國立台灣大學醫學院微生物學所微生物及免疫學組 碩士論文
Graduate Institute of Microbiology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
雙特異性去磷酸酶 6 及 8 於 EB 病毒感染之調控 與生物功能
Regulation and Biological Functions of
DUSP6 and DUSP8 in Epstein-Barr viral infection 林佩頤
Pei-Yi Lin
指導教授：蔡錦華 博士 Advisor: Ching- Hwa Tsai, PhD
中華民國 103 年 7 月
July, 2014
致謝
密集且繁忙的碩士班兩年研究生涯終於畫下了完美的句點。這段期間，學習 到很多，也很辛苦，一早到實驗室，就進入無限實驗循環中，直到晚上才得以暫 時結束。許多挫折與失敗，重複嘗試新條件，漸漸累積實驗經驗，終於完成一張 可能可以用的結果！慢慢的集結成冊，提進度報告，上台述說研究成果，接受口 委老師建議與指教下摸索出實驗方向，繼續前進。
謝謝這兩年來，EBV 實驗室的蔡老師、素真老師、李明學老師的指導與建議 以及學長姐、實驗同伴和學弟妹的協助，度過紮實辛苦卻又歡樂有趣的研究生活。
君翰學長的一步步帶領，從無到有的教導每一項實驗技巧及報告要領，及分享生 活小確幸。雅菁學姊每日帶著溫柔笑容，治癒心靈。雅琪學姊不斷提醒實驗上不 可忽略的關鍵，否則會萬劫不復。奐勻學姊能夠讓我以正向的態度面對每一天的 挑戰與每周進度的壓力，以及尋找美食吃大餐和實驗室出遊騎腳踏車平安回家。
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摘要
EB 病毒(Epstein-Barr virus)屬於疱疹病毒家族的一員，是第一個由 WHO 組 織認證為與腫瘤高度相關的 DNA 病毒。在體外實驗，具有能夠將 B 細胞不朽化 (Immortalize)，使其成為不斷增生的淋巴母芽細胞株(Lymphoblastic cell line, LCLs)。文獻指出 EB 病毒與許多人類惡性腫瘤有高度相關，如巴氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)、霍金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、移植後淋巴增生疾病 (Post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD) 、 鼻 咽 癌 (nasopharyngeal carcinoma, NPC)等。
EB 病毒為了長期存活於宿主細胞內，會抑制細胞凋亡因子，並且持續性活 化利於生長之訊息傳遞路徑，例如 NF-B、ERK、JNK、p38、Akt。最重要地，
EB 病毒藉由調控宿主免疫反應，使得 EB 病毒得以逃避免疫攻擊，穩定存活於 細胞內。本實驗室先前利用 cDNA 微陣列實驗，分析 CD19+初級 B 細胞(primary B cells)及 LCLs，探查兩者細胞內基因表現之變化情形。發現 EB 病毒感染 B 細 胞後，影響 B 細胞內多種雙特異性磷酸酶(Dual specificity phosphatase, DUSPs) 之基因表現，如 DUSP1、DUSP2、DUSP6、DUSP8。DUSP 於細胞內主要使特 定目標之 MAPK 去磷酸化，使 MAPK 活性降低，扮演負向調控角色。其中，DUSP6 及 DUSP8 分別可調控 ERK 或 JNK/p38 之磷酸化程度。因此，我們想了解 MAPK 之表現與調控對 EB 病毒在不朽化 B 細胞之過程有何影響。根據 DUSPs 對於下 游目標 MAPK 專一性，我們選擇其中 13 種 DUSPs，利用 RT-PCR 分析 CD19+ 初級 B 細胞及相配對之 LCLs 細胞，發現當 B 細胞受到 EB 病毒感染時 DUSP1、
DUSP2、DUSP6、DUSP8 表現量明顯受到抑制。同樣地利用西方墨點法也觀察 到 DUSP6 及 DUSP8 蛋白質表現量下降。進一步確認上述現象，以四個來源之 初級 B 細胞及相對應 LCLs 觀察到 DUSP6 及 DUSP8 蛋白質表現量有相同趨勢。
下一步，我們欲探查 EB 病毒透過何種病毒基因抑制 DUSP6 及 DUSP8 基因表現。
由慢病毒感染細胞株 Akata 及 BJAB 之實驗中，發現 EB 病毒潛伏期膜蛋白 LMP1
具有抑制 DUSP6 及 DUSP8 之能力。進而以 shRNA 方法證明 LMP1 的確參與 EB 病毒抑制 DUSP6 及 DUSP8 之過程。並且，LMP1 可能藉由其 C 端活化區域 CTAR1 或 CTAR2 活化 ERK 訊息傳遞路徑，抑制 DUSP6 及 DUSP8 之表現。於細胞內 訊息傳遞方面，LMP1 可能藉由 ERK 同時抑制兩者 DUSP 之表現。此外，EB 病 毒活化 Elk-1 轉錄因子而使 DUSP6 表現量下降，但不影響 DUSP8 之表現量。利 用螢光酵素報導基因分析顯示，LMP1 可透過抑制 DUSP6 及 DUSP8 之啟動子藉 以影響其基因表現，但可能透過不同之轉錄因子調控。
進一步，欲瞭解 DUSP6 及 DUSP8 在 EB 病毒感染宿主細胞中所扮演之生物 角色及生理功能。發現 LCLs 以慢病毒方式轉導入 DUSP6 質體，使 LCLs 聚球 型態變小，並且 LCLs 細胞數目也隨表現 DUSP6 而下降。進一步，欲探查表現 DUSP6 之 LCLs 命運為何，利用流式細胞儀分析細胞週期，發現大量表現 DUSP6 之 LCLs 細胞週期 subG1 百分比明顯增加。此外，也探查 p-ERK、ERK、caspase 及 PARP 表現量，於西方墨點法結果發現，ERK 磷酸化程度降低，而 caspase3 及 PARP 有受到活化情形。以上結果顯示於 LCLs 表現 DUSP6 促使細胞凋亡。
並且，當 DUSP6 催化區域突變，則無法導致上述現象。 另一方面，DUSP8 大 量表現於 LCLs 中同樣造成 LCLs 聚球變小，細胞週期停留於 subG1 比率增加。
然而，DUSP8 促使細胞凋亡機制與 DUSP6 不同。當大量表現 DUSP8 於 LCLs，
p38 磷酸化程度下降，卻不活化 caspase3，而活化 Bcl-2 及 PUMA。然而，DUSP8 催化區域突變型對於細胞增生之影響仍尚未有進一步結果。
總結以上，EB 病毒不朽化初級 B 細胞過程中，透過 LMP1 抑制 DUSP6 及 DUSP8 表現，因而防止細胞凋亡。
關鍵字：EB 病毒、MAPKs、雙特異性磷酸酶、LMP1。
Abstract
Epstein-Barr virus (EBV) belongs to human Herpesviridae family. This virus is first virus defined by WHO as a human oncogenic virus. In vitro, EBV can
immortalize primary B cells into lymphoblastoid cell lines (LCLs). Many studies evidence that EBV is associated with many human malignancies, such as Burkitt’s lymphoma, Hodgkin’s lymphoma, Post-transplant lymphoproliferative disorder, nasopharyngeal carcinoma etc and so on.
In order to persistent in host cells, EBV activate downstream signaling transduction pathway, such as NF-B, ERK, JNK, p38, Akt, to induce host cell constitutive proliferation, and to prevent host cell from program cell death. Most importantly, EBV manipulates the host immune response so that it can escape the immune surveillance and persist in host cells. Previously, we utilized cDNA microarray to compare the whole panel of cellular gene expression between CD19+ primary B cells and LCLs which immortalized with B95.8 strain EBV. Preliminarily, we found that EBV influences the gene expression of many kinds of dual specificity phosphatase (DUSP), such as DUSP1, DUSP2, DUSP6 and DUSP8. One of the major functions for DUSP is to negatively regulate MAPK activities by dephosphorylaion of MAPK and inactivate their kinase activities. So, we wonder the expression and regulation of MAPK during the EBV immortalization process. According to their substract specificity, we selected 13 DUSPs to test their kinetic mRNA expression by RT-PCR. Among them, we saw the DUSP1, 2, 6, and 8 are obviously down-regulated when primary B cells become LCLs. Among them, we chose the DUSP6 and 8 as our study targets. In further Western blotting assay, the protein expression of both DUSP6 and 8 are also decreased. To further confirm these phenomena, four pairs of primary B cells and LCLs are detected for their protein expression of DUSP6 and 8. Next, we would like to know which viral gene is involved in these down-regulation effects.
According to the results of lentiviral infection, the EBV latent membrane protein 1(LMP1) is responsible for this down-regulation. These results were both seen in Akata and BJAB cell lines. Furthermore, we show that LMP1 is necessary for DUSP 6 and 8 downregulation by shRNA approach. C-terminal activation domain (CTAR)1 and CTAR2 of LMP1 were required for this downregulation. In signaling, LMP1-mediated ERK pathway was involved in both DUSP-downregulation. In addition, ERK-downstream Elk1 was required for DUSP6 but not DUSP8 down-regulation. Based on the results of luciferase reporter assay, we demonstrated that LMP1 downregualtes DUSP6 and DUSP8 through inhibiting their promoter activity, but probably with different transcriptional factors.
