pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα與pGEX-Lac Zα以限制酵素Not I切 開可將環形重組質體切成線性 (圖三-A)。，pGEX-fTBP20Q-Lac Z α、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα可切出約5.6 kb之DNA片段 (lane 1與lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約5.7 kb之DNA片段 (lane 3)，
pGEX- fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約5.8 kb 之DNA片段 (lane 4與lane 5)，pGEX-Lac Zα可切出約4.6 kb之DNA 片段 (lane 6)。
pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα、pGEX-Lac Zα與pUC 18以限制酵 素 EcoR I 切 開 可 將 環 形 重 組 質 體 切 成 線 性 ( 圖 三 -B) 。 pGEX-fTBP20Q-Lac Zα、pGEX-fTBP40Q-Lac Z α可切出約5.6 kb 之DNA片段 (lane 1與lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約5.7 kb 之DNA片段(lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約5.8 kb之DNA片段 (lane 4與lane 5)，pUC 18切出約2.6 kb 之DNA片段 (lane 6)。pGEX-Lac Zα可切出約4.6 kb之DNA片段 (lane 7)。
pGEX-fTBP-Lac Zα以限制酵素Bpu10 I與Ade I(Dra Ⅲ)切開
可將poly Q的基因部分切出 (圖四-A)。pGEX-fTBP20Q-Lac Zα可切 出約0.5 kb之DNA片段 (lane 1)、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα可切出約 0.56 kb之DNA片段 (lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約0.6 kb 之DNA片段 (lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα可切出約0.7 kb之 DNA片段 (lane 4)。
pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα以限制酵素EcoR V與EcoR I切開可 將環形重組質體切成兩個DNA片段 (圖四-B)。pGEX-fTBP20Q-Lac Z α可切出約3.5 kb與2.1 kb之DNA片段 (lane 1)、pGEX-fTBP40Q-Lac Z α 可 切 出 約 3.5 kb 與 2.1 kb 之 DNA 片 段 (lane 2) ， pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.2 kb之DNA片段(lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.3 kb之DNA片段(lane 4)、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.3 kb之DNA片段 (lane 5)。
二、各重組質體於轉型菌株內的表現情形
(一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) (1)
瓊脂平板培養基分析 (
Agar plate culture)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)
平板培養基
上菌落的顏色變化性非常低，同種重組質體在同種大腸桿菌中重複幾次做出來的結 果都不一致，有時候呈藍色有時候呈白色，而且在同一個
平板培 養基
上藍、白菌落夾雜 (data not shown)。推測用混合塗佈法的 呈色不一致之可能原因為IPTG與X gal被agar吸收後其在平板培 養基
上每個區域的濃度均不相同，故造成再現性差及藍、白菌落 夾雜的結果。而直接做在平板培養基
上之呈色不一致可能原因為 大腸桿菌攝入X gal的速率不同，使培養時間難以掌握而造成再 現性差及藍、白菌落夾雜的結果。故瓊脂平板培養基分析
只適用 於「定性」。(2)密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養 (Non-aerated culture in 96 deep-well plate with horizontal shaker)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化
使用96孔深盤養菌盒做密閉、水平震盪培養在六種大腸桿菌 中的再現性仍非常低。從pGEX-fTBP74Q-Lac Zα之(LB+Amp)
JM109 平板培養基
上挑出五個菌落做密閉式96孔深盤養菌盒水 平震盪培養，結果不同菌落在相同養菌盒中藍色深淺有差異 (圖 六-A)，且相同菌落在相同養菌盒中也有相同的情形 (data not shown)，同時也觀察到細胞沈澱於well底部。推測可能原因為相同質體於養菌盒不同well中誘導表現時，因養菌盒中每個well接 受到的震盪程度不均造成培養條件不一 (菌體、X gal沈澱於well 底部)，進而導致呈色不一致。
因密閉式96孔深盤養菌盒水平震盪培養有再現性差的缺 點，為了驗證再現性差可能為震盪不均所造成，使用微量離心管 震盪培養並觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化。微量 離心管震盪培養的方式其再現性高，不再有呈色不一致的問題。
從 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP109Q-Lac Z α 與 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα之(LB+Amp) JM109
