脊髓小腦運動失調症第十七型：微生物模型之藥物篩選

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 脊髓小腦運動失調症第十七型：微生物模型之藥物篩選 Screening of novel molecules for SCA 17 treatment by using a microbial model. 研究生：史哲. 維. Che-Wei Shih. 指導教授：李冠. 群. 博士. Dr. Guan-Chiun Lee 中華民國九十八年八月.

(2) 致謝兩年的時光飛逝，本篇論文也在這忙碌的歲月中完成，在此非常感謝所有老師的指導。首先是感謝我的指導教授李冠群老師，您不僅在我的實驗上提供許多新穎的想法與見解，也在技術上給予許多的指導，讓我避開實驗上可能犯的錯誤。實驗當然不總是符合自己的預期結果 - 這是我很深的體會，當實驗陷入瓶頸、一直無法解決的時候，心情也會沮喪到幾乎想放棄，還好有老師您不斷給我鼓勵與安慰，並且積極幫我尋找問題的解答，使實驗又燃起一線生機，真的非常感謝老師的幫忙。感謝李振綱老師在百忙之中撥冗擔任我的口試委員，並提供我不同的思考方向。同時感謝蘇銘燦老師針對我論文內文的缺漏給予適時的指正並提供許多寶貴的意見讓我茅塞頓開。感謝師大生科所的每一位老師，有您的指導，實驗才能順利完成。回顧研究生兩年的歲月，真的都是在忙碌中度過，在這一成不變的日子裡，還好有 NDG、D309b 與其他實驗室大夥們的的陪伴，大家都會互相加油打氣、一起吃飯聊天，讓我無時無刻備感溫馨。大家有著共同的目標、並為此目標共同打拼、奮戰到最後。首先感謝 D309b 的夥伴，像是麗芬、亭君、曉蓉、啟翔、學樺、資陵、紘綸，謝謝你們時常在實驗上協助我。可愛的學妹 – 欣嵐，要加油喔！大學部學妹 - 玉婷、幸娟，真的很高興能在這裡遇見你們。感謝 NDG 的李姊、志信學長、柏安學長、俊彥學長、士寰學長、慧茹學姊等提供許多寶貴的意見讓我能克服種種難關。感謝淑婷、超凡、孝修、仁華學姊等在西方轉渍技術上給予指導與協助。感謝超凡、政霖以及 D307 的夥伴們在實驗上提供許多協助與鼓勵。感謝好友祐臣、孝修的大力幫忙讓我能順利度過這兩年的研究生生活。最後要感謝的是我的家人，沒有你們在背後默默支持與鼓勵，我可能無法堅持到最後。在我不順利、心情沮喪時，你們總是及時給予心靈上安慰，讓我感到無比窩心，讓我又有勇氣去面對、克服難關。這兩年使得我與家人的情感更加緊密，家人在我心中更加重要。實驗固然很多瓶頸、難關，實驗固然辛苦，但從中也學到了不少東西。實驗將我們的耐性與韌性磨練的更紮實，並訓練我們解決問題的能力。千錘百鍊之後，讓我更有勇氣、更有把握去面對下一個挑戰。.

(3) 目錄目錄……………………………………………………………………..Ι 表目錄……………………………………………………………….….Ⅳ 圖目錄……………………………………………………………….….Ⅳ 摘要……………………………………………………………………..Ⅵ Abstract………………………………………………………….………Ⅷ 壹、緒論(Introduction)……………………………………………………1 一、脊髓小腦運動失調症 (SCA) ………………………………...1 二、藥物開發及藥物篩檢模式……………………………………3 三、 β半乳糖苷酶的結構互補性應用……………………………4 貳、研究目的……………………………………………………………..7 參、研究材料與方法(Material and Method)…………………………….8 一、人類全長 TBP(fTBP)之 cDNA 的取得...……………………8 二、重組質體之建構.…………………………………………….8 (一)pGEX-fTBP-20Q-lac Zα、pGEX-fTBP-40Q-lac Zα 重組質體..8 (二)pGEX-fTBP-74Q-lac Zα、pGEX-tTBP-135Q-lac Zα重組質體..……………………………………………………………11 (三)pGEX-fTBP-109Q-lac Zα重組質體…………………………12 (四)pGEX-lac Zα重組質體………………………………………13. I.

(4) 三、質體轉型、DNA 電泳分析及定序………………………..13 (一)大腸桿菌勝任細胞之製備………………………...……..14 (二)細菌之轉型作用-熱休克………………………………....15 (三)DNA 電泳分析……………………………………………15 (四)DNA 定序………………………………………………....15 四、 DNA 製備與純化…………………………………………...16 (一)質體 DNA 小量製備……………………………………...16 (二)純化 DNA 片段…………………………………………...17 五、各重組質體於細菌內的表現………………………………17 (一)表現型分析：藍白篩選…………..……………………….18 (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析….…24 (三)蛋白質電泳與西方轉漬分析…………………………….24 (四)β半乳糖苷酶活性分析………………………………….30 六、藥物篩選………………………………………………………32 (一)表現型分析：藍白篩選…………………………………...32 (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析….....33 (三)蛋白質電泳與西方轉漬分析……………………………33 (四)β半乳糖苷酶活性分析…………………………………34. II.

(5) 肆、結果(Result)………………………………………………………...35 一、定序完成之重組質體限制酶圖譜分析…………………....35 二、各重組質體於細菌內的表現情形…………………….…...36 (一)表現型分析：藍白篩選……………….………………..36 (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析……41 (三)蛋白質電泳與西方轉漬分析…………………………....41 (四)β半乳糖苷酶活性分析……………………………...….42 (五)高濃度 IPTG 干擾藍白篩選結果………………………..43 (六)微生物模型挑選結果………………………………...….44 三、藥物篩選………………………………………………….…...44 (一)表現型分析：藍白篩選……………………………......…44 (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析……45 (三)蛋白質電泳與西方轉漬分析…………………………....45 (四)β半乳糖苷酶活性分析……………………………...….46 伍、討論(Discussion)……………………………………………………47 一、各種培養方式之比較………………………………………....47 二、高濃度 IPTG 干擾藍白篩選結果………………………..…….48 三、有氧與無氧對蛋白表達的差異……………………...…….…49 四、不同重組質體於 JM109 中蛋白表達情形(西方轉渍分析)與呈. III.

(6) 色表現型之間的關係…………………………………….......49 五、大腸桿菌與藥物通透性…………………….………….……..51 六、 pUC 18 與 pGEX-lac Zα蛋白表現的差異…………...…..…51 陸、參考文獻(References)………………………………………………52. 表目錄表一、錐形瓶震盪培養之藍白呈色情形………………………………55 表二、改良式 96 孔深盤養菌盒震盪培養之藍白呈色情形…………...56. 圖目錄圖一、pGEX-GST-fTBP20/40Q 之重組質體…………………………...57 圖二、pGEX-fTBP/tTBP-lac Zα與 pGEX-lac Zα重組質體………….58 圖三、各重組質體之限制酶圖譜分析 (Not I、EcoR I)………………..59 圖四、各重組質體之限制酶圖譜分析(Bpu10 I 與 Ade I、EcoR V 與 EcoR I)…………………………………………………………..60 圖五、各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(JM109)。…61 圖六、再現性分析 (JM109)……………………………………………62 圖七、微量離心管震盪培養之表現型分析(JM109)…………………..63 圖八、錐形瓶震盪培養之表現型分析(JM109)………………………..64. IV.

(7) 圖九、錐形瓶震盪培養之表現型分析(時間點觀測)(JM109)...……….66 圖十、曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養(JM109、XL1-Blue)………….68 圖十一、曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養(Top 10、DH5α)………….69 圖十二、曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養(Rosetta blue、KRX)…….70 圖十三、曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養之西方轉漬分析…………71 圖十四、JM109之β gal分析…………………………………………….74 圖十五、高濃度IPTG干擾藍白篩選結果……………………………...75 圖十六、JM109之藥物篩選 (表現型分析- 海藻糖、剛果紅)…..…….76 圖十七、JM109 之藥物篩選 (Western Blotting)………………………77 圖十八、JM109 之藥物篩選 (β gal 分析- 海藻糖)……………...…….78 圖十九、JM109 之藥物篩選 (β gal 分析- 剛果紅)..….……………….79 圖二十、JM109 之藥物篩選 (表現型分析- Tween 80 與海藻糖雙重處理)……………………………………………………………………….80. V.

(8) 摘要. 目前已知道有十種遺傳性神經退化疾病為多麩醯胺 (polyglutamine, poly-Q)相關的疾病，其中第十七型脊髓小腦萎縮症 (SCA 17)，起因於染色體 6q27 位置上的 TBP 基因之轉譯區中，發生 CAG 三核苷酸重複擴增所導致。因此 SCA17 的可能分子致病機制為：突變的 TBP 蛋白質上具有延長的 poly-Q 片段，導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，最後形成不溶性的包涵體，因而造成細胞死亡。已知在活體 (in vivo)和試管內 (in vitro)實驗中也可以發現，抑制錯誤延長性 poly-Q 片段的蛋白聚集，可以抑制 poly-Q 相關疾病的產生。本研究建立 TBP-Lac Zα 融合蛋白於大腸桿菌中的表達系統，藉由β半乳糖苷酶之α互補作用，建構出微生物快速藥物篩選系統，以期加速相關藥物的開發。質體建構方面，是以 pGEX 質體為基礎建構數種蛋白表達質體，包括帶有不同延長 poly-Q 的 pGEX-TBP-lac Zα以及 pGEX-Lac Zα重組質體。蛋白表達方面，將相關質體轉型至數種大腸桿菌 (E. coli)，以藍白篩選的方式，找出合適的菌種與表達條件，用以表達可溶性的短延長 TBP 蛋白 (培養液呈藍色)、及不可溶性長延長 TBP 蛋白 (培養液呈白色)。利用表現型分析、基因型分析、蛋白質電泳、西方轉漬分析以及β半乳糖苷酶活性分析，確立藥物篩選系統的可行性. VI.

