各重組質體於細菌內的表現

將 相 關 重 組 質 體 轉 形 至 大 腸 桿 菌 (E. coli) 之 DH5 α

(GeneMark)

、XL-1 Blue、JM109、Top 10、Rosetta blue與KRX

(Promega)

菌種，以IPTG誘導重組蛋白的表現，並做以下的分析以確認重質體 的存在、重組蛋白的溶解度與活性的變化情形，以此找出適合篩藥的 微生物表達系統。

Strain (菌種) Genotype (基因型)

DH5α SupE44 ΔlacU169(ψ80 lac ZΔM15) hsdR17 rec A1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

XL-1 blue endA1 gyrA96(nal

^R

) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB

⁺

lacI

^q

ZΔM15] hsdR17(r

_K^-

m

_K⁺

) JM109 endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB

⁺

Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB

⁺

lacI

^q

ZΔM15]

hsdR17(r

_K^-

m

_K⁺

)

Top 10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15

ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(Str

^R

) endA1 λ

-Rosetta blue endA1 hsdR17(r

_K12^–

m

_K12⁺

) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F' proA+B+ lacI

^q

ZΔM15 ::Tn10] pRARE2 (Cam

^R,

, Tet

^R

)

KRX [F´, traD36, ΔompP, proA

⁺

B

⁺

, lacI

^q

ZΔM15] ΔompT, endA1, recA1, gyrA96(Nalr), thi-1, hsdR17 (rK

^–

, mK

⁺

), e14

^–

(McrA

^–

), relA1, supE44,

Δ(lac-proAB),Δ(rhaBAD)::T7 RNA Polymerase lac ZΔM15：缺乏β gal的胺基端 (amino terminus)編碼序列

具有lac ZΔM15的大腸桿菌適宜作為藍白篩選的宿主 (host)。

(一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) 為了找出合適的E. coli菌種與表達條件，用以表達可溶性的短延 長TBP蛋白 (培養液呈藍色)、及不可溶性長延長TBP蛋白 (培養液呈 現白色)，使用以下方式找尋最佳表現型分析條件。

(1)瓊脂平板培養基分析(Agar plate culture)：觀察(LB+Amp+

IPTG+X gal)平板培養基上菌落的顏色變化

(LB+Amp+IPTG+X gal)的平板培養基上37℃隔夜培養後觀察顏 色變化。IPTG與X gal的添加方式有兩種，一為混合後塗在 (LB+Amp) plate上使平板培養基吸收而後再塗菌，本研究取100 μl的0.1 M IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) (Sigma, Saint Louis, MO, U.S.A.)與25μl的50mg/ml X gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) (Sigma)混合後塗在培養基上；

二為直接做在平板培養基上，本研究(LB+Amp+IPTG+X gal)平板 培養基之IPTG最終濃度為1mM、X gal之最終濃度為80μg/ml。

青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。

(2)密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養 (Non-aerated culture in 96 deep-well plate with horizontal shaker)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化

取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於(LB+Amp) 的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出plate上的菌落養在3ml的 (LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37℃、225r.p.m.作 隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+Amp)新鮮培養液 中 [30ml in 250ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m.培養2-3小時。而 後取250μl菌液加到含有250μl的(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培

轉型作用 (on plate) 37℃ 隔夜培養

觀察顏色變化

養液之96 deep-well中，以37℃、225r.p.m.之密閉、水平震盪的方 式作12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0、0.1、0.5、

1、5、10mM。X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩 選濃度為50 µg/ml。

96孔深盤養菌盒 貼上密封膠帶 「水平」震盪

因密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養有再現性差的缺 點，為了驗證再現性差可能為震盪不均所造成，使用微量離心管 震盪培養(Eppendorf in horizontal shaker)並觀察(LB+Amp+IPTG+

X gal)培養液的顏色變化。取適量質體做細菌之轉型作用後取部 分菌液塗於(LB+Amp)的平板培養基上 37℃隔夜培養。挑出平板 培養基上的菌落養在 3mL 的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml 離 心管]，以 37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將 1mL 菌液轉移到 30mL 的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml 錐形瓶]，以 37

挑菌 (in 15mL離心管) 含有250μl之(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培養液

觀察顏色變化 37℃ 225 r.p.m. 密閉

且水平震盪12小時

℃、225r.p.m.培養 2-3 小時。而後取 250μl 菌液加到含有 250μl 的(LB+Amp+IPTG +X gal)新鮮培養液之微量離心管中，以 37