平板培養基
上挑出 五個菌落做微量離心管震盪培養，結果發現呈色非常穩定，也不 再有細胞沈澱 (圖六-B、C、D)，其他菌株的呈色也非常穩定 (data not shown)。將所有重組質體轉型進入大腸桿菌JM109菌種做微量 離心管震盪培養後0.1mM、0.5mM、1mM IPTG誘導下均呈藍色，而0mM、5mM、10mM IPTG誘導下則呈白色 (圖七)。此結果雖 驗證了密閉式96孔深盤養菌盒水平震盪培養之再現性差可能為 震盪不均所造成，但pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體之藍、白結 果不如預期，推測透氣與否可能影響呈色故使用錐形瓶震盪培養 做一系列實驗。
為了探討轉型菌株在震盪均勻及有氧培養條件下，各種 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表達情況，故使用錐形瓶做透 氣培養。以錐形瓶做震盪培養因震盪均勻，故再現性高且呈色穩 定。將所有質體轉入 JM109 中並挑菌做錐形瓶震盪培養，共有 八組(JM109 control、pUC 18、pGEX-lac Zα、pGEX-fTBP20Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP40Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP 109Q-Lac Zα、pGEX- tTBP135Q-Lac Zα)。JM109 control 不含任何質體故一定不呈色，作為負對照組 (negative control)，pUC 18 則一定呈色故作為正對照組 (positive control)。
0mM IPTG 誘導下均無呈色，0.1mM IPTG 誘導 12 小時之藍白 結果與藍色程度如圖八與表一，且 pUC18、pGEX-lac Zα、
pGEX-fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα均於 2 小時 後有藍色產生、pGEX-fTBP74Q-Lac Zα則於 6 小時後稍有呈 色，而 pGEX-fTBP20Q-Lac Zα、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα、JM109 control 則 不 呈 色 ( 圖 九 ) 。 此 結 果 驗 證 透 氣 培 養 下 會 使 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體出現藍白差異。
根據以上結果，在震盪均勻、透氣 (Ventilation)與可做大量 (High-throughput)藥物篩檢的前提下將 96 孔深盤養菌盒培養方 式加以修正成方法三。
(3) 曝 氣 式 96 孔 深 盤 養 菌 盒 震 盪 培 養 (Aerated and vigorous shaking culture in 96 deep-well plate)
因96孔深盤養菌盒具有可做大量藥物篩檢(High-throughput) 的優點，故將透氣 (Ventilation)、震盪均勻的條件應用在96孔深 盤養菌盒，以此發展出曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養的方式 -透氣養菌盒、斜角三十度震盪。將所有質體轉入JM109、XL1
blue、Top 10、DH5α、Rosetta blue與KRX中並挑菌做曝氣式96
孔深盤養菌盒震盪培養，培養的結果如圖十、十一、十二。共 有 八 組 (Negative control 、 pUC18 、 pGEX-lac Z α 、 pGEX-fTBP20Q-Lac Z α 、 pGEX- fTBP40Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP 109Q-Lac Z α 、 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα)。Negative control (簡稱NC)不含任何 質體故一定不呈色，作為負對照組 (negative control)，pUC18一 定呈色作為正對照組 (positive control)。0mM IPTG誘導下均無 呈色，0.1mM IPTG誘導12小時之呈色結果與呈色時間先後如表 二。JM109之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後有藍色產生；XL1
blue之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後有藍色產生；Top 10之
pUC 18於6小時後有藍色產生；DH5α之pUC 18於6小時後有藍 色產生；Rosetta blue之pUC 18於12小時後有藍色產生、pGEX-lacZα誘導後使菌死亡。KRX之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後 有藍色產生。
由 表 二 可 知 JM109 的 培 養 結 果 符 合 預 期 ， 即 pUC 18 、 pGEX-lac Zα誘導後呈藍色，故進一步使用此菌種並配合此培 養方式作蛋白質電泳、西方轉漬分析與β半乳糖苷酶活性分析。
(二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(genotyping)
以限制酶圖譜分析為方法分析轉型株之重組質體，以便確認轉型 菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制 酵素做切割。JM109之pGEX-TBP-Qn-Lac Zα以EcoR V與EcoR I做雙酵 素 切 割 ( 圖 五 -A) ， 圖 五 -A 之 lane 1-5 分 別 代 表 pGEX-TBP-20/40/74 /109/135Q-Lac Zα切割後的情形；JM109之pUC 18與pGEX-Lac Zα以 限制酵素EcoR I切割(圖五-B)，圖五-B之lane 1-2分別代表pUC 18與 pGEX-Lac Zα切割後的情形。其餘轉型菌株之重組質體鑑定均與圖五 同。
(三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組蛋 白之特性分析(soluble或insoluble)
pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體轉入JM109中並挑菌做曝氣式 96孔深盤養菌盒震盪培養，破菌後取細胞萃取液 (Supernatant)與沈澱
物 (Pellet)做西方轉漬分析 (圖十三)。由圖可知0mM IPTG誘導下均 無蛋白表現，而0.1mM IPTG誘導下萃取液部分目標位置只有pGEX-fTBP20Q-Lac Zα偵測到可溶性蛋白；其餘重組質體所呈現的訊號推 測可能為構形未完全解開、不具功能的可溶性蛋白。此結果顯示在這 些重組質體中有功能的TBP-Qn-Lac Zα並不存在於萃取液中，而可溶 性重組蛋白構形未完全解開的原因可能是凝集沉澱作用力過強所導 致。0.1mM IPTG誘導下沈澱物部分只有pGEX-fTBP20/40/ 74Q-Lac Z α可偵測到，其餘均無訊號，但只有pGEX- fTBP40Q-Lac Zα在焦集 膠體與分離膠體之間有嚴重smear ( TBP aggregation)的現象，顯示 pGEX-fTBP40Q- Lac Zα的凝集程度較pGEX-fTBP20/74Q- Lac Zα 高。西方轉漬分析的結果顯示pGEX-fTBP40Q-Lac Zα的溶解度較 pGEX-fTBP20/74Q-Lac Zα差，而pGEX-fTBP109Q/tTBP135Q- Lac Z α則不表現，此符合pGEX-TBP-Qn-Lac Zα/ JM109在表現型分析上 均呈白色的原因。
(四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay)：重組蛋白之水溶 性(soluble)分析
所有質體轉入JM109並做曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養，以此 方式得到的細胞萃取液 (Supernatant)做β gal活性分析 (圖十四)。由
圖可知在0mM IPTG誘導下無活性、而0.1mM IPTG誘導下pUC18與 pGEX-lac Zα之β gal活性明顯比pGEX-TBP-Qn-Lac Zα還高，此結 果與表現型分析相吻合。
(五)高濃度IPTG干擾藍白篩選結果
在 JM109 大 腸 桿 菌 、 0.1 與 10mM IPTG 誘 導 下 ， 所 有 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα重組質體以微量離心管震盪培養所得到的重組蛋 白細胞萃取液做β gal分析。在X gal表現型分析中高濃度IPTG (5或 10mM)呈白色，但取其細胞萃取液做β gal活性分析時卻發現有呈色 反應，表示在高濃度IPTG誘導下有活性的β gal被製造出來。推測可 能高濃度會抑制X gal或ONPG的呈色反應，故做以下測試：0.1mM、
10mM IPTG誘導下的細胞萃取液、外加0.1mM或10mM IPTG於相同 濃度IPTG誘導表達出的細胞萃取液，經上述四種處理後分別做ONPG 呈色分析 (圖十五)。結果發現外加10mM IPTG於相同濃度IPTG誘導 下的細胞萃取液顏色比不外加IPTG的淡，而外加0.1mM IPTG於相同 濃度IPTG誘導下的細胞萃取液其顏色則與不外加IPTG無明顯差異。
此實驗結果證明高濃度IPTG確實會抑制ONPG呈色，並干擾藍白篩 選。故使用0.1mM IPTG誘導蛋白表現。
pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα重組質體
IPTG誘導濃度(mM) 0.1 0.1 10 10
外加IPTG濃度(mM) 0 0.1 0 10
ONPG呈色 深黃 深黃 深黃
淺黃(六)微生物模型挑選結果
綜合表現型分析、基因型分析、蛋白質電泳、西方轉漬分析以及 β半乳糖苷酶活性分析，pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109符合篩藥條 件，故以pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109進行篩藥。
三、藥物篩選
(一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) 在各種濃度的海藻糖 (trehalose)與剛果紅 (Congo red)處理下，
JM109 的呈色結果如圖十六，由圖可知各種濃度海藻糖均無法有藍色
產生，各種濃度剛果紅均無法有墨綠色(紅＋藍)產生，進一步做蛋白 質電泳、西方轉漬分析(圖十七)與β半乳糖苷酶活性分析 (圖十八、
十九)均與表現型吻合，故海藻糖與剛果紅似乎無法抑制 pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109 凝集沈澱或增加其溶解度。
在各種濃度的海藻糖 (trehalose)處理下，外加 0.1％或 0.5％之 Tween 80 (Sigma)以幫助藥物通透，JM109 的呈色結果如圖二十，由
圖可知在各種濃度海藻糖與 0.1％或 0.5％之 Tween 80 雙重處理下均 無法有藍色產生，故 Tween 80 似乎對藥物通透幫助不大。
(二)各重組質體於JM109轉型菌株內的鑑定—基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析 JM109 轉型株之重組質體，以便 確認轉型菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出 並用限制酵素做切割，pGEX-fTBP40Q-Lac Zα以 EcoR V 與 EcoR I 做雙酵素切割，結果與圖五-A 同；pUC 18 與 pGEX-Lac Zα以限制 酵素 EcoR I 切割，結果與圖五-B 同。
(三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組 蛋白之特性分析(soluble 或 insoluble)
pGEX-fTBP40Q-Lac Zα重組質體轉入 JM109 中並挑菌做曝氣式 96 孔深盤養菌盒震盪培養，在各種濃度的海藻糖 (trehalose)處理下，
破菌後取細胞萃取液 (Supernatant)與沈澱物 (Pellet)做西方轉漬分析
破菌後取細胞萃取液 (Supernatant)與沈澱物 (Pellet)做西方轉漬分析