(9) 並驗證之。結果發現 JM109 大腸桿菌表達系統符合篩藥條件 (即 pGEX-Lac Z α 呈藍色、 pGEX-fTBP40Q-Lac Z α 呈白色 ) ，故 pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109 可以作為篩藥模式。藥物篩選方面，目前以具有潛力之藥物 (例如海藻糖與剛果紅)做測試，結果發現這兩種藥物似乎無法抑制不可溶性長延長 TBP 蛋白凝集。本篇論文提供一種可以大量快速進行 SCA17 藥物篩檢的微生物模式，新穎的合成藥物仍在持續篩檢中，以找出有效抑制不可溶性長延長 TBP 蛋白凝集之藥物以供細胞及動物模式做進一步的藥物測試。. VII.

(10) Abstract. Many neurodegenerative diseases are linked to abnormally expanded CAG repeats in the coding regions of responsible genes. One of them, spinocerebellar ataxia type 17 (SCA 17) was identified with CAG trinucleotide repeat expansion in the TATA-box binding protein (TBP) gene on chromosome 6q27. The possible molecular pathogenic mechanisms of SCA17 could be aggregation caused by mutant TBP with expanded polyglutamine strentches and dysfuction of transcriptional regulation by loss of function. Although the detail pathogenic mechanism is unknown in poly-Q disease, inhibition of aggregation is effective to protect cell in vitro and in vivo. In this study, an E. coli. expression system was established to express the TBP-Lac Zα fusion proteins. By structural α complementation of β Galactosidase ( β Gal), we anticipate this system could be a bacterium-based model for rapid drug screening to inhibit protein aggregation. In plasmid construction, we used pGEX plasmid to construct several protein expression vectors including those harboring TBP-Lac Zα fusion genes with various length of polyQ tract and pGEX-Lac Zα. In protein expression, several E. coli. strains were tested to express these recombinant proteins by blue-white screening, and expression conditions were obtained to express soluble short poly-Q TBP as blue color culture, and aggregated long poly-Q TBP as white color culture. We validated this drug screening system by phenotypic screening, genotyping, SDS-PAGE, Western blotting and β gal activity VIII.

(11) assay. The result showed that JM109 E. coli. expression system can express pGEX-Lac Zα as blue color culture and pGEX-fTBP40Q-Lac Z α as white color culture. We used pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109 as drug screening model. In drug screening, several candidate drugs capable of inhibiting poly-Q protein aggregation (such as trehalose and congo red) were tested to prevent TBP aggregation. The results show that trehalose and congo red can not inhibit long poly-Q TBP aggregation by blue-white screening. This study could provide a high-throughput microbial drug screening system.. IX.

(12) 壹、緒論(Introduction). 一、脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxia) 脊髓小腦運動失調症 (Spinocerebellar ataxia；SCA)，簡稱小腦萎縮症 (Spinocerebellar Atrophy)，為一種體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病 (autosomal dominant neurodegenerative disease)，即體內只要存在有SCA致病之任一等位基因 (allele)便有可能發病。罹患此疾病的患者小腦、腦幹和脊髓會產生退化性萎縮並出現平衡與運動失調的症狀[1]。顯性小腦萎縮症 (Autosomal Dominant Cerebellar Ataxias, ADCAs)為一群遺傳性神經退行性疾病之總稱，其多肇因於小腦、脊髓、腦幹等處的神經退化，昔日稱為橄欖核橋腦小腦萎縮症 (olivopontocere- bellar atrophy, OPCA)，依照臨床症狀可以區分為三大類，第一類 (ADCA type I)最常見，發病年齡在青壯年，除了小腦出現病徵之外，還會出現一些中樞及週邊神經的問題，患者會有智力退化、眼球快速轉動、步態不穩、視覺退化等症狀，SCA1~4、SCA8、 SCA12 與SCA17等脊髓小腦萎縮症均屬於此類。第二類 (ADCA type II)患者可能在十歲前就發病，除了小腦方面的病徵之外，還會有眼部肌肉運動不協調的情形發生，多有漸進式的肌肉退化、視網膜退化、. 1.

(13) 聽力喪失等現象，此型肌肉萎縮症屬於早發型 (anticipation)，如 SCA7。第三類的顯性小腦萎縮症 (ADCA type III)，症狀僅發生在小腦，且較晚出現肌肉萎縮僵硬症狀，如SCA5、SCA6、SCA10、SCA11、 SCA14等型[2,3]。在台灣地區以ADCA type I最常見，其中SCA1佔有 1.7%，SCA2佔有8.6%，而SCA3 (MJD)佔有24%，不同族群其分佈比例大不相同，不過仍以SCA3最普遍[4]。. 症狀. ADCA type I. ADCA type II. ADCA type III. 小腦病徵與其. 症狀與 type I 類似. 只有小腦病徵且較晚. 他中樞或週邊. 但為早發型. 出現肌肉萎縮症狀. SCA7 等. SCA5、SCA6、. 神經病變代表. SCA1~4、SCA8 、SCA12 與 SCA17. SCA10、SCA11、. 等. SCA14 等. 小腦萎縮症 (SCA)目前已被歸納出 20 多型以上，如 SCA1-27 及齒狀紅核蒼白球肌萎縮症 (DRPLA)等，致病原因與特定基因之核苷酸重複序列擴增 (nucleotide repeat expansion)有關的有 SCA1–3、 SCA6–8、SCA10、SCA12 與 SCA17，且這幾型多與 CAG 三核苷酸重複序列擴增 (trinucleotide repeat expansion)有關[5]。CAG 三核苷酸所對應的胺基酸是麩胺酸 (Glutamine；Q)，故 CAG 三核苷酸重複序列區域經由轉錄、轉譯出帶著一條多麩醯胺長鏈 (Poly-Q tract)的蛋白質，若 CAG 三核苷酸重複序列區域有擴增的現象，則帶有異常麩胺 2.

(14) 酸長鏈的蛋白質可能產生神經毒性，進而使神經細胞死亡，造成神經退化 (neurodegeneration)的病徵[6,7]。第十七型脊髓小腦運動失調症 (SCA17)的病因為 TBP (TATA binding protein)基因之 poly-Q 的 CAA/CAG repeat 異常導致小腦之 Purkinje cell 之細胞核內會有蛋白質凝集沈澱 (protein aggregation)的現象，並形成包涵體 (inclusion body)而影響 TBP 蛋白的正常功能，進而造成神經細胞的病變或死亡。正常人之 CAA/CAG repeat 約在 25-42 個之間，病人則多為 42 個以上。TBP 之 poly-Q 位於 TBP 蛋白的 N 端，此區域多與其他轉錄因子結合，主要功能為 protein-protein interaction，C 端則為 DNA 結合片段 (DNA binding domain)並具有高度保守性。在臨床病徵上除了小腦萎縮外，也併發失智、帕金森相關症狀、肌張力不全等。. 二、藥物開發及藥物篩檢模式目前發展多麩醯胺 (polyglutamine, poly-Q)相關疾病藥物的方向上大致上可分成：減緩多麩醯胺蛋白聚集傾向、影響基因轉錄調控、抑制細胞凋亡 (Apoptosis)、增進粒線體功能、抗興奮性及粒線體相關藥物、抗發炎及抗氧化壓力、神經營養分子、以及transglutaminase 抑制劑的藥物。由於杭廷頓氏舞蹈症的致病原因與SCA17類似，故許. 3.

(15) 多治療杭廷頓氏舞蹈症的藥物均可用來作為我們測試的標的。如剛果紅 (congo red) 、海藻糖 (trehalose) 等藥物可減緩蛋白凝集沈澱 [8,9,10,11]。有些研究發現投予杭廷頓氏舞蹈症小鼠2%海藻糖，可減少包涵體的形成及神經細胞的死亡，改善其運動功能。有關多麩醯胺藥物篩檢研究，在細菌方面已有許多研究將欲表現的基因接在pGEX系列質體上，表達出GST (glutathione-S-transferase) 後面接有多麩醯胺的重組蛋白，再將蛋白純化出來以便從事試管內 (in vitro)蛋白聚集實驗 [12,13,14]。另外亦有利用細胞表現多麩醯胺片段後面接綠螢光蛋白，利用綠螢光蛋白作為觀察藥物作用的指標實驗 [15,16,17]。所以就細菌之藥物篩檢模式而言，多以破菌、萃取蛋白的方式做試管內分析，需要較繁瑣的實驗步驟以及較長的時間，在細胞內直接偵測蛋白凝集現象的方法則較少被研究，同時，目前亦尚未研發出針對SCA17的致病蛋白TBP之藥物篩檢模式。. 三、β半乳糖苷酶的結構互補性應用(structural complementation of β gal) β半乳糖苷酶 (β Galactosidase；β gal)的α互補作用 (α complementation)已被廣泛被應用在基因選殖技術上 (即所謂的藍白篩選blue-white screening)，這是將β半乳糖苷酶的lac Zα片段由質體. 4.