Of note, we desired to address the influence of this down-regulation. LCL clumping morphology was shrinking upon the DUSP 6-expressive lentivirus were transducted into LCLs. Consistently, the cell number were decreased during lentivirus infection. To clarify the question what is fate of DUSP6-overexpressive LCLs, we checked the cell cycle by flowcytometry. The sub-G1 population was obviously increased after over-expression. Meanwhile, we examined the expression of p-ERK, ERK, caspase and PARP. Obviously, Western-blotting data indicated that the amounts of p-ERK are decreased, while cleaved caspase 3 and cleaved PARP are increased. All the results hinted that over-expression DUSP 6 can cause cell apoptosis.
Of note, the kinase mutated DUSP 6 would not trigger the above phenomena. In the case of DUSP8, the LCL clumping was also shrinking and the sub-G1 population was also increased. However, their apoptotic mechanism is different form over-expression DUSP6. During over-expression of DUSP8, p38 was decreased but caspase 3 kept the same. On the other hand, cleaved Bcl-2 and PUMA were increased. However, the kinase dead DUSP 8 did not cause any change for cell proliferation.
So, we conclude that DUSP6 and DUSP8 are downregulated during EBV
immortalization since LMP1 should prevent their effect from apoptosis.
Key words: Epstein-Barr virus, MAPKs, Dual specificity phosphatase (DUSPs), LMP1.
目錄
摘要 ... I Abstract ... III
序論... 1
研究目的... 12
材料與方法... 13
結果... 34
討論 ... 43
圖... 49
表... 81
附錄... 85
參考文獻... 93
序論
1. EB 病毒(Epstein-Barr virus)
EB 病毒最初於 1964 年由 Epstein、Achong，以及 Barr 經由電子顯微鏡觀察 巴氏淋巴瘤細胞株而發現(Epstein et al., 1964)。EB 病毒屬於人類皰疹病毒第四型，
為疱疹病毒家族之一。EB 病毒具有套膜，為雙股 DNA 病毒，是第一個被認為 與腫瘤生成高度相關的 DNA 病毒。EB 病毒主要可感染 B 細胞以及上皮細胞 (Sixbey et al., 1983)。EB 病毒藉由套膜上糖蛋白 gp350 結合上 B 細胞之細胞膜表 面上受器 CD21，又稱 C3d 補體受器及利用 gp42 結合上第二型 MHC 分子作為共 同受器而感染 B 細胞(Borza and Hutt-Fletcher, 2002; Nemerow et al., 1987)。並且 具有將人類初級 B 細胞不朽化成為淋巴母芽球細胞株(Lymphoblastoid cell line, LCLs)的能力(Pope et al., 1968)。在全世界人口中，百分之九十以上的人口受到 EB 病毒感染並且長期生存在體內(Macsween and Crawford, 2003; Yao et al., 1985)。
當青少年初次感染 EB 病毒時，會引起個體限制(self-limited)且短暫的症狀，稱為 傳染性單核球增多症(Infectious mononucleosis disease)，而後在體內長期潛伏 (Schuster and Kreth, 1992)。除此之外，EB 病毒也與霍金氏症(Hodgkin’s lymphoma)、
巴氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)以及鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)等等疾病 有高度相關(Epstein et al., 1964; Johansson et al., 1970; Jones et al., 1988; Pallesen et al., 1991; zur Hausen et al., 1970)。在免疫力低下的病人體內，例如 AIDS 病人 或服用免疫抑制劑之病人，EB 病毒與引起移植後淋巴增生疾病(Post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD)以及口腔毛狀白斑病(oral hairy leukoplakia)有 關(Greenspan et al., 1985; Ziegler et al., 1982)。
2. EB 病毒生活史(潛伏期/溶裂期)
EB 病毒傳染途徑主要經由唾液傳染，並潛藏於唾液中，感染咽喉部，為初 次感染區域(Yao et al., 1985)，進行複製並傳播，引發傳染性單核球增多症，出 現發燒、淋巴結腫大、倦怠等急性感染症狀，此種傳染途徑常發生在青少年透
過親吻行為藉由唾液傳染，因此又稱為親吻病(Kissing disease)(Ebell, 2004)。EB 病毒主要感染處於靜息狀態且成熟 B 細胞(resting B cells)，藉由感染 B 細胞躲藏 於咽喉部，並隨著 B 細胞循環於全身血流(Babcock et al., 1998)。EB 病毒感染 B 細胞後，線性雙股 DNA 轉為環狀雙股 DNA，上體(episome)型式潛伏於細胞中，
並且維持潛伏時期存於細胞中(Yates et al., 1985)。EB 病毒可藉由表現不同病毒 蛋白分為潛伏期(latency phase) 與溶裂期(Lytic phase)。在體外，EB 病毒感染靜 息 B 細胞，此時 EB 病毒處於潛伏期第三型，表現六種核蛋白 EBNA-1、EBNA-2、
EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、三種膜蛋白 LMP1、LMP2A、
LMP2B、微小 RNA 包含 EBER1、EBER2，主要促使靜息 B 細胞活化，持續分 裂生長並且防止細胞凋亡，使 EB 病毒得以長期生存於細胞內(Joseph et al., 2000)。
然而，當 EB 病毒受到外界刺激下，例如：壓力、Sodium butarate、TPA、免疫 球蛋白交叉結合，活化 PKC 訊息路徑，活化 EB 病毒即刻早期溶裂基因 BZLF1 及 BRLF1 啟動子，啟動 EB 病毒基因組上 oriLyt(Hammerschmidt and Sugden, 1988)，可促使 EB 病毒進入溶裂時期。BZLF1 及 BRLF1 基因可轉錄出活化宿 主或病毒上特定啟動子之反式激活子(transactivator)Zta 及 Rta(Countryman and Miller, 1985; Hardwick et al., 1988)，導致一系列病毒基因表現。病毒早期基因 (early gene)表現參與進行 EB 病毒 DNA 基因組複製與代謝，此時 EB 病毒 DNA 可被放大百倍以上(Hammerschmidt and Sugden, 1988)。病毒晚期基因(late gene) 表現與病毒顆粒結構蛋白質有關。最終將 EB 病毒 DNA 基因體包裹入病毒顆粒 中釋出於宿主細胞外，完成一次生命週期。
3. LMP1
EB 病毒體外感染 B 細胞使不朽化為 LCL，而 EB 病毒在 LCL 細胞中維持潛 伏期，並表現九種病毒蛋白質，其中包含有潛伏期膜蛋白 LMP1。EB 病毒 BNLF1 基因之產物。於 1984 年 Kieff 博士認為 EB 病毒最主要的致癌基因(Hennessy et al., 1984)。對於促進細胞生長、逃避細胞凋亡及 EB 病毒不朽化 B 細胞過程扮演重 要角色。LMP1 約有 386 胺基酸，大小約 63kDa。其結構分為三大部分；(一)細
胞內 N 端，約 23 胺基酸，使 LMP1 具有特定方向性表現在細胞膜上；(二)六段 穿膜結構，約 163 胺基酸。LMP1 可藉由此區域聚集為多元體，形成脂質豐富區 域(lipid raft)強化對下游之訊息傳遞；(三)細胞內 C 端，約 195 胺基酸。此區域為 LMP1 最主要向下游進行訊息傳遞之區域(Eliopoulos and Young, 2001)。LMP1 之 C 端主要分為三區域，C 端活化區域(C terminal activation regions)：CTAR1、CTAR2、
以及 CTAR3。CTAR1(胺基酸 194-231)主要參與啟使細胞生長；CTAR2(胺基酸 351-386)對於淋巴母芽細胞株(LCL)維持持續且永久生長是重要的；CTAR3(胺基 酸 232-350)位於 CTAR1 及 CTAR2 區域之間，目前已知可活化 JAK/STAT3 訊息 傳遞路徑(Fennewald, van Santen, & Kieff, 1984; Liebowitz, Wang, & Kieff, 1986)。
LMP1 結 構 相 似 於 持 續 活 化 之 腫 瘤 壞 死 因 子 受 體 (tumor necrosis factor receptor)CD40，不需依賴細胞外配體(ligand)刺激，可自體聚集成多元體而活化 (Gires et al., 1997; Mosialos et al., 1995)。LMP1 主要活化訊息傳遞路徑包含有 ERK、p38、JNK 等 MAPK 家族訊息傳遞因子，以及 Akt、NFB、JAK/STAT3 等訊息傳遞因子。(圖一)
4. 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)
MAPK 為細胞內廣泛存在之蛋白激酶家族之一，其功能及調控下游目標蛋 白乃藉由磷酸化目標蛋白之絲胺酸或蘇胺酸(serine/threonine)，調節目標蛋白活性 藉以影響下游訊息傳遞調控細胞活性，包含調控細胞基因表現、細胞分裂、移動、
代謝以及細胞凋亡等等(Avruch, 2007; Boutros et al., 2008)。當細胞受到外來刺激，
包含生長因子、胰島素、或是壓力，活化 MAPK 訊息傳遞路徑，MAPK 傳遞路 徑為三級聯鎖訊息傳遞(Avruch, 2007)。活化細胞內 MAPKKK，而後活化一連貫 信號級連放大(signaling cascade)，磷酸化 MAPKK，進而磷酸化 MAPK 高度保守 之 threonine-X-tyrosine 殘基(X 為任意胺基酸)，藉此活化下游目標蛋白(Ahn et al., 1991; Payne et al., 1991; Robbins et al., 1993)。在不同細胞種類中，MAPK 家族依 胺基酸序列相似性、受質特異性、與其參與之調控路徑可區分為三種廣為所知其 功 能 及 細 胞 角 色 之 成 員 ： 包 含 有 細 胞 外 訊 息 調 控 激 酶 (extracellular