℃、225r.p.m.「鉛直震盪」12 小時並觀察顏色變化。IPTG 測試 濃度為 0、0.1、0.5、1、5、10mM。X gal 的濃度為 80μg/ml。

青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為 50 µg/ml。

為了確認所使用的IPTG濃度對藍白篩選的呈色是否有影 響，使用微量離心管震盪培養，並以0.1或10mM IPTG誘導12小 時後所萃取出來的細胞萃取液外加相同濃度的IPTG做ONPG呈 色反應。

微量離心管放置在塑膠盒內於培養箱中做「鉛直震盪」

為了探討轉型菌株在震盪均勻及有氧培養條件下，各種 TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表達情況，使用錐形瓶震盪培養 (Flask in horizontal shaker)並觀察(LB+Amp+ IPTG+X gal)培養液

觀察顏色變化 含有250μl之(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培養液

37℃ 225 r.p.m.

鉛直震盪12小時

的顏色變化。取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於 (LB+Amp)的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出平板培養基上的 菌落養在3mL的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37

℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+

Amp)中或將166μl菌液轉移到5mL的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶或5ml in 50ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m.

培養2-3小時。而後加入適量IPTG與X gal，以37℃、225r.p.m.作1、

2、3、6、12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0、0.1mM。

X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。

(3)曝氣式 96 孔深盤養菌盒震盪培養 Aerated and vigorous shaking culture in 96 deep-well plate)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液 的顏色變化

因96孔深盤養菌盒具有可做大量藥物篩檢(High-throughput) 的優點，故將透氣 (Ventilation)、震盪均勻的條件應用在96孔深 盤養菌盒，以此發展出曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養的方式

-挑菌 (in 15mL離心管) 37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養 轉型作用 (on plate)

37℃ 隔夜培養

Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時

加入適量IPTG+X gal(in 錐形瓶) 37℃ 225 r.p.m. 觀察顏色變化

透氣養菌盒、斜角三十度震盪。取適量質體做細菌之轉型作用後 取部分菌液塗於(LB+Amp)的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出 平板培養基上的菌落養在3mL的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉 移到30mL的(LB+Amp)中或將166μl菌液轉移到5mL的(LB+

Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶或5ml in 50ml錐形 瓶]，以37℃、225r.p.m.培養2-3小時。而後加入適量IPTG與X gal 均勻混合並取500μl菌液加到96 deep-well中，以37℃、225r.p.m.

之30度斜角震盪的方式作1、2、3、6、12小時培養並觀察顏色變 化。IPTG測試濃度為0與0.1mM。X gal的濃度為80μg/ml。青黴 素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。

透氣養菌盒 斜角30度震盪

37℃ 225 r.p.m.

斜角30度震盪 轉移500μl菌液到96

孔深盤透氣養菌盒 挑菌 (in 15mL離心管)

37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養 轉型作用 (on plate)

37℃ 隔夜培養

Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時

加入適量IPTG+X gal(in 錐形瓶) _{觀察顏色變化}

(二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析轉型株之重組質體，以便確認轉型 菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制 酵素做切割，pGEX-TBP-Qn-Lac Zα以EcoR V與EcoR I做雙酵素切 割；pGEX-Lac Zα與pUC 18以限制酵素EcoR I切割。

(三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組 蛋白之特性分析(soluble或insoluble)

利用SDS-PAGE與Western Blotting確認重組蛋白有無表現並分析 其水溶性 (soluble)。各個質體表現出來之蛋白的胺基酸數目與分子量 大小如下表。

重組質體 蛋白 胺基酸數(個) 預測分子量(kDa)

pUC 18 Lac Zα 106 11.6

pGEX-Lac Zα Lac Zα 106 11.6

pGEX-fTBP20Q-Lac Zα fTBP20Q-Lac Zα 430 47.3 pGEX-fTBP40Q-Lac Zα fTBP40Q-Lac Zα 450 49.5 pGEX-fTBP74Q-Lac Zα fTBP74Q-Lac Zα 484 53.2 pGEX-fTBP109Q-Lac Zα fTBP109Q-Lac Zα 519 57.0 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα tTBP135Q-Lac Zα 525 57.7

使用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 β gal分析之蛋白定量)以收集3mL的菌液，之後用600μl的lysis buffer (100mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM Tris-HCl；pH 7.6)回溶細胞沈 澱物(cell pellet)。在冰浴的條件下用超音波震盪 (sonication)的方式進

行破菌，以震盪20秒、休息20秒的模式重複3次。於4℃ 16000×g離心 上 述 樣 品 20 分 鐘 並 保 留 細 胞 萃 取 液 (supernatant) 與 蛋 白 沈 澱 物 (protein pellet)。將細胞萃取液 (supernatant)與蛋白沈澱物 (protein pellet) 做 蛋 白 質 電 泳 、 西 方 轉 漬 分 析 。 而 後 以 CBB 染 色 觀 察 SDS-polyarylamide gel 中 的 蛋 白 質 分 佈 情 形 或 以 免 疫 染 色 觀 察 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表現情形。