(16) 表達，若此片段的蛋白在功能上能正確地表達出來，則可以與特殊大腸桿菌宿主的染色體表達出來的lacZ M15片段結合，在結構上達成互補而表現出具有活性的β半乳糖苷酶，而互補是否成功則可由該酵素催化呈色反應之活性來判斷。將lac Z α 融合在目標蛋白 (target protein)的C端後，藉由α互補作用的原理可快速偵測目標蛋白之溶解度 (solubility)變化，並推測目標蛋白是否有凝集沈澱 (aggregation)的現象[18]。W. Christian Wigley等人曾利用此原理來偵測蛋白的溶解度變化(如下圖) [18]，Andrew E. Nixon等人利用α互補作用的原理來判斷mutagenized hybrid glycinamide ribonucleotide (GAR) transformylase 突變種的溶解度[19]。Smeyne RJ等人也曾用α互補作用來進行神經解剖學的分析[20]。本研究計畫將融合lac Zα在TBP蛋白上，以作為 marker protein，可快速偵測TBP蛋白之溶解度 (solubility)變化，並推測 TBP 是否也有凝集沈澱 (aggregation) 的現象。若 TBP為水溶性 (soluble)，由於無凝集沈澱的現象故不影響lac Zα的功能，菌落含有 X gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)的培養基上呈現藍色；不正常TBP蛋白為非水溶性 (insoluble)，則凝集沈澱的現象便會發生，連帶影響lac Zα的功能使菌落呈白色。此技術可推廣到所有與蛋白凝集有關的疾病上，正常人的目標蛋白無凝集沈澱的現象故不影響lac Zα的功能，菌落呈藍色；罹病的人. 5.

(17) 由於其目標蛋白凝集沈澱而導致摺疊錯誤 (misfolding)，連帶影響lac Zα的功能，菌落呈白色。藉由α互補作用的現象是否發生，可以用來進行快速的藥物篩選，若某藥物能使白色菌落變為藍色，則表示此藥物可抑制蛋白凝集，故此藥物能被期待用來減緩疾病的症狀。. [18]. 6.

(18) 貳、研究目的. 許多神經退化性疾病大多與某蛋白之凝集沈澱 (aggregation)的有關，目前藥物篩選方式大多經由蛋白質萃取、與藥物作用、蛋白質溶解度分析 (如 SDS-PAGE)等步驟，篩選出能使蛋白水溶性增加的藥物，此步驟較為曠日費時，故本研究希望藉由 TBP 與 marker protein 融合技術 (fusion technique)，建立可以大量且快速之藥物篩選方式，也期待能加速相關疾病之藥物研發與臨床試驗。本研究以β半乳糖苷酶的α互補作用為原理建立 SCA17 藥物篩檢的微生物模式，目前已得到呈白色之不可溶性長延長 TBP 蛋白pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109，可作為篩藥模式。海藻糖與剛果紅經測試後似乎無法抑制不可溶性長延長 TBP 蛋白凝集。新穎的合成藥物仍在持續篩檢中，以找出有效抑制不可溶性長延長 TBP 蛋白凝集之藥物以供細胞及動物模式做進一步的藥物測試。. 7.

(19) 參、研究材料與方法(Material and Method). 一、人類全長TBP (fTBP)之cDNA的取得本研究所使用的人類全長且含不同長度 poly-Q之 TBP-20Q及 -60Q的cDNA來自於本系所李桂楨老師實驗室，該cDNA已預先選殖於pGEX-5x-3質體 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中並接於GST基因片段之後 (圖一)，並經由DNA電泳與定序確認無誤。TBP-20Q代表此基因轉譯出來的TBP蛋白內含20個Glutamine (簡稱Q)，TBP-60Q則代表轉譯出來TBP蛋白內含60個Glutamine (簡稱Q)。. 二、重組質體之建構以pGEX-5x-3質體為載體 (vecor)，建構不含GST基因片段之TBP 相關重組質體。重組包括pGEX-fTBP20Q-Lac Zα、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα、pGEX-fTBP74Q-Lac Zα、pGEX-fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα、pGEX-Lac Zα，建構如下：. (一)pGEX-fTBP-20Q-lac Zα、pGEX-fTBP-40Q-lac Zα重組質體 pGEX-5X-3質體以Not I (Fermentas, Burlington, Canada)與EcoN I (Fermentas)限制酶切割，切出GST基因部分，取剩餘部份的DNA為載體 (vector)。以pGEX-GST-fTBP20/60Q重組質體為模板，以PCR的方 8.

(20) 式做出全長約1.3kb的fTBP20Q/40Q-lac Zα兩種片段，此PCR產物即為插入片段 (Insert)。插入片段以Not I與EcoN I之限制酶切位接入載體 (vector)中(圖二)。 (1)插入片段(Insert)之建構以 pGEX-GST-fTBP20/60Q 重組質體為模板，設計引子 (forward 5’- gat cag aac aac agc ctg cca cct tac g – 3’；reverse 5’cat ggt cgt cgt ctt cct gaa tcc ctt tag - 3’)，以 PCR 的方式做出全長約 1kb 的 fTBP20Q 與 fTBP40Q，PCR 產物之 3’端並帶有部分 lac Zα序列。反應溶液總體積 50μl，包含 2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase 緩衝液、正向與反向引子、DNA 模板；反應條件為 95℃作用 5 分鐘使 DNA 雙股分開，循環式溫度 (95℃ 50 秒；55℃ 1 分鐘；72 ℃ 2.5 分鐘)作用 30 個循環，最後以 72℃作用 30 分鐘。以 pUC 18 為模板，設計引子 (forward 5’ - cta aag gga ttc agg aag acg acg acc atg att acg aat tcg ag – 3’； reverse 5’ - c agt cag tca cga tgc ggc cgc tta tgc ggc atc aga gca ca – 3’)，以 PCR 的方式做出全長約 0.3kb 的 lac Zα，PCR 產物之 5’ 端並帶有部分 fTBP 序列。反應溶液總體積 50μl，包含 2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase 緩衝液、正向與反向引子、DNA 模板；反應條件為 95℃作用 5 分鐘使 DNA. 9.

(21) 雙股分開，循環式溫度 (95℃ 50 秒；55℃ 1 分鐘；72 ℃ 2.5 分鐘)作用 30 個循環，最後以 72℃作用 30 分鐘。而後再以 fTBP20Q/40Q 與 lac Zα為模板，用 overlapping PCR 的方式做出全長約 1.3kb 的 fTBP20Q/40Q- lac Zα，PCR 產物之 3’端並帶有 NotI 切位。反應溶液總體積 50μl，包含 2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase 緩衝液、正向與反向引子、DNA 模板；反應條件為 95℃作用 5 分鐘使 DNA 雙股分開，循環式溫度 (95℃ 50 秒；60℃ 2.5 分鐘；72 ℃ 2.5 分鐘)作用 45 個循環，最後以 72℃作用 60 分鐘。引子序列 (forward 5’- gat cag aac aac agc ctg cca cct tac g – 3’；reverse 5’ - c agt cag tca cga tgc ggc cgc tta tgc ggc atc aga gca ca – 3’)。 (2)載體(vector)之建構 pGEX-5X-3 質體先以 EcoN I 限制酶切出黏接端，反應條件為 37℃作用 2 小時；再以 Klenow 酵素 (Promega, Madison, WI, USA)補平黏接端，反應條件為室溫(25℃)作用 15 分鐘；而後再以 Not I 限制酶做切割得到最終產物，反應條件為 37℃作用 16-18 個小時。 (3)接合反應(ligation) 加入適量純化的插入片段 (Insert)與載體 (vector)於反應液. 10.

(22) 中混合均勻置於16℃作用16-18個小時，而後置於37℃水浴槽中作用10分鐘終止反應，反應液包含T4 DNA ligase (Promega)與10 ×緩衝液(Promega)。. (二)pGEX-fTBP-74Q-lac Zα、pGEX-tTBP-135Q-lac Zα重組質體首先以pGEX-tTBP60Q-CAT重組質體為模板，設計引子 (forward 5’-ca gta ttc atg tcc cct ata act ccc gga atc cct atc ttt a-3’； reverse 5’- cat ggt cgt cgt ctt cct gaa tcc ctt tag - 3’)，以PCR的方式做出做出全長約 1.3kb的tTBP-lac Zα片段，PCR產物之3’端並帶有部分lac Zα序列。反應溶液總體積50μl，包含2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase緩衝液、正向與反向引子、DNA模板；反應條件為95 ℃作用5分鐘使DNA雙股分開，循環式溫度 (95℃ 50秒；55℃ 1分鐘；72 ℃ 2.5分鐘)作用30個循環，最後以72℃作用30分鐘。之後再以 pGEX-fTBP-20Q-lac Z α 為模板、 tTBP-lac Z α 為長引子，做 Quickchange PCR (Insertion) 而得到 pGEX-fTBP-74Q-lac Z α 、 pGEX-tTBP-135Q-lac Zα兩種重組質體 (圖二)。反應溶液總體積50 μl，包含2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase緩衝液、長引子 (megaprimer)、DNA模板；反應條件為95℃作用5分鐘使DNA雙股分開，循環式溫度 (95℃ 50秒；52℃ 2.5分鐘；68℃ 6. 11.