signal-regulated kinase, ERK)、壓力活化蛋白激酶 (stress-activated protein kinases, SAPKs)家族中之 c-Jun amino-terminal kinase (JNK)以及 p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) (Kultz, 1998)。然而近期研究，利用人類胎兒腦部基因 庫(human fetal brain cDNA library)做基因序列分析，發現第四種 MAPK，命名為 ERK5，在細胞中扮演之生物角色及功能尚未明朗(Zhou et al., 1995)。此外，近期 利用生物化學或是經由人類或小鼠基因組序列分析(genome sequence)發現 ERK7 是目前可能成為 MAPK 分類中之候選成員(Johnson and Lapadat, 2002)。
4.1 細胞外訊息調控激酶
包含有 ERK1 以及 ERK2，其廣泛存在於細胞中，參與調控細胞有絲分裂 (meiosis)或無絲分裂(mitosis)以及分化中細胞之無絲分裂後生物功能(postmitotic functions)(Payne et al., 1991; Robbins et al., 1993)。細胞受到外界刺激，例如生長 因子、細胞激素、病毒感染，以及致癌因子等等，而活化 MAKKK、Raf 或 Ras，
進而活化 ERK1 及 ERK2 訊息傳遞路徑(Kolch, 2000)。已知許多人類腫瘤中因 Ras 獲得性突變(gain of function)可永久性活化 ERK1 及 ERK2，而增加腫瘤細胞生長 速率(Fernandez-Medarde and Santos, 2011)。因此目前許多進入臨床試驗之抗癌藥 物乃藉由抑制 ERK 路徑以抑制腫瘤生長。 (Johnson and Lapadat, 2002)
4.2 壓力活化蛋白激酶
包含有 JNK1、JNK2、JNK3。JNK 可藉由約十三種 MAPKKK 調控其傳遞 路徑，活化之 JNKs 進而磷酸化 DNA 轉錄因子 c-Jun，使 c-Jun 活性增加進入細 胞核中，c-Jun 為轉錄複合體 AP-1 成員之一，AP-1 對於調控基因表現扮演重要 角色(Weston and Davis, 2002)。細胞受到外界環境生存壓力，例如放射線、生長 因子，而活化 AP-1，AP-1 結合上 DNA 特定結合區域後調節許多細胞激素之基 因轉錄(Nishina et al., 2004)。JNK 也與細胞計畫性死亡或細胞凋亡調控相關 (Tournier et al., 2000)。此外，亦有文獻指出 JNK 促進腫瘤生長，因此認為 JNK 可成為癌症治療之分子標靶之一。在小鼠模式中，JNK 抑制劑可用於治療類風濕 性關節炎，因此 JNK 抑制劑已進入臨床試驗中治療相關疾病( Z.Han et al. ,
2001)。
4.3 p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)
成員有 p38、p38、p38、p38，分子量為 38kDa，其生物功能及角色研 究較為清楚(Zarubin and Han, 2005)。p38可表現於大部分組織中，可調節細胞反 應以因應滲透壓改變造成之環境壓力。而其他 p38 亞型較具組織專一性，例如：
p38表現於腦部，p38表現於骨骼肌，p38則表現於內分泌腺體(Cuadrado and Nebreda, 2010)。p38 調控許多細胞激素表現，於免疫細胞中受到發炎細胞激素，
例如 interleukin-1，刺激可活化 p38 訊息路徑(Freshney et al., 1994)，因此 p38 對 於 活 化 免 疫 反 應 扮 演 重 要 角 色 ， 例 如 格 蘭 氏 陰 性 菌 之 脂 質 多 醣 體 (lipopolysaccharides, LPS)可快速活化 p38 並使 p38 之酪胺酸殘基磷酸化，而活化 下游反應(Zarubin and Han, 2005)。此外，p38 也受到其他刺激，例如賀爾蒙、G 蛋白複合受器之配體(ligands of G protein-coupled receptor)、環境壓力而活化 (Cuadrado and Nebreda, 2010)。由於 p38 參與調節發炎細胞激素表現，p38 被發 現與氣喘及其他人類自體免疫疾病相關(J.C.Lee et al., 1994).。
5. MAPKs 之於癌症
在廣泛之人類惡性疾病、癌症中存在著異常之 MAPK 訊息傳遞路徑(Dhillon et al., 2007)。典型之 ERK 訊息傳遞路徑與癌細胞能不斷生長，不受正常細胞之 生長訊號控制，在近乎 30%人類腫瘤中，皆發現不正常之 ERK 大量活化。包含 ERK 上游傳遞路徑中成員異常，例如酪胺酸激酶受器(receptor tyrosine kinase)大 量表現或 Ras GTPase 之活化型突變(activating mutations)以及 MAPK 激酶激酶 B-raf 之絲胺酸/蘇胺酸(serine/threonine)之突變(Dhillon et al., 2007)。而壓力活化 MAPK，如 JNK，對於癌症中扮演角色比較複雜。有研究顯示，體外培養中，
Ras 誘導轉型之小鼠纖維母細胞(fibroblast derived from mice)發現 JNK 參與在腫 瘤之形成，認為 JNK 扮演致癌角色(Kennedy and Davis, 2003)。然而，也有文獻 指出 JNK 可能扮演相反的角色，在活體內實驗中，將 Ras 誘導轉型之小鼠纖維 母細胞，剔除 JNK1 及 JNK2 後移植入裸鼠中，並不能防止腫瘤之產生。並且，
在體內實驗中，剔除 JNK 時會促使肺臟腫瘤細胞之轉移，因此認為在體內試驗 中，JNK 可能扮演腫瘤抑制角色(Kennedy et al., 2003)。
6. MAPK 訊息路徑之調控
當細胞受到外界環境影響而活化細胞內 MAPK 訊息傳遞路徑，訊息不斷放 大，促使細胞有利於生存與生長之同時，細胞為了不過度活化與生長，存在負向 調控 MAPK 機制。已知活化 MAPK 需透過同時磷酸化 MAPK 活化位(activation lip) 之 threonine 以及 tyrosine 兩種胺基酸(Bellon et al., 1999; Canagarajah et al., 1997)，
因此若移除其中之一或同時移除兩處之磷酸根即可使 MAPK 活性下降。細胞中 存在有各式磷酸酶(phosphatase)可移除 MAPK 之磷酸根，使 MAPK 失去活性，
依據其專一性可分為酪胺酸磷酸酶(tyrosine phosphase)、絲氨酸/蘇胺酸磷酸酶 (serine/threonine phosphatase)以及雙特異性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase, DUSP)。其中，又以 DUSP 中存在一群對 MAPK 具專一性，稱為 MAP kinase phosphatase (MKPs)最為重要，可在適當之時間及位置使 MAPK 去磷酸化(Pearson et al., 2001)。
7. 雙特異性磷酸酶
DUSP 可同時調節兩種磷酸化胺基酸殘基，可能因為其酵素活性位較淺且具 有彈性，因此可容納不同種之磷酸化胺基酸，並將之去磷酸化(Farooq and Zhou, 2004)。包含有磷酸化酪胺酸(phosphotyrosine)以及磷酸化絲氨酸或磷酸化蘇胺酸 (phosphoserine/threonine)去磷酸化(Guan et al., 1991)。
7.1 DUSP 之結構與分類
結構上，所有 DUSP 家族成員皆具有一相同磷酸酶活性區域(phosphatase domain)，內含有高度保守之催化區域(catalytic site)，由天冬胺酸(aspartic acid)、
半胱胺酸(cysteine)以及精氨酸(arginine)所組成。DUSPs 之 N 端具有兩個 CDC25 同源區域(CDC25 homology region)，兩者之間含有一群鹼性胺基酸形成之 MAPK 結合區域，稱為 MAP kinase-binding motif (MKB)或 kinase-interacting motif(KIM)。
MKB/KIM 可與特定目標 MAPK 之 common domain 結合，在以酵素活性位使目
標 MAPK 去磷酸化(Farooq and Zhou, 2004)。目前於人類基因體組織資料庫 (Human Genome Organization database)中有 25 個基因被定義為 DUSPs 成員，命 名為 DUSP1-28，其中 DUSP17、DUSP20、DUSP23 分別與 DUSP19、DUSP18、
DUSP23 重 複 命 名 (Huang and Tan, 2012) 。 在 25 種 DUSPs 成 員 中 ， MS-STYX/DUSP24 以及 DUSP27 之酵素催化活性區域缺乏 cysteine，轉而以 serine 取 代 ， 因 此 不 具 有 磷 酸 酶 之 酵 素 活 性 ， 又 稱 為 假 性 磷 酸 酶 (pseudo-phosphatase)(Wishart and Dixon, 1998) 。 DUSP 依據其 結 構是 否 含有 MKB/KIM 區域，可區分為：典型 DUSPs 與非典型 DUSPs。典型 DUSP(typical DUSPs)或 MAPK 磷酸酶 (MAP kinase phosphatase, MKPs)皆包含有 MKB/KIM。
反之，DUSPs 缺乏 MKB/KIM 者稱為非典型 DUSP(atypical DUSPs)(Lang et al., 2006)
7.1.1 典型 DUSPs (typical DUSPs)
依據其主要之細胞位置可分為三大類：細胞核、或細胞質以及可同時位於細 胞質與細胞核(Huang and Tan, 2012)。位於細胞核之 DUSPs 包含有 DUSP1、
DUSP2、DUSP4、DUSP5；位於細胞質之 DUSPs 包含有 DUSP6、DUSP7、DUSP9；
位於細胞核及細胞質之 DUSPs 包含有 DUSP8、DUSP10、DUSP16 圖三)(Huang and Tan, 2012)
7.1.2 非典型 DUSPs (Atypical DUSPs, A-DUSPs)
部分 DUSPs 與對 MAPK 專一性之 DUSPs 有相同特性，但與 VH1 磷酸酶 (vaccinia virus open reading frame H1 phsphatase)更為相似，因此認為此類 DUSPs 不同於典型蛋白酪胺酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase)以及亦不同於 MKPs，
而被認為是非典型 DUSPs(Liu et al., 1995)。其成員包含有 19 種 DUSPs，例如：
DUSP3、DUSP14、DUSP19、DUSP22。大部分之非典型 DUSPs 不具有 N 端之 Cdc 同源區域，但具有 C 端之 DUSP 酵素催化區域。然而此類 DUSPs 之特性及 專一性目標仍需進一步研究(Patterson et al., 2009)。
7.2 DUSP 之調控與功能
DUSPs 基 因 轉 錄 可 受 到 MAPK 下 游 調 控 之 轉 錄 因 子 所 活 化 ， 例 如 AP-1(Brondello et al., 1997) 。 DUSP 也 可 受 到 其 他 轉 錄 因 子 調 控 ， 例 如 DUSP1(MKP1)啟動子具有 Sp1、Sp3、CREB、USF1 等轉錄因子之結合位(Ryser et al., 2004)；細胞受到 FGF 刺激後活化 ETS-1 而誘導 DUSP6 基因表現(Zhang et al., 2010)；以及研究顯示，p53 可調控四種位於細胞核之 DUSPs，包含有 DUSP1、