在製備蛋白質電泳的SDS-polyarylamide gel方面，組裝厚度為 1mm的SDS-PAGE膠體模型器具 (Hofer Multiple gel caster SE 200 series)，並以95％酒精測漏。配製分離膠體 (Resolving gel)與焦集膠 體 (Stacking gel)，先加入分離膠並以95％酒精覆蓋、壓平，待分離膠 凝固再加入焦集膠並插上齒梳 (comb)，於室溫靜置30分鐘以上直至 其凝固後即可使用。若SDS-polyarylamide gel沒有立即使用，可做保 濕 處 理 並 於 4 ℃ 冷 凍 保 存 。 本 實 驗 使 用 10 ％ 分 離 膠 體 分 析 pGEX-fTBP/tTBP -Lac Zα大分子重組蛋白，使用15％分離膠體分析 Lac Zα小分子蛋白。

在 細 胞 萃 取 液 (Supernatant) 之 樣 品 處 理 方 面 ， 上 清 液 定 量 (Bradford protein assay)後，取適量萃取液與5×SDS sample buffer混合 均勻，並於100℃沸水中煮5分鐘即可注入樣品槽 (well)中。在蛋白沈 澱物 (protein pellet)之樣品處理方面，加入適量1×SDS sample buffer

並將pellet以超音波震盪 (sonication)的方式重新懸浮後，於100℃沸水 中煮15分鐘而後全部注入樣品槽中。

在蛋白質電泳方面，將製備好的SDS-polyarylamide gel裝置於 SDS-PAGE電泳槽中 (Hofer SE 260)並於電泳槽中注入1×SDS running buffer (Tris 24.9 mM, Glycine 191.8 mM, SDS 3.46 mM )，稍微清洗樣 品槽 (well)並於樣品槽中注入處理好的蛋白萃取液，接上電源後即可 進 行 蛋 白 質 電 泳 。 本 實 驗 於 焦 集 膠 均 使 用 50 福 特 ； 而 針 對 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα大分子重組蛋白之分離膠所使用的電壓為 120福特，Lac Zα小分子蛋白則為80福特。

在CBB染色觀察蛋白質方面，先將跑完的電泳膠片浸於CBB染劑 (0.2％ CBB-R250, 45.5％甲醇Methanol, 9％醋酸Acetic acid)中並於室 溫下以60r.p.m.搖洗30分鐘，而後移除CBB染劑並加入退染液 (20％

甲醇Methanol, 10％醋酸Acetic acid)於室溫下以60r.p.m.搖洗至膠片無 蛋白質處的顏色接近透明。之後再以攝相系統照相存檔。

分離膠體(Resolving gel)之建議配製方法(兩片膠量)

膠體終濃度(Gel final conc.) 5％ 7.5％ 10％ 12.5％ 15％

40％ Acrylamide solution 2.5ml 3.75ml 5ml 6.25ml 7.5ml 4×Resolving gel buffer (pH 8.8) 5ml

10％ SDS 0.2ml

10％APS(Ammonium persulphate) 0.1ml

TEMED 27μl

ddH2O 12.2ml 10.95ml 9.7ml 8.45ml 7.2ml

總體積(Total volume) 20ml

4×Resolving gel buffer：1.5M Tris，pH 8.8

4％焦集膠體(Stacking gel)之建議配製方法(兩片膠量)

膠體厚度(Gel thickness) 0.75mm 1.0mm 1.5mm 40％ Acrylamide solution 0.33ml 0.5ml 0.66ml 4×Stacking gel buffer (pH 6.8) 0.84ml 1.25ml 1.67ml

10％ SDS 33μl 50μl 66μl

10％APS(Ammonium persulphate) 16.7μl 25μl 33.4μl

TEMED 4.2μl 6.2μl 8.2μl

ddH2O 2.13ml 3.17ml 4.27ml

總體積(Total volume) 3.3ml 5ml 6.7ml

4×Stacking gel buffer：0.5M Tris，pH 6.8

蛋白質分離建議使用Acrylamide濃度

分子量(Molecular weight, kD) ％Acrylamide in resolving gel

36-205 5％

24-205 7.5％

14-205 10％

14-66 12.5％

14-45 15％

5×SDS sample buffer

Glycerol 5ml

SDS 1g

β-mercapto Ethanol 2.56ml

0.5M Tris(pH 6.8) 2.13ml

Bromophenol Blue 8mg

總體積(Final volume) 10ml

5×PBS (for Western Blotting)