(23) 分鐘)作用5個循環，而後再循環式溫度 (95℃ 50秒；55℃ 2.5分鐘； 68℃ 6分鐘)作用13個循環，最後以68℃作用30分鐘。PCR反應完成後加入0.5μl之Dpn I (New England Biolab, Ipswich, Massachusetts, U.S.A.)於37℃反應 16-18小時以分解DNA模板 (Template)。. (三)pGEX-fTBP-109Q-lac Zα重組質體 pGEX-fTBP-40Q-lac Zα重組質體以Bpu10 I (Fermentas)與Ade I (別名Dra Ⅲ, Fermentas)兩種限制酵素做切割，切出fTBP-40Q的40Q 基因部分，取剩餘部份的DNA為載體 (vector)。pET109Q重組質體也以Bpu10 I與Ade I兩種限制酵素做切割，切出fTBP-109Q的109Q基因部分，此即為插入片段 (Insert)。插入片段以Bpu10 I與Ade I之限制酶切位接入載體 (vector)中 (圖二)。 (1)插入片段(Insert)之建構 pET109Q重組質體以Bpu10 I與Ade I兩種限制酵素做切割，切出fTBP-109Q的109Q基因部分，此即為插入片段 (Insert)，反應條件為37℃作用24個小時。 (2)載體(vector)之建構 pGEX-fTBP-40Q-lac Zα重組質體以Bpu10 I與Ade I兩種限制酵素做切割，切出fTBP-40Q的40Q基因部分，取剩餘部份的. 12.

(24) DNA為載體 (vector)，反應條件為37℃作用16-18個小時。 (3)接合反應(ligation) 加入適量純化的插入片段 (Insert)與載體 (vector)於反應液中混合均勻置於16℃作用16-18個小時，而後置於37℃水浴槽中作用10分鐘終止反應，反應液包含T4 DNA ligase與10×緩衝液。. (四)pGEX-lac Zα重組質體以 pGEX-fTBP-40Q-lac Zα重組質體為模板，設計引子 (forward 5’ – c aca cag gaa aca gta ttc atg acc atg att acg aat tcg agc – 3’；reverse 5’ - gct cga att cgt aat cat ggt cat gaa tac tgt ttc ctg tgt g – 3’)，以 Quickchange PCR (Deletion)的方式做出只包含有 lac Zα的 pGEX-lac Zα重組質體 (圖二)。反應溶液總體積 50μl，包含 2.5mM dNTP、pfu DNA polymerase、pfu DNA polymerase 緩衝液、正向與反向引子、DNA 模板；反應條件為 95℃作用 5 分鐘使 DNA 雙股分開，循環式溫度 (95 ℃ 50 秒；60℃ 2.5 分鐘；68 ℃ 16 分鐘)作用 20 個循環，最後以 68 ℃作用 30 分鐘。PCR 反應完成後加入 0.5μl 之 Dpn I 於 37℃反應 16-18 小時以分解 DNA 模板 (Template)。. 三、質體轉型、DNA電泳分析及定序各重組質體轉型進入大腸桿菌 (E. coli.)之DH5 α (GeneMark, 13.

(25) Tainan, Taiwan)菌種，經由DNA電泳分析與定序挑出含有正確序列重. 組質體的DH5α菌株並將該菌株作冷凍保存。. (一)大腸桿菌勝任細胞(E. col. Competent cell)之製備接種大腸桿菌菌液100μl到3mL的LB培養液 (10 g/l tryptone - 5 g/l yeast extract - 10 g/l NaCl)或(LB+Antibiotics)培養液中，於37oC、225 r.p.m. 做隔夜培養。之後取 1 mL 菌液加到 30mL 的 LB 培養液或 (LB+Antibiotics)培養液中，於37oC、225 r.p.m.培養2-3小時直到O.D.600 ≒0.6。冰上培養10分鐘後，4℃、956×g 離心10分鐘以沈澱細胞並棄去上清液；之後再加入30mL預冷之 0.1 M CaCl2並以搖晃的方式懸浮細胞。冰上培養30分鐘後，4℃、956×g 離心10分鐘以沈澱細胞並棄去上清液；最後加入2mL預冷之0.1 M CaCl2並分裝，微量離心管中每管均含有200μl的勝任細胞菌液。之後置於4℃、12小時以上即可進行轉型，此時轉型效率最好。剩餘勝任細胞可添加80﹪Glycerol並於 -80 oC冷凍保存備用，可保存一年。菌種 DH5α(GeneMark) XL-1 blue JM109 Top 10 Rosetta blue KRX (Promega). 抗生素與其篩選濃度無無無無 Cm(Chloramphenicol)：34μg/mL或25μg/mL Tet(Tetracycline)：12.5μg/mL 無. 14.

(26) (二)細菌之轉型作用(Transformation)-熱休克(heat shock) 取適量重組質體DNA與上述製備完成的勝任細胞混合均勻後於冰上培養30分鐘，而後於42℃熱休克2分鐘，再冰上培養2分鐘。加入 600μl之LB培養液於37oC、225 r.p.m.震盪培養1小時後，取100μl塗於含有50 µg/ml青黴素 (Ampicillin)的LB培養基中，最後以滅過菌的玻棒將菌液均勻塗抹，並將培養皿置於37oC培養箱中培養16~18小時。. (三)DNA電泳分析以牙籤挑出前述轉型作用生長出的單一菌落並養在3mL的(LB+ Amp)培養液中於37oC、225 r.p.m.做隔夜培養，而後用Plasmid Miniprep Purification Kit (GeneMark, Tainan, Taiwan)將質體抽出。取適量質體與限制酵素均勻混合後於37℃作用2小時，之後加入適量6× DNA loading dye做DNA電泳分析。 DNA 片段＜0.5 kb 0.5 kb – 10 kb ＞10 kb. DNA Agarose gel 配製方法 Agarose濃度 1.2 - 1.5％ 0.8 - 1％ 0.3 - 0.7％. Agarose回溶於1× TAE buffer (GeneMark). (四)DNA定序經DNA電泳分析後挑出DNA片段大小吻合的重組質體送台灣師. 15.

(27) 範大學生命科學系生態多樣性實驗室及源資國際生物科技股份有限公司做序列比對與確認。. 四、DNA製備與純化. (一)質體DNA小量製備使用Plasmid Miniprep Purification Kit (GeneMark, Tainan, Taiwan) 做質體DNA小量製備。以牙籤挑出前述轉型作用生長出的單一菌落並養在3mL的(LB+Amp)培養液中於37oC、225 r.p.m.做隔夜培養，而後 14,000×g離心1分鐘，除去上清液。加入200μl的solution I並劇烈震盪 (vortex)至均質，加入200μl的solution Ⅱ溫和翻轉 (Invert)微量離心管數次，而後加入200μl的solution Ⅲ溫和翻轉 (Invert)微量離心管數次，以14,000×g離心15分鐘沈澱細胞碎片。組裝spin column與collection tube後，取含有核酸的上清液到spin column中、14,000×g離心1分鐘，棄去廢液；加入600μl的washing solution、14,000×g離心1分鐘，棄去廢液；再加入600μl的washing solution、14,000×g離心8分鐘，棄去廢液。將spin column轉移到新的微量離心管中，加入適量(50μl)高溫(65 ℃)滅菌水於spin column並等待2分鐘等膜吸收水分，14,000×g離心4 分鐘，即完成質體DNA小量製備。. 16.

(28) (二)純化DNA片段上述DNA片段經含EtBr (Ethidium bromide) (0.25 µg/ml)的洋菜膠電泳分離後，在紫外光標示下切下所要的片段，置於1.5 ml微量離心管中，使用DNA clean-up/extraction kit (GeneMark, Tainan, Taiwan)做 DNA純化。方法為加入適量binding buffer於65℃乾浴槽中培養10分鐘以徹底回溶洋菜膠，組裝spin column與collection tube後，將溶解後的膠體轉移到spin column中、14,000×g離心1分鐘，棄去廢液；加入600 μl的washing solution、14,000×g離心1分鐘，棄去廢液；再加入600 μl的washing solution、14,000×g離心8分鐘，棄去廢液。將spin column 轉移到新的微量離心管中，加入適量(50μl)高溫(65℃)滅菌水於spin column並等待2分鐘等膜吸收水分，14,000g離心4分鐘，即完成DNA 片段純化。. 五、各重組質體於細菌內的表現將相關重組質體轉形至大腸桿菌. (E. coli) 之 DH5 α. (GeneMark)、XL-1 Blue、JM109、Top 10、Rosetta blue與KRX (Promega). 菌種，以IPTG誘導重組蛋白的表現，並做以下的分析以確認重質體的存在、重組蛋白的溶解度與活性的變化情形，以此找出適合篩藥的微生物表達系統。. 17.