DUSP2、DUSP4、DUSP5(Li et al., 2003; Shen et al., 2006; Ueda et al., 2003; Yin et al., 2003) 。 此 外 ， 活 化 DUSPs 基 因 轉 錄 也 可 受 到 附 基 因 修 飾 (epigenetic modifications)調控， 例如於胰臟 癌細胞中 ， DUSP6 啟動子受到 高度甲基化 (Furukawa et al., 2003)。而 DUSP mRNA 主要以 micro RNA 調控之基因靜默(gene silencing)機制相關，例如 DUSP1 可受到 miRNA-101 調控(Zhu et al., 2010)。在細 胞 中 DUSP 蛋 白 質 表 現 程 度 也 受 到 轉 譯 後 之 調 節 機 制 (post-translationally regulation)嚴格監控。例如：DUSP6 可受到 mTOR 訊息傳遞路徑而磷酸化，進而 透過泛素蛋白機制(ubiquitination)降解 DUSP6 蛋白質(Bermudez et al., 2008)。所 以許多 DUSPs 種類半衰期大約只有一小時(Huang and Tan, 2012)。細胞內調控 DUSP 機制多樣且複雜暗示著 DUSP 對於許多細胞生理功能之調控扮演重要角色。
DUSP 能夠因應不同的刺激或因誘導而活化特定之 DUSP 調控路徑，可能因不同 組織、分化狀態或細胞活化狀態而表現不同 DUSPs 種類，可分為三類：
7.2.1 誘發型細胞核之 DUSPs (inducible nuclear DUSPs)
顧名思義此類 DUSPs 可受到 MAPK 之活化而誘導表現。成員有 DUSP1、
DUSP2、DUSP4、DUSP5。這些 DUSPs 之基因密碼子中含有高度保守之四個外 顯子(exons)及四個內含子(introns)(Kwak et al., 1994; Noguchi et al., 1993; Yi et al., 1995; Zhang et al., 2001)。誘導型細胞核 DUSPs 對於 ERKs、JNK、p38 去磷酸化 之能力不分軒輊(Bermudez et al., 2010)。特別的是，DUSP1 可受到血管內皮生長 因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)之誘導而活化，使組蛋白次單位 H3(histone H3)去磷酸化(Kinney et al., 2009)。
7.2.2 對 ERK 專一性且位於細胞質 DUSPs ( Cytoplasmic ERK-specific DUSPs) 包含有 DUSP6、DUSP7、DUSP9、DUSP10，對於 ERK1/2 具有高度專一性，
然而對 ERK5 不具有去磷酸化之能力(Arkell et al., 2008)。其中，DUSP6 可在細 胞核與細胞質之間穿梭(shuttle)，但主要位於細胞質中，因其 N 端具有豐富白胺 酸之出核訊號(leucine-rich nuclear export signal)(Karlsson et al., 2004)。因此 DUSP6 被認為像是不活化態之 ERK 船錨(anchor)，使之停留於細胞質中(Brunet et al., 1999)，甚至 DUSP6 可能參與將細胞核中不活化態 ERK 運輸至細胞質中之過 程(Karlsson et al., 2004)。
7.2.3 對 JNK 與 p38 專一性之 DUSPs
成員包含有 DUSP8、DUSP10、DUSP16。可同時位於細胞質與細胞核，並 對於 JNK 及 p38 具有專一性。(Bermudez et al., 2010)
8. DUSP6
DUSP6，又稱為 MKP3，由 381 個胺基酸所組成，屬於 ERK 特異性 MKPs，
可表現於細胞質中，主要針對 ERK MAPK 進行去磷酸化作用(Arkell et al., 2008)。
DUSP6 主要表現於靜息且未受刺激之細胞中。DUSP6 之基因結構具有保守之催 化區域，含有半胱胺酸活化位點於 Cys296 之位置(Farooq and Zhou, 2004)。其中，
連結區域(linker region)含有出核訊號(Karlsson et al., 2004)。目前認為 DUSP6 具 有抑制腫瘤之角色於胰臟癌及食道上皮細胞癌(Furukawa et al., 2003; Ma et al., 2013)。例如：體外實驗，胰臟腫瘤細胞株中大量表現 DUSP6 使細胞生長速率變 慢，甚至細胞凋亡(Furukawa et al., 2003)。在許多腫瘤細胞中，DUSP6 之啟動子 高度甲基化(hyper-methylation)，如食道扁平上皮細胞癌(Esophagus squamous cell carcinoma, ESCC)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)(Ma et al., 2013)。其中，
因 DUSP6 表現量下降，使得 ERK 活性增加，並且伴隨著 Ras 獲得性突變(gain of function)，而加速腫瘤細胞之癌化(Furukawa et al., 2003)。若將 DUSP6 大量表現 在 ESCC 或 NPC 細胞株中，能夠抑制腫瘤細胞之轉移及上皮至間質轉型 (Epithelial-Mesenchymal transition)之過程(Wong et al., 2012)。
9. DUSP8
DUSP8，又稱為 hVH-5 (homologue of vaccinia virus H1 gene clone 5)或 M3/6，
由 625 個胺基酸所組成，屬於 JNK/p38 特異性 MKPs，可表現於細胞核內或細胞 質，主要針對壓力活化蛋白激酶包含 JNK 及 p38 MAPK 進行去磷酸化作用。最 早於 1995 年 Martell 等人報導 DUSP8 於 PC12 細胞株中可受到神經生長因子 (nerve growth factor)與胰島素刺激時被大量誘發，為一立即早期基因 (Martell et al., 1995; Theodosiou et al., 1996)。DUSP8 主要表現於大腦、心臟、肺臟及骨骼肌、
骨髓、活化之 B 細胞、記憶性 B 細胞內，而神經系統之表現量最高且分布最廣 泛。DUSP8 之基因結構具有保守之催化區域，含有半胱胺酸活化位點於 Cys246 之位置。其 C 端具有一富含脯胺酸之區域 (proline-rich region)與一段 PEST 區段，
由四種胺基酸脯胺酸 (proline, P)、麩胺酸 (glutamic acid, E)、絲胺酸 (serine, S) 及蘇胺酸 (threonine, T)所組成，被認為與調控 DUSP8 於細胞內之功能、位置及 穩定性相關。此外，DUSP8 之 C 端亦含有出核訊號以及入核訊號(NLS)，以利於 其於核質間移動。DUSP8 雖為第一個被報導可調控 SAPKs 之 MKPs，然而，目 前關於 DUSP8 可能於細胞內扮演之角色仍屬未知。部分研究曾報導 DUSP8 之 催化能力下降於細胞接收特定刺激如氧化壓力、熱休克或化學藥物 arsenite。
(Chen et al., 2001; Palacios et al., 2001)；進一步 Theodosiou 等人實驗發現於砷刺 激之下，JNK 能引起 DUSP8 之磷酸化，以調控 DUSP8 之催化能力，提升 JNK 之活性與壓力反應的活化 (Cotsiki et al., 2012)；而化學藥物 anisomycin 之刺激，
則能促進 DUSP8 泛素化，進而抑制細胞內 DUSP8 之表現 (Theodosiou and Ashworth, 2002)。以上研究皆顯示當細胞受到特定刺激時，可能藉由某些分子影 響 DUSP8 之表現，調控 JNK 之活性，以達成壓力反應的活化；且另一方面，JNK 也具有透過轉譯後修飾影響 DUSP8 催化能力之功能，然詳細的調控機制仍待更 多研究釐清。
10. EB 病毒與 MAPK
在 LCL 中，MAPK 訊息傳遞路徑呈持續且穩定之活化狀態(Fenton and Sinclair, 1999; Satoh et al., 2002)，為 EB 病毒可透過其病毒蛋白活化 MAPK 訊息 傳遞路徑，藉以促進宿主細胞生長，避免細胞凋亡。EB 病毒潛伏期膜蛋白 LMP1 可透過其 C 端活化區域 CTAR1、CTAR2，透過 TARFs、TRADD 等接頭蛋白質 (adapter protein)活化 MAPKs 訊息傳遞路徑(如圖一 )，例如：ERK、JNK、
p38(Dawson et al., 2008; Eliopoulos et al., 1999; Kieser et al., 1997; Schultheiss et al., 2001)。此外，EB 病毒潛伏期膜蛋白 LMP2A 可透過其 N 端之 ITAM 區域活化 ERK 路徑，進而活化 JNK 訊息傳遞路徑(Anderson and Longnecker, 2008; Chen et al., 2002; Young and Rickinson, 2004)。而 EB 病毒溶裂期之基因產物 Zta 也可藉由 活化 p38 及 JNK，影響下游基因表現(Adamson et al., 2000)。在本實驗室研究發 現，EB 病毒溶裂其蛋白 Zta 可透過活化 ERK 路徑，活化下游轉錄因子 Elk-1，
進而調控 Egr-1 啟動子，得以活化 EB 病毒之再活化路徑(Chang et al., 2006)。
研究目的
已知 EB 病毒可透過潛伏期蛋白，例如 LMP1、LMP2A，及溶裂期極早期蛋 白質，例如 Zta，活化 MAPK，影響細胞分裂、生長，抑制細胞凋亡，促使細胞 不斷生長，使 EB 病毒得以長期潛伏在宿主細胞中。並且，EB 病毒使初級 B 細 胞不朽化之 LCL 中，發現 MAPK 呈持續活化狀態。然而，在細胞中，存在一群 雙特異性磷酸酶 DUSPs，可將同一蛋白質上磷酸化酪胺酸(phosphor-tyrosine)或 磷酸化絲胺酸/蘇胺酸(phosphor-serine/phosphor-threonine)同時去磷酸化，得以使 特定目標 MAPK 失去活性，為細胞中負向調控 MAPK 之路徑。
本論文主要利用 EB 病毒 B95.8 strain 感染 CD19+ 初級 B 細胞使不朽化為淋 巴母芽細胞株，以 cDNA 微陣列實驗分析細胞內基因表現之變化情形，發現 LCL 相較於初級 B 細胞而言，DUSP 表現量明顯減少，例如 DUSP1、DUSP2、DUSP6、
DUSP8。因此，本研究欲探討 EB 病毒感染細胞後可能透過何種病毒蛋白，於何 種機制影響 DUSP 之表現，以及 DUSP 對於 EB 病毒感染後細胞中扮演之生物角 色及功能。
材料與方法
1.材料
1.1 細胞株 (Cell line)
Lymphoblastoid cell line (LCL)
為 CD19+ B 細胞以 B95.8 strain EB 病毒感染後不朽化而成之細胞株。
Human embryonic kidney (HEK) 293T cells
人類胚胎腎臟細胞，由第五型腺病毒 (adenovirus type5) E1 抗原及猿猴病毒 (Simian virus 40, SV40) large T 抗原轉形而成之細胞株 (ATCC no. CRL-1573)。
Akata cells
取自日本患者巴氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)建立之細胞株，不具有 EB 病毒基 因體。(Shimizu et al. (1994)
BJAB cells
取自非洲患者巴氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)建立之細胞株，不具有 EB 病毒基 因體。(Menezes et al., 1975)
Ramos cells
取自美國患者巴氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma)建立之細胞株，不具有 EB 病毒基 因體。(Klein et al., 1975)
KMH2 cells
取自德國患者霍金氏淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma)建立之細胞株，不具有 EB 病毒 基因體。
1.2 藥品
藥品名稱 廠牌名稱