KCl 4g

NaCl 160g

KH₂PO₄ 4g

Na2HPO4(或Na2HPO4．2H2O) 23g(或28.8g)

總體積(Final volume) 4 liter

pH調到7.4後滅菌

在西方轉漬 (Western Blotting)方面，將轉漬電泳槽 (Hofer TE 22) 注入Transfer Buffer (12mM Tris, 96mM Glycine, 20％Methanol)，並預 先以100％甲醇浸潤0.45μm孔徑之PVDF纖維膜 (PVDF membrane, Perkinelemer, Waltham, Massachusetts, U.S.A.)、以Transfer Buffer浸潤 濾紙 (Whatman 1001 929, Maidstone, Kent, U.K.)與海棉片。由下而上 依序堆疊海綿片、濾紙、PVDF纖維膜、SDS-PAGE膠片、濾紙、海 綿片，並以轉漬夾固定。將轉漬夾浸入轉漬電泳槽中並使SDS-PAGE 膠片朝向負極，以固定電壓120福特電泳90分鐘以上，將電白質轉漬 到PVDF纖維膜上。轉漬結束後取出轉漬夾，拆開後將PVDF纖維膜取 出置於含有Blocking solution (5％安佳脫脂奶粉 in 60mL 1×PBS)之塑 膠盒中，於室溫下以60r.p.m.搖洗2小時或於4℃下搖洗過夜。移除 Blocking solution 並 以 Wash Buffer (10mM Tris pH 8.0, 0.05 ％ Tween-20)搖洗2次，每次15分鐘。將PVDF纖維膜夾出放置於水平的 石臘膜上，於PVDF纖維膜上滴上以稀釋液 (1％安佳脫脂奶粉- 0.05

％ Tween-20)稀釋5000倍的1C2一級抗體 (Mouse Anti-polyglutamine monclonal antibody；Chemicon, Rosemont, Illinois, U.S.A.) (Lescure et al., 1994)，在室溫下作用2小時後，以Wash Buffer搖洗3次，每次10 分鐘。之後再滴上以稀釋液 (1％安佳脫脂奶粉- 0.05％ Tween-20)稀 釋5000倍的HRP共軛的二級抗體複合物 (Goat Anti-Mouse IgM, µ

chain specific；Jackson, Pennsylvania, U.S.A.)，室溫下作用2小時後，

以Wash Buffer搖洗3次，每次10分鐘。將膜取出，平置於玻璃片上，

滴上受質 (VisGlow^TMChemiluminecent substrate, HRP；Visual Protein, Taipei, Taiwan)並以冷光攝相系統照相存檔。依據冷光呈色結果判斷 TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白是否有凝集沈澱 (Aggregation)的現象。

(四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay)：重組蛋白之水溶 性(soluble)分析

因位於細胞萃取液(supernatant)的蛋白為水溶性 (soluble)，位於 沈澱物 (pellet)的蛋白為非水溶性 (insoluble)且ONPG可被β gal分解 而呈黃色並於波長420nm有強吸收，若重組蛋白為水溶性 (soluble)則 取萃取液(supernatant)偵測後吸光值(O.D.₄₂₀)較高，若重組蛋白為非水 溶性 (insoluble)則取萃取液(supernatant)偵測後吸光值 (O.D.₄₂₀)較低。

利用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 β gal分析之蛋白定量)所得的細胞萃取液定量 (Bradford protein assay)後加入ONPG觀察呈色並測量吸光值(O.D.420)。

在Z buffer (0.1M NaH2PO4；15mM MgSO4；75mM KCl；5mM β

Product (yellow) 可吸收波長420nm的光

-mercaptoethanol；pH 7)與ONPG受質溶液 (濃度為13.3mM in Z-buffer) 配製方面，先配製10ml的1M NaH2PO4貯存液 (stock)、10ml的0.15M MgSO4貯存液、10ml的0.75M KCl，從三個貯存液中各取4ml與14μl 的β-mercaptoethanol (密度1.12)均勻混合並以二次水補至總體積為 40ml和調整pH至7，此即完成Z buffer的配製。將40mg (0.04g)的ONPG 粉末溶於10ml的Z buffer即完成ONPG受質溶液的配製。

取50μl細胞萃取液 (Protein extract)與450μl的Z buffer混合後以 37℃預熱5分鐘，反應開始時加入100μl的受質ONPG

取50μl細胞萃取液 (Protein extract)與450μl的Z buffer混合後以 37℃預熱5分鐘，反應開始時加入100μl的受質ONPG

在文檔中 脊髓小腦運動失調症第十七型：微生物模型之藥物篩選 (頁 28-46)