(29) Strain (菌種) DH5α XL-1 blue JM109. Top 10. Rosetta blue. KRX. Genotype (基因型) SupE44 ΔlacU169(ψ80 lac ZΔM15) hsdR17 rec A1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIqZΔM15] hsdR17(rK- mK+) endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIqZΔM15] hsdR17(rK-mK+) F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λendA1 hsdR17(rK12– mK12+) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F' proA+B+ lacIqZΔM15 ::Tn10] pRARE2 (CamR,, TetR) [F´, traD36, ΔompP, proA+B+, lacIqZΔM15] ΔompT, endA1, recA1, gyrA96(Nalr), thi-1, hsdR17 (rK–, mK+), e14– (McrA–), relA1, supE44, Δ(lac-proAB),Δ(rhaBAD)::T7 RNA Polymerase. lac ZΔM15：缺乏β gal的胺基端 (amino terminus)編碼序列具有lac ZΔM15的大腸桿菌適宜作為藍白篩選的宿主 (host)。. (一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) 為了找出合適的E. coli菌種與表達條件，用以表達可溶性的短延長TBP蛋白 (培養液呈藍色)、及不可溶性長延長TBP蛋白 (培養液呈現白色)，使用以下方式找尋最佳表現型分析條件。. (1)瓊脂平板培養基分析(Agar plate culture)：觀察(LB+Amp+ IPTG+X gal)平板培養基上菌落的顏色變化取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於 18.

(30) (LB+Amp+IPTG+X gal)的平板培養基上37℃隔夜培養後觀察顏色變化。IPTG與X gal的添加方式有兩種，一為混合後塗在 (LB+Amp) plate上使平板培養基吸收而後再塗菌，本研究取100 μl的0.1 M IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) (Sigma, Saint Louis, MO, U.S.A.)與25μl的50mg/ml X gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl-beta-D-galactopyranoside) (Sigma)混合後塗在培養基上；二為直接做在平板培養基上，本研究(LB+Amp+IPTG+X gal)平板培養基之IPTG最終濃度為1mM、X gal之最終濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。轉型作用 (on plate). 37℃ 隔夜培養. 觀察顏色變化. (2)密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養 (Non-aerated culture in 96 deep-well plate with horizontal shaker)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於(LB+Amp) 的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出plate上的菌落養在3ml的 (LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m.培養2-3小時。而後取250μl菌液加到含有250μl的(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培. 19.

(31) 養液之96 deep-well中，以37℃、225r.p.m.之密閉、水平震盪的方式作12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0、0.1、0.5、 1、5、10mM。X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。. 96孔深盤養菌盒. 貼上密封膠帶. 「水平」震盪. 轉型作用 (on plate). 挑菌 (in 15mL離心管). Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋. 37℃ 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時. 轉移250μl菌液到96孔深盤養菌盒；每個孔洞中. 37℃ 225 r.p.m. 密閉. 含有250μl之(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培養液. 且水平震盪12小時. 觀察顏色變化. 因密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養有再現性差的缺點，為了驗證再現性差可能為震盪不均所造成，使用微量離心管震盪培養(Eppendorf in horizontal shaker)並觀察(LB+Amp+IPTG+ X gal)培養液的顏色變化。取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於(LB+Amp)的平板培養基上 37℃隔夜培養。挑出平板培養基上的菌落養在 3mL 的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml 離心管]，以 37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將 1mL 菌液轉移到 30mL 的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml 錐形瓶]，以 37. 20.

(32) ℃、225r.p.m.培養 2-3 小時。而後取 250μl 菌液加到含有 250μl 的(LB+Amp+IPTG +X gal)新鮮培養液之微量離心管中，以 37 ℃、225r.p.m.「鉛直震盪」12 小時並觀察顏色變化。IPTG 測試濃度為 0、0.1、0.5、1、5、10mM。X gal 的濃度為 80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為 50 µg/ml。為了確認所使用的IPTG濃度對藍白篩選的呈色是否有影響，使用微量離心管震盪培養，並以0.1或10mM IPTG誘導12小時後所萃取出來的細胞萃取液外加相同濃度的IPTG做ONPG呈色反應。. 微量離心管放置在塑膠盒內於培養箱中做「鉛直震盪」轉型作用 (on plate). 挑菌 (in 15mL離心管). Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋. 37℃ 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時. 轉移250μl菌液到微量離心管；每個微量離心管中. 37℃ 225 r.p.m.. 含有250μl之(LB+Amp+IPTG+X gal)新鮮培養液. 鉛直震盪12小時. 觀察顏色變化. 為了探討轉型菌株在震盪均勻及有氧培養條件下，各種 TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表達情況，使用錐形瓶震盪培養 (Flask in horizontal shaker)並觀察(LB+Amp+ IPTG+X gal)培養液. 21.

(33) 的顏色變化。取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於 (LB+Amp)的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出平板培養基上的菌落養在3mL的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37 ℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+ Amp)中或將166μl菌液轉移到5mL的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶或5ml in 50ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m. 培養2-3小時。而後加入適量IPTG與X gal，以37℃、225r.p.m.作1、 2、3、6、12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0、0.1mM。 X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。轉型作用 (on plate). 挑菌 (in 15mL離心管). Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋. 37℃ 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時. 加入適量IPTG+X gal (in 錐形瓶). 37℃ 225 r.p.m. 觀察顏色變化. (3)曝氣式 96 孔深盤養菌盒震盪培養 Aerated and vigorous shaking culture in 96 deep-well plate)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化因96孔深盤養菌盒具有可做大量藥物篩檢(High-throughput) 的優點，故將透氣 (Ventilation)、震盪均勻的條件應用在96孔深盤養菌盒，以此發展出曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養的方式 -. 22.

(34) 透氣養菌盒、斜角三十度震盪。取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於(LB+Amp)的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出平板培養基上的菌落養在3mL的(LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+Amp)中或將166μl菌液轉移到5mL的(LB+ Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶或5ml in 50ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m.培養2-3小時。而後加入適量IPTG與X gal 均勻混合並取500μl菌液加到96 deep-well中，以37℃、225r.p.m. 之30度斜角震盪的方式作1、2、3、6、12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0與0.1mM。X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。. 透氣養菌盒. 斜角30度震盪. 轉型作用 (on plate). 挑菌 (in 15mL離心管). Refresh (in 錐形瓶) 30倍稀釋. 37℃ 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 隔夜培養. 37℃ 225 r.p.m. 2-3小時. 加入適量IPTG+X gal (in 錐形瓶). 轉移500μl菌液到96. 37℃ 225 r.p.m.. 孔深盤透氣養菌盒. 斜角30度震盪. 23. 觀察顏色變化.

(35) (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析轉型株之重組質體，以便確認轉型菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制酵素做切割，pGEX-TBP-Qn-Lac Zα以EcoR V與EcoR I做雙酵素切割；pGEX-Lac Zα與pUC 18以限制酵素EcoR I切割。. (三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組蛋白之特性分析(soluble或insoluble) 利用SDS-PAGE與Western Blotting確認重組蛋白有無表現並分析其水溶性 (soluble)。各個質體表現出來之蛋白的胺基酸數目與分子量大小如下表。重組質體. 蛋白胺基酸數(個) 預測分子量(kDa) Lac Zα pUC 18 106 11.6 pGEX-Lac Zα Lac Zα 106 11.6 pGEX-fTBP20Q-Lac Zα fTBP20Q-Lac Zα 430 47.3 pGEX-fTBP40Q-Lac Zα fTBP40Q-Lac Zα 450 49.5 pGEX-fTBP74Q-Lac Zα fTBP74Q-Lac Zα 484 53.2 pGEX-fTBP109Q-Lac Zα fTBP109Q-Lac Zα 519 57.0 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα tTBP135Q-Lac Zα 525 57.7. 使用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 β gal分析之蛋白定量)以收集3mL的菌液，之後用600μl的lysis buffer (100mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM Tris-HCl；pH 7.6)回溶細胞沈澱物(cell pellet)。在冰浴的條件下用超音波震盪 (sonication)的方式進. 24.

(36) 行破菌，以震盪20秒、休息20秒的模式重複3次。於4℃ 16000×g離心上述樣品 20 分鐘並保留細胞萃取液 (supernatant) 與蛋白沈澱物 (protein pellet)。將細胞萃取液(supernatant)與蛋白沈澱物 (protein pellet) 做蛋白質電泳、西方轉漬分析。而後以 CBB 染色觀察 SDS-polyarylamide gel 中的蛋白質分佈情形或以免疫染色觀察 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表現情形。在製備蛋白質電泳的SDS-polyarylamide gel方面，組裝厚度為 1mm的SDS-PAGE膠體模型器具 (Hofer Multiple gel caster SE 200 series)，並以95％酒精測漏。配製分離膠體 (Resolving gel)與焦集膠體 (Stacking gel)，先加入分離膠並以95％酒精覆蓋、壓平，待分離膠凝固再加入焦集膠並插上齒梳 (comb)，於室溫靜置30分鐘以上直至其凝固後即可使用。若SDS-polyarylamide gel沒有立即使用，可做保濕處理並於 4 ℃ 冷凍保存。本實驗使用 10 ％分離膠體分析 pGEX-fTBP/tTBP -Lac Zα大分子重組蛋白，使用15％分離膠體分析 Lac Zα小分子蛋白。在細胞萃取液 (Supernatant) 之樣品處理方面，上清液定量 (Bradford protein assay)後，取適量萃取液與5×SDS sample buffer混合均勻，並於100℃沸水中煮5分鐘即可注入樣品槽 (well)中。在蛋白沈澱物 (protein pellet)之樣品處理方面，加入適量1×SDS sample buffer. 25.