2-mercaptoethanol, 2-ME Sigma
2-propanol J.T. Baker
Acetic acid J.T. Baker
Acrylamide Merck
Agar A Bionovas
Agarose Invitrogen
Ammonium persulfate, APS Sigma
Ampicillin Sigma
Bisacrylamide Usb
Bovine serum albumin, BSA Roche
Bromophenol blue Sigma
Chloroform Merck
Coomassie Brilliant blue G-250 Bionovas Diethyl pyrocarbonate, DEPC Sigma Dimethyl sulfoxide, DMSO Merck Dipotassium phosphate (K2HPO4) Merck Disodium phosphate (Na2HPO4) Merck Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM Hyclone
Ethanol Burnett
Ethidium bromide, EtBr Sigma Ethylene diamine tetra-acetic acid, EDTA J.T. Baker
Fast green Sigma
Fat-free skim milk 安佳
Fetal bovine serum, FBS Hyclone
G418 sulfate Merck
Glycerol J.T. Baker
Glycine Bio Basic
Hydrochloric acid (HCl) J.T. Baker
Imidazole Usb Isopropylthio-β-galactoside Protech
Kanamycin Sigma
L-glutamine Sigma
LY294002 Cell signaling
Methanol J.T. Baker
Opti-MEM® Invitrogen
Penicillin:streptomycin solution Gemini
Peptone Usb
RNase A Sigma
Roswell Park Memorial Institute medium, RPMI Hyclone Potassium chloride (KCl) J.T. Baker Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck
Propidium iodide Sigma
Cφmplete Protease inhibitor cocktail tablets Roche
Puromycin Sigma
SB203580 Merck
Sodium acetate (NaOAc) Merck
Sodium azide Sigma
Sodium chloride (NaCl) J.T. Baker
Sodium deoxycholate Sigma
Sodium dodecyl sulfate, SDS Merck
Sodium fluoride (NaF) Merck
Sodium hydroxide (NaOH) J.T. Baker Sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma
SP600125 Sigma N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine, TEMED Sigma
Tris Bio Basic
Triton X-100 Merck
TRIzol® reagent Invitrogen
Trypan blue Sigma
Trypsin Biological Industries
Tween 20 J.T. Baker
U0126 Merck
Xylene cyanol FF BDH
Yeast extract BD
1.3 套組試劑 (Kit)
套組試劑名稱 廠牌名稱
AlamarBlue® AbD Serotec
Bio-Rad protein assay Bio-Rad
Calf intestinal alkaline phosphatase, CIP New England Biolabs Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP Protech
DETACHaBEAD® CD19 Invitrogen
Dithiothreitol, DTT Promega
Dual-Glo® Luciferase Substrate Promega Dynabeads® CD19 Pan B Invitrogen Faststart Universal Master Mix Roche
Ficoll-Paque GE Healthcare
Gel/PCR DNA fragments extraction kit Geneaid High-speed plasmid mini kit Geneaid
Immobilon-P Transfer Membranes, PVDF Millipore
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems Klemow fragment New England Biolabs LipofectamineTM 2000 Invitrogen
M-MLV Reverse transcriptase Promega
Ni-NTA Agarose Qiagen
Non-liposome transfection reagent II, NTR II T-pro PhusionTM Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase Finnzymes QIAGEN Plasmid maxi kit Qiagen ProZyme DNA polymerase Protech
Random primers Bionovas
Rnasin RNase inhibitor Promega
T4 DNA ligase New England Biolabs
Western LightningTM chemiluminescence reagent plus PerkinElmer
1.4 溶液 (Buffer)
0.5% Trypan blue (per 100 ml) Trypan blue 0.5 g, add PBS to 100 ml
10X Phosphate-buffered saline (PBS) (per liter)
KCl 2.0 g, KH2PO4 2.4 g, NaCl 80.0 g, Na2HPO4 14.4 g, adjust to pH 7.4 with NaOH, mix and add ddH2O to 1 liter
PBS-EDTA (per liter)
EDTA 0.2 g, KCl 0.2 g, KH2PO4 0.2 g, NaCl 8.0 g, Na2HPO4 1.15 g, add ddH2O to 1 liter, autoclaved
LB medium (per liter)
NaCl 10.0 g, Peptone 10.0 g, Yeast extract 5.0 g, adjust to pH 7.0 with NaOH, mix
and add ddH2O to 1 liter, autoclaved TB medium (per liter)
Glycerol 4 ml, KH2PO4 2.31 g, K2HPO4 12.54 g, Peptone 12.0 g, Yeast extract 24.0 g, mix and add ddH2O to 1 liter, autoclaved
50X Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (per liter)
Acetic acid 57.1 ml, 0.5M EDTA (pH 8.0) 100 ml, Tris 242.0 g, mix and add ddH2O to 1 liter
6X DNA loading dye (per 100 ml)
Glycerol 30 ml, Xylene cyanol FF 0.25 g, mix and add ddH2O to 100 ml 4X Sample loading buffer (per 100 ml)
Bromophenol blue 0.4 g, Glycerol 40 ml, SDS 8.0 g, 1M Tris (pH 6.8) 20 ml, mix and add ddH2O to 100 ml, store at -20℃ (supplemented with 2-ME 14.3 μl/ml freshly when in use)
DEPC ddH2O (per liter)
DEPC 1.0 g, add ddH2O to 1 liter, autoclaved
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (per liter)
0.5M EDTA (pH 8.0) 4 ml, NaCl 87.0 g, NaF 2.1g, Na3VO4 0.018 g, 10% SDS 10 ml, Sodium deoxycholate 5.0 g, 1M Tris (pH 7.4) 50 ml, mix and add ddH2O to 1 liter (supplemented with 25X Cφmplete protease inhibitor 40 μl/ml freshly when in use) 10X Western blot running buffer (per liter)
Glycine 188.0 g, SDS 10.0 g, Tris 30.0 g, adjust to pH 8.3 with NaOH, mix and add ddH2O to 1 liter
10X Western blot transfer buffer (per liter)
Glycine 188.0 g, Tris 30.0 g, mix and add ddH2O to 1 liter (supplemented with Methanol 200 ml/liter 1X transfer buffer freshly when in use)
Western blot blocking buffer (per 100 ml)
Fat-free skim milk 4.0 g, add Western blot washing buffer to 100 ml 10X Western blot washing buffer (per liter)
NaCl 90.0 g, 1M Tris (pH 7.4) 100 ml, Tween 20 20 ml, mix and add ddH2O to 1 liter Antibody dilution buffer (per 50 ml)
Fat-free skim milk 0.25 g, 20% Sodium azide 0.5 ml, add Western blot washing buffer to 50 ml
Stripping buffer (per 100 ml)
10% SDS 20 ml, 1M Tris (pH 6.8) 6.68 ml, add ddH2O to 100 ml (supplemented with 2-ME 8.2 μl/ml freshly when in use)
Fast Green (per liter)
Acetic acid 100 ml, 95% ethanol 263 ml, Fast green 1.0 g, add ddH2O to 1 liter PI staining
100mg PI powder, add 1xPBS to 100ml, then filted with 0.22uM filter.
