動子，且帶有 ampicillin 抗藥基 因。

pGL3-DUSP8 (-820/+20)

將人類 DUSP8 基因啟動子(-820/+20)，嵌入 pGL3 之質體。

pGL3-DUSP8 (-645/+20)

設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-646 序 列。

pGL3-DUSP8 (-500/+20)

設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-501 序 列。

pGL3-DUSP8 (-280/+20)

設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-281 序列 (附錄八)。

pGL2-DUSP6 (-2018/+133)

將人類 DUSP6 基因啟動子(-2018/+133)，嵌入帶有 Luciferase 基因及 ampicillin 抗藥基因，但不具啟動子之 pGL2-Basic 載體。此質體由美國西北大學 Jonathan D.

Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。

pGL2-DUSP6 (-1003/+133)

設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-1004 序列去除。

pGL2-DUSP6 (-546/+133)

設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-547 序列去除。

pGL2-DUSP6 (-300/+133)

設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-301 序列去除。

pLKO.1-shLuciferase

表 現 專一 降 解人 類 luciferase mRNA 之 shRNA 慢 病 毒質 體，目 標 序列 為 5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCT。此質體購自中研院 RNAi core 核心設施。

pLKO.1-shLMP1

表現專一降解 LMP1 mRNA 之 shRNA 慢病毒質體，目標序列為 LMP1 mRNA 第 459 至 476 之 DNA 序列 5’-GCTCTTATTGCTCTCTAT。此質體由本實驗室蔡淑 君學姊構築。

1.6 勝任細胞 (Competent cell)

附著性細胞如 HEK293T 細胞以含有 10% FBS、1 mM L-glutamine、100 U/ml penicillin 與 100 g/ml streptomycin 之 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。懸浮細胞如 B 細胞以含有 10% FBS、

1 mM L-glutamine、100 U/ml penicillin 與 100 g/ml streptomycin 之 Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。

細胞保存以細胞計數器計數細胞後，取 1×10⁷細胞以 1 ml 含有 10% DMSO 之 FBS 回溶，取至細胞冷凍管內置於 4℃、5 分鐘後，移置於-20℃、20 分鐘，

最後儲存於-80℃或液態氮中保存。

2.2 質體構築 (Plasmid construct)

目標載體以適當限制酶在特定的溫度條件下切割，加入 CIP 於 37℃作用 1 小時後，利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行純化，儲存於-20℃。

設計含有適當限制酶切位之引子，製備目標基因片段。利用 KAPA HiFi DNA polymerase 或 Phusion^TM Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 進行 PCR 反應，

放大目標基因片段，接著利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行純化，

以適當限制酶在特定的溫度條件下切割，利用 Gel/PCR DNA fragments extraction