(37) 並將pellet以超音波震盪 (sonication)的方式重新懸浮後，於100℃沸水中煮15分鐘而後全部注入樣品槽中。在蛋白質電泳方面，將製備好的SDS-polyarylamide gel裝置於 SDS-PAGE電泳槽中 (Hofer SE 260)並於電泳槽中注入1×SDS running buffer (Tris 24.9 mM, Glycine 191.8 mM, SDS 3.46 mM )，稍微清洗樣品槽 (well)並於樣品槽中注入處理好的蛋白萃取液，接上電源後即可進行蛋白質電泳。本實驗於焦集膠均使用 50 福特；而針對 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα大分子重組蛋白之分離膠所使用的電壓為 120福特，Lac Zα小分子蛋白則為80福特。在CBB染色觀察蛋白質方面，先將跑完的電泳膠片浸於CBB染劑 (0.2％ CBB-R250, 45.5％甲醇Methanol, 9％醋酸Acetic acid)中並於室溫下以60r.p.m.搖洗30分鐘，而後移除CBB染劑並加入退染液 (20％甲醇Methanol, 10％醋酸Acetic acid)於室溫下以60r.p.m.搖洗至膠片無蛋白質處的顏色接近透明。之後再以攝相系統照相存檔。. 26.

(38) 分離膠體(Resolving gel)之建議配製方法(兩片膠量) 膠體終濃度(Gel final conc.) 40％ Acrylamide solution. 5％. 7.5％. 2.5ml 3.75ml. 10％ 12.5％ 5ml. 15％. 6.25ml 7.5ml. 4×Resolving gel buffer (pH 8.8). 5ml. 10％ SDS. 0.2ml. 10％APS(Ammonium persulphate). 0.1ml. TEMED. 27μl. ddH2O. 12.2ml 10.95ml 9.7ml 8.45ml 7.2ml. 總體積(Total volume). 20ml. 4×Resolving gel buffer：1.5M Tris，pH 8.8. 4％焦集膠體(Stacking gel)之建議配製方法(兩片膠量) 膠體厚度(Gel thickness). 0.75mm. 1.0mm. 1.5mm. 40％ Acrylamide solution. 0.33ml. 0.5ml. 0.66ml. 4×Stacking gel buffer (pH 6.8). 0.84ml. 1.25ml. 1.67ml. 10％ SDS. 33μl. 50μl. 66μl. 10％APS(Ammonium persulphate). 16.7μl. 25μl. 33.4μl. TEMED. 4.2μl. 6.2μl. 8.2μl. ddH2O. 2.13ml. 3.17ml. 4.27ml. 總體積(Total volume). 3.3ml. 5ml. 6.7ml. 4×Stacking gel buffer：0.5M Tris，pH 6.8. 27.

(39) 蛋白質分離建議使用Acrylamide濃度分子量(Molecular weight, kD). ％Acrylamide in resolving gel. 36-205. 5％. 24-205. 7.5％. 14-205. 10％. 14-66. 12.5％. 14-45. 15％. 5×SDS sample buffer Glycerol. 5ml. SDS. 1g. β-mercapto Ethanol. 2.56ml. 0.5M Tris(pH 6.8). 2.13ml. Bromophenol Blue. 8mg. 總體積(Final volume). 10ml. 5×PBS (for Western Blotting) KCl. 4g. NaCl. 160g. KH2PO4. 4g. Na2HPO4(或Na2HPO4．2H2O). 23g(或28.8g). 總體積(Final volume). 4 liter pH調到7.4後滅菌. 28.

(40) 在西方轉漬 (Western Blotting)方面，將轉漬電泳槽 (Hofer TE 22) 注入Transfer Buffer (12mM Tris, 96mM Glycine, 20％Methanol)，並預先以100％甲醇浸潤0.45μm孔徑之PVDF纖維膜 (PVDF membrane, Perkinelemer, Waltham, Massachusetts, U.S.A.)、以Transfer Buffer浸潤濾紙 (Whatman 1001 929, Maidstone, Kent, U.K.)與海棉片。由下而上依序堆疊海綿片、濾紙、PVDF纖維膜、SDS-PAGE膠片、濾紙、海綿片，並以轉漬夾固定。將轉漬夾浸入轉漬電泳槽中並使SDS-PAGE 膠片朝向負極，以固定電壓120福特電泳90分鐘以上，將電白質轉漬到PVDF纖維膜上。轉漬結束後取出轉漬夾，拆開後將PVDF纖維膜取出置於含有Blocking solution (5％安佳脫脂奶粉 in 60mL 1×PBS)之塑膠盒中，於室溫下以60r.p.m.搖洗2小時或於4℃下搖洗過夜。移除 Blocking solution 並以 Wash Buffer (10mM Tris pH 8.0, 0.05 ％ Tween-20)搖洗2次，每次15分鐘。將PVDF纖維膜夾出放置於水平的石臘膜上，於PVDF纖維膜上滴上以稀釋液 (1％安佳脫脂奶粉- 0.05 ％ Tween-20)稀釋5000倍的1C2一級抗體 (Mouse Anti-polyglutamine monclonal antibody；Chemicon, Rosemont, Illinois, U.S.A.) (Lescure et al., 1994)，在室溫下作用2小時後，以Wash Buffer搖洗3次，每次10 分鐘。之後再滴上以稀釋液 (1％安佳脫脂奶粉- 0.05％ Tween-20)稀釋5000倍的HRP共軛的二級抗體複合物 (Goat Anti-Mouse IgM, µ. 29.

(41) chain specific；Jackson, Pennsylvania, U.S.A.)，室溫下作用2小時後，以Wash Buffer搖洗3次，每次10分鐘。將膜取出，平置於玻璃片上，滴上受質 (VisGlowTM Chemiluminecent substrate, HRP；Visual Protein, Taipei, Taiwan)並以冷光攝相系統照相存檔。依據冷光呈色結果判斷 TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白是否有凝集沈澱 (Aggregation)的現象。. (四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay)：重組蛋白之水溶性(soluble)分析因位於細胞萃取液(supernatant)的蛋白為水溶性 (soluble)，位於沈澱物 (pellet)的蛋白為非水溶性 (insoluble)且ONPG可被β gal分解而呈黃色並於波長420nm有強吸收，若重組蛋白為水溶性 (soluble)則取萃取液(supernatant)偵測後吸光值(O.D.420)較高，若重組蛋白為非水溶性 (insoluble)則取萃取液(supernatant)偵測後吸光值 (O.D.420)較低。. Product (yellow) 可吸收波長420nm的光. 利用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 β gal分析之蛋白定量)所得的細胞萃取液定量 (Bradford protein assay)後加入ONPG觀察呈色並測量吸光值(O.D.420)。在Z buffer (0.1M NaH2PO4；15mM MgSO4；75mM KCl；5mM β. 30.

(42) -mercaptoethanol；pH 7)與ONPG受質溶液 (濃度為13.3mM in Z-buffer) 配製方面，先配製10ml的1M NaH2PO4貯存液 (stock)、10ml的0.15M MgSO4貯存液、10ml的0.75M KCl，從三個貯存液中各取4ml與14μl 的β-mercaptoethanol (密度1.12)均勻混合並以二次水補至總體積為 40ml和調整pH至7，此即完成Z buffer的配製。將40mg (0.04g)的ONPG 粉末溶於10ml的Z buffer即完成ONPG受質溶液的配製。取50μl細胞萃取液 (Protein extract)與450μl的Z buffer混合後以 37℃預熱5分鐘，反應開始時加入100μl的受質ONPG (o-nitrophenylβ-D-galactoside) stock solution並於37℃下反應，固定時間加入250μl 的1M Na2CO3終止反應。16000×g離心5分鐘後取澄清液測量在波長 420nm之吸光值(O.D.420)。將各個時間點測出的吸光值對時間做圖求出斜率，將斜率代入以下公式即可得到β gal的比活性 (specific activity；單位nmoles/min/mg protein)。 O.D.420  0.85 time(min)  protein(mg / ml )  extract (ml )  0.0045 O.D.420 0.85   time(min) protein(mg / ml )  extract (ml )  0.0045. 斜率 0.0045 為產物 O-nitrophenol 的 micromolar extinction coefficient；單位為 1/μM 0.85 為反應總體積；單位為 ml. 在蛋白質定量方面，使用Bradford定量法。首先以牛血清蛋白 (Bovine serum albumin, BSA)標準品 (Sigma, P-7656)製備一組包含 31.

(43) 0、40、80、120、160、200 μg ml-1等濃度系列的標準液，取50μl 之各濃度標準液與樣品滴入96孔盤中。之後再加入200μl的Bradford reagent (Sigma)，靜置室溫十分鐘並以ELISA reader測595nm吸光，做出標準曲線並決定未知樣品濃度。. 六、藥物篩選試出可表現白色重組菌株之最佳IPTG濃度與誘導時間後即可投予具有潛力之藥物，例如先以已證實可抑制杭廷頓氏舞蹈症相關 Poly-Q蛋白凝集的海藻糖(Trehalose)及剛果紅 (Congo red)做測試，並從新合成的化合物中篩選具同等效果的新穎藥物，以此找出可抑制不可溶性長延長TBP蛋白凝集的化合物。. (一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) 觀察大腸桿菌在(LB+ Amp+ IPTG+X gal +Drug)培養液中的顏色變化。方式：曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養(Aerated and vigorous shaking culture in 96 deep-well plate)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal+Drug)培養液的顏色變化取適量質體做細菌之轉型作用後取部分菌液塗於(LB+Amp)的平板培養基上37℃隔夜培養。挑出平板培養基上的菌落養在3mL的 32.