0.2% TritonX-100
200ul TritonX-100, add 1xPBS to 100ml.
1.5 質體 (Plasmid) pMD2.G
帶有以 CMV 啟動子表現 VSV 套膜醣蛋白之表現質體，用於包裹慢病毒。此質 體由陽明大學王學偉老師惠贈。
p8.91
帶有以 CMV 啟動子表現 HIV-1 gag、pol、tat、rev 之表現質體，用於包裹慢病毒。
此質體由陽明大學王學偉老師惠贈。
pMD.G
帶有以 CMV 啟動子表現 VSV 套膜醣蛋白之表現質體，用於包裹慢病毒。此質 體購自中研院 RNAi core 核心設施。
pCMVΔR8.91
帶有以 CMV 啟動子表現 HIV-1 Gag、Pol、Tat、Rev 之表現質體，用於包裹慢病 毒。此質體購自中研院 RNAi core 核心設施。
pSIN-MCS
慢病毒表現載體，以 SFFV 啟動子表現目標基因，且具有 ampicillin 抗藥基因。
此載體由陽明大學王學偉老師惠贈。
pSIN-LMP1
以 SFFV 啟動子表現 LMP1 之慢病毒質體，由本實驗室蔡淑君學姊構築。
pSIN-LMP2A
以 SFFV 啟動子表現 LMP2A 之慢病毒質體，由本實驗室蔡淑君學姊構築。
pSIN-Zta
以 SFFV 啟動子表現 Zta 之慢病毒質體，由本實驗室吳韶文學姊構築。
pSIN-LMP1 ΔCTAR1
以 SFFV 啟動子表現去除胺基酸第 194-232 片段之 LMP1 的慢病毒質體，由本實 驗室林巧潔學姊構築。
pSIN-LMP1 ΔCTAR2
以 SFFV 啟動子表現去除胺基酸第 351-386 片段之 LMP1 的慢病毒質體，由本實 驗室林巧潔學姊構築。
pSIN-LMP1 ΔCTAR1+2
以 SFFV 啟動子表現去除胺基酸第 194-232 及胺基酸第 351-386 片段之 LMP1 的 慢病毒質體，由本實驗室林巧潔學姊構築。
pSG5
表現載體，以 SV40 啟動子表現目標基因，且具有 ampicillin 抗藥基因。(Stratagene) pSG5-LMP1
以 SV40 啟動子表現 LMP1 之表現質體。此載體由英國伯明罕大學 Dr. Alan B.
Rickinson 惠贈。
pLKO AS2.neo
慢病毒表現載體，以 CMV 啟動子表現目標基因，且具有 neomycin 抗藥基因。
此載體購自中研院 RNAi core 核心設施。
pLKOAS2.neo-DUSP6
以 CMV 啟動子表現人類 DUSP6 基因的慢病毒質體，由本實驗室董姿巡學姊構 築。
pLKOAS2.neo-DUSP6 C293S
以 CMV 啟動子表現人類具有催化區域突變 DUSP6 之基因的慢病毒質體，其 DUSP6 之催化區域第 293 位點由 cysteine 突變為 serine。由本實驗是董姿巡學姊 構築。
pLKO AS2.neo-DUSP8
以 CMV 啟動子表現人類 DUSP8 基因的慢病毒質體，由本實驗室翁培倫學長構 築。
pCMV-Tag2B
以 CMV 啟動子表現目標基因，可在真核細胞表現蛋白質之載體，並具有 flag 標 籤，載體上具有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。
pCMV-Tag2B-DUSP6
以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類 DUSP6 基因的表現質體。由美國 西北大學 Jonathan D. Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。
pCMV-Tag2B-DUSP6 C293S
以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類具有催化區域突變 DUSP6 之基因 的表現質體，其 DUSP6 之催化區域第 293 位點由 cysteine 突變為 serine，由美國 西北大學 Jonathan D. Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。
pCMV-Tag2B-DUSP8
以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之人類 DUSP8 之基因的表現載體(附錄 六)。
pCMV-Tag2B-DUSP8 CS
以 CMV 啟動子表現 N 端帶有 flag 標籤之具有催化區域突變之人類 DUSP8 之基 因的表現載體，其 DUSP8 之催化區域第 246 位點由 cysteine 突變為 serine(附錄 七)。
pMT-SM-myc
來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現蛋白質的基因載體。(Oehrl et al., 2013)
pMT-SM-myc-M3/6 WT
來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現人類之野生型 DUSP8 (又稱為 M3/6)基因的基因載體。(Oehrl et al., 2013)
pMT-SM-myc-M3/6 CS
來自國外實驗室，希臘之B.S.R.C “Alexander Fleming”單位，由 George Panayoutou 博士惠贈之表現人類之催化區域突變型之 DUSP8(又稱為 M3/6)基因的基因載體。
其 DUSP8 催化區域第 246 位點由 cysteine 突變為 serine。(Oehrl et al., 2013) pEGFP-C1
以 CMV 啟 動 子 表 現 綠 色 螢 光 蛋 白 質 (GFP) 之 表 現 質 體 ， 具 有 neomycin/kanamycin 抗藥基因。(Promega)
pGL3-basic
帶有表現 Luciferase 之報導基因載體，但不具啟動子，且帶有 ampicillin 抗藥基 因。
pGL3-DUSP8 (-820/+20)
將人類 DUSP8 基因啟動子(-820/+20)，嵌入 pGL3 之質體。
pGL3-DUSP8 (-645/+20)
設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-646 序 列。
pGL3-DUSP8 (-500/+20)
設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-501 序 列。
pGL3-DUSP8 (-280/+20)
設計引子去除 pGL3-DUSP8 (-820/+20)質體之 DUSP8 啟動子第-820 至-281 序列 (附錄八)。
pGL2-DUSP6 (-2018/+133)
將人類 DUSP6 基因啟動子(-2018/+133)，嵌入帶有 Luciferase 基因及 ampicillin 抗藥基因，但不具啟動子之 pGL2-Basic 載體。此質體由美國西北大學 Jonathan D.
Licht 教授惠贈(Morrison et al., 2008)。
pGL2-DUSP6 (-1003/+133)
設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-1004 序列去除。
pGL2-DUSP6 (-546/+133)
設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-547 序列去除。
pGL2-DUSP6 (-300/+133)
設計引子將 pGL2-DUSP6 質體中，DUSP6 啟動子第-2018 至-301 序列去除。
pLKO.1-shLuciferase
表 現 專一 降 解人 類 luciferase mRNA 之 shRNA 慢 病 毒質 體，目 標 序列 為 5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCT。此質體購自中研院 RNAi core 核心設施。
pLKO.1-shLMP1
表現專一降解 LMP1 mRNA 之 shRNA 慢病毒質體，目標序列為 LMP1 mRNA 第 459 至 476 之 DNA 序列 5’-GCTCTTATTGCTCTCTAT。此質體由本實驗室蔡淑 君學姊構築。
1.6 勝任細胞 (Competent cell) DH5α
為 recA 及 endA 基因突變之大腸桿菌菌株，可降低質體被重組的機率，增加質體 穩定性，具有高轉形效率及高質體 DNA 增殖能力。
JM109
為 recA 及 endA 基因突變之大腸桿菌菌株，可降低質體被重組的機率，並可避免 質體受核酸限制酶之影響。此菌株用以表現 pLKO.AS2neo 系列基因。
2.方法
2.1 細胞培養 (Cell culture)
附著性細胞如 HEK293T 細胞以含有 10% FBS、1 mM L-glutamine、100 U/ml penicillin 與 100 g/ml streptomycin 之 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。懸浮細胞如 B 細胞以含有 10% FBS、
1 mM L-glutamine、100 U/ml penicillin 與 100 g/ml streptomycin 之 Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。
細胞保存以細胞計數器計數細胞後，取 1×107細胞以 1 ml 含有 10% DMSO 之 FBS 回溶，取至細胞冷凍管內置於 4℃、5 分鐘後，移置於-20℃、20 分鐘，
最後儲存於-80℃或液態氮中保存。
2.2 質體構築 (Plasmid construct)
目標載體以適當限制酶在特定的溫度條件下切割，加入 CIP 於 37℃作用 1 小時後，利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行純化，儲存於-20℃。
設計含有適當限制酶切位之引子，製備目標基因片段。利用 KAPA HiFi DNA polymerase 或 PhusionTM Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 進行 PCR 反應，
放大目標基因片段，接著利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kit 進行純化，
以適當限制酶在特定的溫度條件下切割，利用 Gel/PCR DNA fragments extraction