(44) (LB+Amp)培養液中 [3ml in 15ml離心管]，以37℃、225r.p.m.作隔夜培養。之後將1mL菌液轉移到30mL的(LB+Amp)中或將166μl菌液轉移到5mL的(LB+Amp)新鮮培養液中 [30ml in 250ml錐形瓶或5ml in 50ml錐形瓶]，以37℃、225r.p.m.培養2-3小時。而後加入適量藥物 (可再添加使細菌通透性增加的物質以幫助藥物進入胞內，如甲苯 toluene、Tween-20、Tween-80或Triton X-100)、IPTG與X gal均勻混合並取500μl菌液加到96 deep-well中，以37℃ 225r.p.m.之30度斜角震盪的方式作1、2、3、6、12小時培養並觀察顏色變化。IPTG測試濃度為0.1mM。X gal的濃度為80μg/ml。青黴素 (ampicillin)的篩選濃度為50 µg/ml。. (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析轉型株之重組質體，以便確認轉型菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制酵素做切割，pGEX-TBP-Qn-Lac Zα以EcoR V與EcoR I做雙酵素切割；pGEX-Lac Zα與pUC 18以限制酵素EcoR I切割。. (三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組蛋白之特性分析(soluble或insoluble) 使用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 33.

(45) β gal分析之蛋白定量)以收集3mL的菌液，之後用600μl的lysis buffer (100mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM Tris-HCl；pH 7.6)回溶細胞沈澱物(cell pellet)。。在冰浴的條件下用超音波震盪 (sonication)的方式進行破菌，以震盪20秒、休息20秒的模式重複3次。於4℃ 16000×g 離心上述樣品20分鐘並保留細胞萃取液(supernatant)與蛋白沈澱物 (protein pellet)。將細胞萃取液(supernatant)與蛋白沈澱物 (protein pellet) 做蛋白質電泳、西方轉漬分析。而後以 CBB 染色觀察 SDS-polyarylamide gel 中的蛋白質分佈情形或以免疫染色觀察 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表現情形。. (四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay) 利用曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養 (不添加X gal以避免干擾 β gal分析之蛋白定量)所得來細胞萃取液定量 (Bradford protein assay)後加入ONPG觀察呈色並測量吸光值 (O.D.420)。. 34.

(46) 肆、結果(Result). 一、定序完成之重組質體限制酶圖譜分析 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα與pGEX-Lac Zα以限制酵素Not I切開可將環形重組質體切成線性 (圖三-A)。，pGEX-fTBP20Q-Lac Z α、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα可切出約5.6 kb之DNA片段 (lane 1與lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約5.7 kb之DNA片段 (lane 3)， pGEX- fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約5.8 kb 之DNA片段 (lane 4與lane 5)，pGEX-Lac Zα可切出約4.6 kb之DNA 片段 (lane 6)。 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα、pGEX-Lac Zα與pUC 18以限制酵素 EcoR I 切開可將環形重組質體切成線性. ( 圖三 -B) 。. pGEX-fTBP20Q-Lac Zα、pGEX-fTBP40Q-Lac Z α可切出約5.6 kb 之DNA片段 (lane 1與lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約5.7 kb 之DNA片段(lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約5.8 kb之DNA片段 (lane 4與lane 5)，pUC 18切出約2.6 kb 之DNA片段 (lane 6)。pGEX-Lac Zα可切出約4.6 kb之DNA片段 (lane 7)。 pGEX-fTBP-Lac Zα以限制酵素Bpu10 I與Ade I(Dra Ⅲ)切開. 35.

(47) 可將poly Q的基因部分切出 (圖四-A)。pGEX-fTBP20Q-Lac Zα可切出約0.5 kb之DNA片段 (lane 1)、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα可切出約 0.56 kb之DNA片段 (lane 2)，pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約0.6 kb 之DNA片段 (lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα可切出約0.7 kb之 DNA片段 (lane 4)。 pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα以限制酵素EcoR V與EcoR I切開可將環形重組質體切成兩個DNA片段 (圖四-B)。pGEX-fTBP20Q-Lac Z α可切出約3.5 kb與2.1 kb之DNA片段 (lane 1)、pGEX-fTBP40Q-Lac Z α 可切出約 3.5 kb 與 2.1 kb 之 DNA 片段. (lane 2) ，. pGEX-fTBP74Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.2 kb之DNA片段(lane 3)，pGEX-fTBP109Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.3 kb之DNA片段(lane 4)、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα可切出約3.5 kb與2.3 kb之DNA片段 (lane 5)。. 二、各重組質體於轉型菌株內的表現情形. (一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) (1)瓊脂平板培養基分析 (Agar plate culture)：觀察(LB+Amp+ IPTG+X gal)平板培養基上菌落的顏色變化瓊脂平板培養基分析的藍白篩選在六種大腸桿菌中的再現 36.

(48) 性非常低，同種重組質體在同種大腸桿菌中重複幾次做出來的結果都不一致，有時候呈藍色有時候呈白色，而且在同一個平板培養基上藍、白菌落夾雜 (data not shown)。推測用混合塗佈法的. 呈色不一致之可能原因為IPTG與X gal被agar吸收後其在平板培養基上每個區域的濃度均不相同，故造成再現性差及藍、白菌落. 夾雜的結果。而直接做在平板培養基上之呈色不一致可能原因為大腸桿菌攝入X gal的速率不同，使培養時間難以掌握而造成再現性差及藍、白菌落夾雜的結果。故瓊脂平板培養基分析只適用於「定性」。. (2)密閉式 96 孔深盤養菌盒水平震盪培養 (Non-aerated culture in 96 deep-well plate with horizontal shaker)：觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化使用96孔深盤養菌盒做密閉、水平震盪培養在六種大腸桿菌中的再現性仍非常低。從pGEX-fTBP74Q-Lac Zα之(LB+Amp) JM109 平板培養基上挑出五個菌落做密閉式96孔深盤養菌盒水平震盪培養，結果不同菌落在相同養菌盒中藍色深淺有差異 (圖六-A)，且相同菌落在相同養菌盒中也有相同的情形 (data not shown)，同時也觀察到細胞沈澱於well底部。推測可能原因為相. 37.

(49) 同質體於養菌盒不同well中誘導表現時，因養菌盒中每個well接受到的震盪程度不均造成培養條件不一 (菌體、X gal沈澱於well 底部)，進而導致呈色不一致。因密閉式96孔深盤養菌盒水平震盪培養有再現性差的缺點，為了驗證再現性差可能為震盪不均所造成，使用微量離心管震盪培養並觀察(LB+Amp+IPTG+X gal)培養液的顏色變化。微量離心管震盪培養的方式其再現性高，不再有呈色不一致的問題。從 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP109Q-Lac Z α 與 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα之(LB+Amp) JM109平板培養基上挑出五個菌落做微量離心管震盪培養，結果發現呈色非常穩定，也不再有細胞沈澱 (圖六-B、C、D)，其他菌株的呈色也非常穩定 (data not shown)。將所有重組質體轉型進入大腸桿菌JM109菌種做微量離心管震盪培養後0.1mM、0.5mM、1mM IPTG誘導下均呈藍色，而0mM、5mM、10mM IPTG誘導下則呈白色 (圖七)。此結果雖驗證了密閉式96孔深盤養菌盒水平震盪培養之再現性差可能為震盪不均所造成，但pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體之藍、白結果不如預期，推測透氣與否可能影響呈色故使用錐形瓶震盪培養做一系列實驗。. 38.

(50) 為了探討轉型菌株在震盪均勻及有氧培養條件下，各種 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組蛋白的表達情況，故使用錐形瓶做透氣培養。以錐形瓶做震盪培養因震盪均勻，故再現性高且呈色穩定。將所有質體轉入 JM109 中並挑菌做錐形瓶震盪培養，共有八組(JM109 control、pUC 18、pGEX-lac Zα、pGEX-fTBP20Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP40Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP 109Q-Lac Zα、pGEX- tTBP135Q-Lac Zα)。JM109 control 不含任何質體故一定不呈色，作為負對照組 (negative control)，pUC 18 則一定呈色故作為正對照組 (positive control)。 0mM IPTG 誘導下均無呈色，0.1mM IPTG 誘導 12 小時之藍白結果與藍色程度如圖八與表一，且 pUC18、pGEX-lac Zα、 pGEX-fTBP109Q-Lac Zα、pGEX-tTBP135Q-Lac Zα均於 2 小時後有藍色產生、pGEX-fTBP74Q-Lac Zα則於 6 小時後稍有呈色，而 pGEX-fTBP20Q-Lac Zα、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα、JM109 control 則不呈色 ( 圖九 ) 。此結果驗證透氣培養下會使 pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體出現藍白差異。根據以上結果，在震盪均勻、透氣 (Ventilation)與可做大量 (High-throughput)藥物篩檢的前提下將 96 孔深盤養菌盒培養方式加以修正成方法三。. 39.