kit 純化出於洋菜膠體電泳作用分離之目標基因片段，儲存於-20℃。
目標載體與目標基因片段以 1:6 之比例，取總量約 200-300 ng 混合均勻，以 65℃反應 10 分鐘後，加入 T4 DNA ligase 於 16℃水浴槽進行 DNA 接合作用 (ligation)24 小時，即完成質體構築。接合後之產物利用轉型作用作進一步篩選，
儲存於-20℃。
2.3 轉形作用 (Transformation)
取 100 ng 質體與 90 μl 勝任細胞混合至 0.6 ml 微量離心管，置於冰上 30 分 鐘，以 42℃水浴反應 90 秒後，立即置於冰上 30 分鐘，接著加入含 1 ml SOC medium 之養菌管於 37℃培養箱以轉速 160 rpm (FIRSTEK S-300R)振盪培養 1 小 時。以轉速 13200 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415R)離心 1 分鐘，保留約 100 μl 上清液回溶 pellet，將之利用 4℃無菌玻璃珠均勻塗佈於含有適量抗生素之 LB 或 TB 固態培養基於 37℃培養箱培養 16-18 小時。
挑選數個獨立菌落種於 2 ml 含有適量抗生素之 LB 或 TB medium 中於 37℃
培養箱以轉速 160 rpm (LM-530D)振盪培養 16-18 小時，利用 High-speed plasmid mini kit 抽取小量質體 (依照操作手冊提供之流程進行)，利用限制酶切割與核酸 定序進行確認。
2.4 定點突變法 (Site-directed Mutagenesis)
設計單一突變引子，以欲突變之質體為模板，製備目標基因片段。利用 KAPA HiFi DNA polymerase 或 PhusionTM Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 進行 PCR 反應，放大目標基因片段，反應完成後加入 1 l DpnI 於 37℃水浴槽作用 24 小時，再加入 1 l DpnI 於 37℃水浴槽作用 1-2 小時。取作用完之產物進行轉形 作用，利用限制酶切割與核酸定序進行確認突變質體是否正確。
2.5 質體大量製備 (Plasmid maxi preparation)
實驗利用 QIAGEN Plasmid maxi kit 進行質體大量製備。將含有目標質體之
獨立菌落種於 3 ml 含有適量抗生素之 LB medium 中於 37℃培養箱，以轉速 160 rpm (LM-530D)振盪培養 16-18 小時，取 1 ml 菌液利用 High-speed plasmid mini kit 抽取小量質體利用限制酶切割進行確認。
餘 2 ml 菌液倒入 200 ml 含有適量抗生素之 TB medium 中於 37℃培養箱以 轉速 160 rpm (LM-530D)振盪培養 16-18 小時。將菌液倒入 250 ml 離心瓶以轉速 6000 rpm (Beckman JA14 rotor)、4℃，離心 15 分鐘，去除上清液後加入 10 ml P1 打散 pellet 並取至 50 ml 離心管，接著加入 10 ml P2 上下翻轉 10 次、靜置於室 溫 5 分鐘，再加入 10 ml P3 上下翻轉 10 次、置於冰上作用 20 分鐘。以轉速 20000 rpm (Beckman JA25.5 rotor)、4℃，離心 20 分鐘，將上清液倒入新的 50 ml 離心 管重複離心一次，此時以 10 ml QBT 平衡管柱。將上清液倒入管柱中，待過濾完 成後以 30 ml QC 清洗管柱兩次，接著以 15 ml QF 回溶質體至新的 50 ml 離心管，
並加入 10.5 ml 2-propanol，混勻後以轉速 20000 rpm (Beckman JA25.5 rotor)、4
℃，離心 30 分鐘，去除上清液後加入 5 ml 75% Ethanol 以轉速 20000 rpm (Beckman JA25.5 rotor)、4℃，離心 15 分鐘，去除上清液後風乾，以 2 ml TE buffer 回溶 pellet 並分裝至 4 個 1.5 ml 微量離心管 (各 500 μl)，每管加入 1 ml 100% Ethanol 與 50 μl 3M Sodium acetate (NaOAc)於-80℃作用 24 小時析出 DNA，以轉速 14000 rpm (Sigma 2K15)、4℃，離心 30 分鐘，去除上清液後各加入 1 ml 75% Ethanol，以 轉速 14000 rpm (Sigma 2K15)、4℃，離心 15 分鐘，去除上清液後倒扣風乾，以 適量 ddH2O 回溶，利用 Nanodrop 2000c (Thermo)測定質體濃度，儲存於-20℃。
2.6 基因轉染 (Transfection) LipofectamineTM 2000
主要用於附著性細胞。利用細胞計數器計數細胞後，取 2×106細胞至 10 公 分組織培養盤中以 12 ml DMEM 於 37℃、含 5% CO2培養箱培養，待細胞均勻 貼附於培養盤後，於轉染前一小時將原有培養液置換為 12 ml FBS-free DMEM。
目標質體與 LipofectamineTM 2000 以 1:1.5 (w:v)之比例分別與適量 Opti-MEM 混
勻後靜置於室溫 5 分鐘，再將二者混合靜置於室溫 20 分鐘。細胞去除原有培養 液後均勻滴入質體混合液於培養箱作用 16 小時，將質體混合液置換為新鮮的 DMEM 繼續培養，即完成目標質體之轉染。
NTR II
主要用於附著性細胞。利用細胞計數器計數細胞後，取 1×105細胞至 12 孔 組織培養盤中以 1 ml DMEM 於 37℃、含 5% CO2培養箱培養，待細胞均勻貼附 於培養盤後，目標質體與適量 Opti-MEM 混合後，以質體與 NTR II 為 1:2 (w:v) 之比例加入 NTR II，混勻後靜置於室溫 15 分鐘。細胞均勻滴入質體混合液後繼 續培養，即完成目標質體之轉染。
2.7 慢病毒包裹及感染 (Lentivirus package and infection)
利用細胞計數器計數 HEK293T 細胞後，取 6×106細胞至 75T 細胞培養角瓶 中以 12 ml DMEM 於 37℃、含 5% CO2培養箱，待細胞均勻貼附於培養角瓶底 面後，於轉染前一小時將原有培養液置換為 12 ml FBS-free DMEM。將 pMD2.G、
p8.91 與欲包裹之目標質體以 1:2:3 之比例混合 (pMD.G、pCMVΔR8.91 與欲包裹 之目標質體比例則為 1:9:10)，混合後之質體與 LipofectamineTM 2000 以 1:1.5 (w:v) 之比例分別與 4ml Opti-MEM 混勻後靜置於室溫 5 分鐘，再將二者混合靜置於室 溫 20 分鐘(共 8ml)。細胞去除原有培養液後均勻滴入質體混合液於培養箱作用 16 小時，將質體混合液置換為 15 ml 含有 1% BSA 新鮮的 DMEM 繼續培養，24 小時後收取上清液至 50 ml 離心管，暫存於 4℃，原 75T 再加入 15 ml 含有 1% BSA 新鮮的 DMEM 繼續培養，24 小時後收取上清液至同一 50 ml 離心管。收取之上 清液以轉速 1000 rpm (BECKMAN GS-6R)離心 5 分鐘後，以 0.22 μm 過濾膜 (MillexTM)過濾並分裝，保存於-80℃。
慢病毒液主要用於感染懸浮細胞。利用細胞計數器計數細胞後，依實驗設定 之病毒感染劑量 (Multiplicity of infection, MOI)，取特定數目之細胞至 6 孔組織 培養盤中，均勻加入慢病毒液，以轉速 2250 rpm (BECKMAN GS-6R)，於室溫離
心 30 分鐘 (關閉離心機降速時之剎車功能)，於 37℃、含 5% CO2培養箱培養，
並於隔天回補適量之新鮮的 RPMI 繼續培養，即完成慢病毒感染。此流程所收集 之慢病毒液取 1 ml 感染 1×106細胞時 MOI 定義為 1。
2.8 RNA 萃取 (RNA extraction)
細胞取至 1.5 ml 微量離心管，以轉速 2000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415R)、
4℃，離心 5 分鐘後，去除上清液以 1 ml TRIzol® reagent 打散細胞，靜置於室溫 5 分鐘，加入 200 μl Chloroform，將離心管劇烈震盪 15 秒 (Vortex-Genie 2)，使 呈均勻粉紅色，以轉速 14000 rpm (Sigma 2K15)、4℃，離心 15 分鐘。將上層透 明水層取至含有600 μl 2-propanol 與 4 μg Glycogen 之 1.5 ml 微量離心管 (此步驟 需避免取到中央白色層)，混合均勻後靜置於室溫 10 分鐘，儲存於-80℃或以轉 速 14000 rpm (Sigma 2K15)、4℃，離心 30 分鐘。去除上清液後加入 1 ml 75%
Ethanol (以 DEPC ddH2O 配製)，以轉速 14000 rpm (Sigma 2K15)、4℃，離心 20 分鐘，去除上清液後倒扣風乾，以適量 DEPC ddH2O 回溶，利用 Nanodrop 2000c (Thermo)測定 RNA 濃度，儲存於-80℃。
2.9 反轉錄反應 (Reverse transcription, RT)
取3μg RNA 至 0.6 ml 微量離心管，加入 1 μg Random primers 與 DEPC ddH2O 至體積為4 μl，於 95℃反應 90 秒後，靜置於室溫 10 分鐘。再加入 2 μl 5X RT reaction buffer、2 μl 2.5 mM dNTP、1 μl 100 mM DTT、0.2 μl Rnasin RNase inhibitor (40 U/μl)、0.8 μl M-MLV Reverse transcriptase (200 U/μl)至體積為 10 μl，於 42℃
反應 80 分鐘、70℃反應 20 分鐘、4℃停止反應，生成 cDNA。cDNA 以 DEPC ddH2O 稀釋 10 倍後儲存於-20℃。
2.10 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)
取適量 cDNA 至 0.2 ml PCR 反應小管，以滅菌 ddH2O 調整體積為 4 μl，加 入0.2 μl 10 μM 正向及反向引子、1 μl 10X PCR buffer、1.5 μl 2.5 mM dNTP、0.7