(51) (3) 曝氣式 96 孔深盤養菌盒震盪培養 (Aerated and vigorous shaking culture in 96 deep-well plate) 因96孔深盤養菌盒具有可做大量藥物篩檢(High-throughput) 的優點，故將透氣 (Ventilation)、震盪均勻的條件應用在96孔深盤養菌盒，以此發展出曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養的方式透氣養菌盒、斜角三十度震盪。將所有質體轉入JM109、XL1 blue、Top 10、DH5α、Rosetta blue與KRX中並挑菌做曝氣式96 孔深盤養菌盒震盪培養，培養的結果如圖十、十一、十二。共有八組. (Negative control 、 pUC18 、 pGEX-lac Z α 、. pGEX-fTBP20Q-Lac Z α 、 pGEX- fTBP40Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP74Q-Lac Z α 、 pGEX-fTBP 109Q-Lac Z α 、 pGEX-tTBP135Q-Lac Zα)。Negative control (簡稱NC)不含任何質體故一定不呈色，作為負對照組 (negative control)，pUC18一定呈色作為正對照組 (positive control)。0mM IPTG誘導下均無呈色，0.1mM IPTG誘導12小時之呈色結果與呈色時間先後如表二。JM109之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後有藍色產生；XL1 blue之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後有藍色產生；Top 10之 pUC 18於6小時後有藍色產生；DH5α之pUC 18於6小時後有藍色產生；Rosetta blue之pUC 18於12小時後有藍色產生、pGEX-lac. 40.

(52) Zα誘導後使菌死亡。KRX之pUC 18、pGEX-lac Zα於6小時後有藍色產生。由表二可知 JM109 的培養結果符合預期，即 pUC 18 、 pGEX-lac Zα誘導後呈藍色，故進一步使用此菌種並配合此培養方式作蛋白質電泳、西方轉漬分析與β半乳糖苷酶活性分析。. (二)各重組質體於轉型菌株內的鑑定 — 基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析轉型株之重組質體，以便確認轉型菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制酵素做切割。JM109之pGEX-TBP-Qn-Lac Zα以EcoR V與EcoR I做雙酵素切割 ( 圖五 -A) ，圖五 -A 之 lane 1-5 分別代表 pGEX-TBP-20/40/74 /109/135Q-Lac Zα切割後的情形；JM109之pUC 18與pGEX-Lac Zα以限制酵素EcoR I切割(圖五-B)，圖五-B之lane 1-2分別代表pUC 18與 pGEX-Lac Zα切割後的情形。其餘轉型菌株之重組質體鑑定均與圖五同。. (三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組蛋白之特性分析(soluble或insoluble) pGEX-TBP-Qn-Lac Zα重組質體轉入JM109中並挑菌做曝氣式 96孔深盤養菌盒震盪培養，破菌後取細胞萃取液 (Supernatant)與沈澱 41.

(53) 物 (Pellet)做西方轉漬分析 (圖十三)。由圖可知0mM IPTG誘導下均無蛋白表現，而0.1mM IPTG誘導下萃取液部分目標位置只有pGEXfTBP20Q-Lac Zα偵測到可溶性蛋白；其餘重組質體所呈現的訊號推測可能為構形未完全解開、不具功能的可溶性蛋白。此結果顯示在這些重組質體中有功能的TBP-Qn-Lac Zα並不存在於萃取液中，而可溶性重組蛋白構形未完全解開的原因可能是凝集沉澱作用力過強所導致。0.1mM IPTG誘導下沈澱物部分只有pGEX-fTBP20/40/ 74Q-Lac Z α可偵測到，其餘均無訊號，但只有pGEX- fTBP40Q-Lac Zα在焦集膠體與分離膠體之間有嚴重smear ( TBP aggregation)的現象，顯示 pGEX-fTBP40Q- Lac Zα的凝集程度較pGEX-fTBP20/74Q- Lac Zα 高。西方轉漬分析的結果顯示pGEX-fTBP40Q-Lac Zα的溶解度較 pGEX-fTBP20/74Q-Lac Zα差，而pGEX-fTBP109Q/tTBP135Q- Lac Z α則不表現，此符合pGEX-TBP-Qn-Lac Zα/ JM109在表現型分析上均呈白色的原因。. (四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay)：重組蛋白之水溶性(soluble)分析所有質體轉入JM109並做曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養，以此方式得到的細胞萃取液 (Supernatant)做β gal活性分析 (圖十四)。由. 42.

(54) 圖可知在0mM IPTG誘導下無活性、而0.1mM IPTG誘導下pUC18與 pGEX-lac Zα之β gal活性明顯比pGEX-TBP-Qn-Lac Zα還高，此結果與表現型分析相吻合。. (五)高濃度IPTG干擾藍白篩選結果在 JM109 大腸桿菌、 0.1 與 10mM IPTG 誘導下，所有 pGEXfTBP/tTBP-Lac Zα重組質體以微量離心管震盪培養所得到的重組蛋白細胞萃取液做β gal分析。在X gal表現型分析中高濃度IPTG (5或 10mM)呈白色，但取其細胞萃取液做β gal活性分析時卻發現有呈色反應，表示在高濃度IPTG誘導下有活性的β gal被製造出來。推測可能高濃度會抑制X gal或ONPG的呈色反應，故做以下測試：0.1mM、 10mM IPTG誘導下的細胞萃取液、外加0.1mM或10mM IPTG於相同濃度IPTG誘導表達出的細胞萃取液，經上述四種處理後分別做ONPG 呈色分析 (圖十五)。結果發現外加10mM IPTG於相同濃度IPTG誘導下的細胞萃取液顏色比不外加IPTG的淡，而外加0.1mM IPTG於相同濃度IPTG誘導下的細胞萃取液其顏色則與不外加IPTG無明顯差異。此實驗結果證明高濃度IPTG確實會抑制ONPG呈色，並干擾藍白篩選。故使用0.1mM IPTG誘導蛋白表現。. 43.

(55) pGEX-fTBP/tTBP-Lac Zα重組質體 IPTG誘導濃度(mM). 0.1. 0.1. 10. 10. 外加IPTG濃度(mM). 0. 0.1. 0. 10. 深黃. 深黃. 深黃. 淺黃. ONPG呈色. (六)微生物模型挑選結果綜合表現型分析、基因型分析、蛋白質電泳、西方轉漬分析以及 β半乳糖苷酶活性分析，pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109符合篩藥條件，故以pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109進行篩藥。. 三、藥物篩選. (一)表現型分析(Phenotypic screening)：藍白篩選(blue-white screening) 在各種濃度的海藻糖 (trehalose)與剛果紅 (Congo red)處理下， JM109 的呈色結果如圖十六，由圖可知各種濃度海藻糖均無法有藍色產生，各種濃度剛果紅均無法有墨綠色(紅＋藍)產生，進一步做蛋白質電泳、西方轉漬分析(圖十七)與β半乳糖苷酶活性分析 (圖十八、十九)均與表現型吻合，故海藻糖與剛果紅似乎無法抑制 pGEXfTBP40Q-Lac Zα/JM109 凝集沈澱或增加其溶解度。在各種濃度的海藻糖 (trehalose)處理下，外加 0.1％或 0.5％之 Tween 80 (Sigma)以幫助藥物通透，JM109 的呈色結果如圖二十，由 44.

(56) 圖可知在各種濃度海藻糖與 0.1％或 0.5％之 Tween 80 雙重處理下均無法有藍色產生，故 Tween 80 似乎對藥物通透幫助不大。. (二)各重組質體於JM109轉型菌株內的鑑定—基因型分析(genotyping) 以限制酶圖譜分析為方法分析 JM109 轉型株之重組質體，以便確認轉型菌株誘導後各重組質體的存在。將各種轉型菌株的質體抽出並用限制酵素做切割，pGEX-fTBP40Q-Lac Zα以 EcoR V 與 EcoR I 做雙酵素切割，結果與圖五-A 同；pUC 18 與 pGEX-Lac Zα以限制酵素 EcoR I 切割，結果與圖五-B 同。. (三)蛋白質電泳(SDS-PAGE)與西方轉漬分析(Western blotting)：重組蛋白之特性分析(soluble 或 insoluble) pGEX-fTBP40Q-Lac Zα重組質體轉入 JM109 中並挑菌做曝氣式 96 孔深盤養菌盒震盪培養，在各種濃度的海藻糖 (trehalose)處理下，破菌後取細胞萃取液 (Supernatant)與沈澱物 (Pellet)做西方轉漬分析 (圖十七)。由圖可知各種濃度之海藻糖均無法使沉澱物 (pellet)的 smear 現象消失，細胞萃取液 (Supernatant)的訊號也與不添加海藻糖時的訊號相同，剛果紅 (Congo red)之 Western Blotting 的結果與圖十七類似，故海藻糖與剛果紅似乎無法抑制 pGEX-fTBP40Q- Lac Zα /JM109 凝集沈澱或增加其溶解度，此結果與表現型分析吻合。 45.

(57) (四)β半乳糖苷酶活性分析 (β gal activity assay)：重組蛋白之水溶性(soluble)分析 pGEX-fTBP40Q-Lac Zα重組質體轉入JM109並做曝氣式96孔深盤養菌盒震盪培養，在各種濃度的海藻糖 (trehalose)與剛果紅 (Congo red)處理下所得到的細胞萃取液 (Supernatant)做β gal活性分析 (圖十八、十九)。由圖可知在各種濃度的海藻糖與剛果紅處理下， β gal活性均無明顯差異，故海藻糖與剛果紅似乎無法增加pGEXfTBP40Q-Lac Zα/JM109重組蛋白溶解度，此結果與表現型分析相吻合。. 46.