μl ProZyme DNA polymerase (2 U/μl)，以 DEPC ddH2O 調整體積至 10 μl。利用循 環溫控儀 (T3 Thermocycler)以 94℃反應 3 分鐘、進入 94℃反應 1 分鐘、60℃反 應 1 分鐘、72℃反應 1 分鐘，重複此一循環 (次數視目標基因片段而定)、接著 以 72℃反應 7 分鐘、4℃停止反應，即完成聚合酶連鎖反應。反應完成之產物加 入 6X DNA loading dye 以 2%洋菜膠進行膠體電泳分析。
2.11 即時定量聚合酶連鎖反應 (Real-time quantitative PCR, Q-PCR)
取適量 cDNA 於 96 孔組織培養盤，加入 0.5 μl 10 μM 正向及反向引子、12.5 μl FastStart Universal Master Mix、0.25 μl Universal ProbeLibraryTM probe，以 ddH2O 調整體積至 25 μl。封上塑膠膜與墊片後以轉速 100 rpm (Beckmen GS-6R) 離心 3-5 分鐘，利用同步即時定量聚合酵素連鎖反應儀 (ABI PRISM 7900)進行 即時定量聚合酶連鎖反應。
2.12 蛋白質萃取 (Protein extraction)
細胞取至 1.5 ml 微量離心管，以轉速 2000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415R)、
4℃，離心 5 分鐘，去除上清液後加入 1 ml 1X PBS (4℃)清洗細胞，以轉速 2000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415R)、4℃，離心 5 分鐘，去除上清液後以適量 RIPA buffer (4℃)回溶細胞，此即全細胞蛋白質萃取液 (whole cell lysate)。
全細胞蛋白質萃取液利用超音波以間隔 2 秒、震盪 2 秒的方式進行震盪 (UP400A Sonicor)，待萃取液呈透明澄清後， 以轉速 13200 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415R)、4℃，離心 2 分鐘，收取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管，儲 存於-80℃。
2.13 蛋白質濃度測定 (Protein concentration quantification)
取 1 μl 全細胞蛋白質萃取液至含有 799 μl ddH2O 之 1.5 ml 微量離心管中，
加入200 μl Bio-Rad protein assay reagent 混合均勻後避光，於室溫反應 5 分鐘。
利用分光光譜儀 (UltroSpec 3000 DU-64)測定波長 595 nm 之吸光值，並以已知濃 度之 BSA 制定標準曲線，推算蛋白質濃度。
2.14 西方墨點法 (Western blot analysis)
取 12 μg 蛋白質至 0.6 ml 微量離心管，加入 4X Sample loading dye，以 RIPA buffer (4℃)調整體積至 12 μl，此即蛋白質樣本。
蛋白質樣本於 95℃加熱 5 分鐘後，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體進 行電泳分析 (SDS-PAGE)。依 Molecular cloning (Sambrook et al., 1989)所述之配 方製備下層 10%分離膠體 (resolving gel)與上層 5%聚積膠體 (stacking gel)，以直 立式電泳裝置，於電泳槽注入 1X Running buffer，以電壓 70 伏特作用 30 分鐘，
再提高電壓至 120 伏特。
待蛋白質樣本分離至適當距離後，取出膠體以活化後之 PVDF 轉漬膜覆蓋，
與濾紙、海棉墊片以三明治之方式置入卡夾中，於轉漬槽注入 1X Transfer buffer，
以電流 300 毫安培進行轉漬作用 90 分鐘。完成轉漬後，取出轉漬膜以 Fast Green 染色，經 ddH2O 潤洗後保持濕潤，依實驗需求進行裁切。接著浸入 Blocking buffer 室溫振盪作用 1 小時後進行抗體標定。
將轉漬膜浸入以 Antibody dilution buffer 稀釋至適當濃度之 1 級抗體中，於 4
℃作用 24 小時。以 1X Washing buffer 清洗 4 次、每次 5 分鐘後，浸入以 Blocking buffer 稀釋至適當濃度之 2 級抗體中，室溫振盪作用 2 小時，再以 1X Washing buffer 清洗 4 次、每次 5 分鐘。接著加入 Western LightningTM chemiluminescence reagent plus 進行反應，於暗房中以 X 光底片 (Fuji)偵測特定蛋白質之表現。
將轉漬膜浸入 Stripping buffer 於 55℃水浴槽作用 10 至 20 分鐘，卸除抗體 後，以 1X Washing buffer 清洗 4 次、每次 5 分鐘，接著浸入 Blocking buffer 室溫 振盪作用 1 小時後，即可再次進行抗體標定。
實驗中所使用之抗體資訊與稀釋倍數詳見表。
2.15 周邊血液單核球細胞分離 (Isolation of peripheral blood mononuclear cells
(PBMCs))
自台北捐血中心取得兩單位 (500 ml)周邊血分離出白血球濃厚液 (white blood cells concentrate)約 40-45 ml，以密度梯度離心法 (Ficoll-paque density gradient centrifugation)分離單核球細胞。
將白血球濃厚液倒入 50 ml 離心管以轉速 1000 rpm (BECKMAN GS-6R)、室 溫 (20-25℃)，離心 5 分鐘，去除上層油脂及血漿 (plasma)後，移至含有 100 ml FBS-free RPMI 之 75T 培養瓶，同時以 30 ml FBS-free RPMI 清洗殘留於離心管 內的白血球濃厚液，回收至同一培養瓶，混合後各取 30 ml 至含有 15 ml Ficoll-paque 之 50 ml 離心管 (離心管傾斜，緩慢加入以避免破壞 Ficoll-paque 與 白血球濃厚液分層之界線)。以轉速 2400 rpm (BECKMAN GS-6R)、20℃，離心 30 分鐘 (關閉離心機降速時之剎車功能，減少分層受到擾動)。離心結束後，去 除上層血漿，將中間白色單核球細胞層移至新的 50 ml 離心管，加入 FBS-free RPMI 補滿至 50 ml 進行清洗，以轉速 2000 rpm (BECKMAN GS-6R)、20℃，離 心 15 分鐘後，去除上清液，重複此一步驟兩次，並逐步降低離心轉速、溫度及 時間為 1800 rpm、20°C、12 分鐘 (合併為三管)和 1500 rpm、4°C、5 分鐘 (合併 至一管)。接著以事先預冷之 10 ml purify buffer (buffer 1) (2 mM EDTA, 0.1% BSA in PBS)回溶細胞，即完成周邊血液單核球細胞分離。
2.16 CD19+ B 細胞純化 (Purification of CD19+ B cells)
取適量 CD19+ Dynabeads 至 15 ml 離心管後，加入等體積 purify buffer 放入 磁架中清洗磁珠，去除上清液後，以等體積 purify buffer 回溶磁珠。
接著取 25 l 磁珠與 5×107 PBMCs 於 4°C 轉盤 (DISHUNG)轉速 12 rpm 作用 20 分鐘後，以 0.5 ml purify buffer 清洗磁珠四次，取適量 RPMI 回溶磁珠。此時，
CD19+ B 細胞會吸附於磁珠上，初估每 1x107 B 細胞，加入 10 l DETACHaBEAD 於室溫下以轉盤 (DISHUNG)轉速 12 rpm 作用 60 分鐘，釋放 B 細胞，以適量 RPMI 回溶磁珠四次，收取上清液至新的 15 ml 離心管，即完成 CD19+ B 細胞之
純化。
2.17 LCL 建立 (LCL establishment)
將 CD19+ B 細胞調整濃度為 1×106/ml，取至 12 孔組織培養盤中，每 1 ml 加入 20 l B95.8 strain EB virus stock (以 1:50 之比例稀釋)，於 37℃、含 5% CO2
培養箱培養 28 天後即完成 LCL 之建立。
2.18 螢光酵素報導基因分析 (Luciferase reporter assay)
附著性細胞利用細胞計數器計數後，取 1×105細胞至 12 孔組織培養盤中以 1 ml DMEM 於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。每組樣本進行三重複實驗，24 小時 後，利用 NTR II 以質體與 NTR II 為 1:2 (w:v)之比例進行轉染 (質體包含 0.25 μg Effector、0.5 μg Reporter 及 0.05 μg GFP)，繼續培養 72 小時。
懸浮性細胞利用細胞計數器計數後，取 3×105細胞至 12 孔組織培養盤中 1 ml RPMI 於 37℃、含 5% CO2培養箱培養。每組樣本進行三重複實驗，利用慢病毒 液轉導 Effector 與 Reporter，培養適當時間。
接著將細胞取至 1.5 ml 微量離心管，以 1X PBS (4℃)清洗後，以 110 l FBS-free RPMI 回溶，取 50 l 至 96 孔組織培養盤，各加入 50 l Bright-Glo® Luciferase Substrate 混 合 均 勻 後 ， 以 微 盤 式 閃 爍 冷 光 分 析 儀 (PerkinElmer TopCount) 測 定 冷 光 讀 值 ， 並 以 酵 素 免 疫 微 量 計 數 器 (Molecular Devices SpectraMax M5)測定 GFP 讀值，計算出螢光酵素活性。剩餘約 60 l 細胞萃取蛋 白質後，以西方墨點法進行分析。
2.20 AlamarBlue®活細胞增生分析法
利用細胞計數器計數細胞後，取 1×104細胞至 96 孔組織培養盤中於 37℃、
含 5% CO2培養箱培養。每組樣本進行三重複實驗，分別於第 0、24、48、72、
