第三章 結果
1. 重組質體轉入農桿菌株
將三個重組質體pPiH-PiEGFP、pPiH-PiEGFP-SP 與 pCAMBIA1302 分別經電穿孔 轉入農桿菌菌株LBA 4404 與 AGL-1 後，塗布於含有 50 μg/ml kanamycin 的 LB 平 板培養基上，將抗生素篩選後得到的菌落以EGFP-f 與 EGFP-r 進行 colony PCR，
於洋菜膠體電泳後可看到目標片段0.7 kb。另以 Hph-f 與 Hph-r 進行 colony PCR 後，可看到目標片段1.3 kb，如圖十八。
2. 農桿菌媒介之鮑魚菇轉形
2.1 轉形材料選擇 2.1.1 菌絲塊
以雙核和單核菌絲塊作為轉形材料，發現與農桿菌進行共培養後的單核菌絲可於 選擇性培養基上長出，而雙核菌絲則否，將疑似轉形株的單核菌絲挑到新鮮選擇 性培養基上，約20 天後可看到部分菌絲生長於菌塊周圍，如圖十九，然而挑選邊 緣菌絲第二次轉移到選擇性培養基後，菌絲卻不再生長，顯示以菌絲塊作為轉形 材料應不適宜
2.1.2 菌絲體
將均質機打碎的鮑魚菇菌絲片段與農桿菌共培養，AS 濃度為 500 μM 之實驗組，
在第一次篩選初期疑似轉形株生長比例較AS 濃度為 200 μM 之實驗組多，如圖二 十，但經過一個禮拜後兩者比例相當，挑至新鮮選擇性培養基後即沒有生長上的 差異。挑選可能具抗性的菌絲至新鮮選擇性培養基後，僅約5~10 % 的菌絲能再度
於選擇性培養基上長出，菌絲生長緩慢而擴展範圍小，並且高達 80%疑似轉形株
第三次接種於選擇性培養基上即無法生長。其中，轉形株MLF2 (參照表十一) 在 選擇性培養基上生長良好，且能穩定維持抗性五代以上，見圖二十一。
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(註：一代為在新鮮選擇性培養基上生長約 20~25 天)
2.1.3 蕈褶組織
與農桿菌共培養後的鮑魚菇蕈褶組織能在選擇性培養基上長出抗性菌絲，如圖二 十二，轉形效率近90~100 %，AS 濃度 200 μM 與 500 μM 之實驗組轉形株生長比 例相當，經挑選到新鮮選擇性培養基後，亦能長出擴展之菌絲，如圖二十三。其 中，轉形株GA10-4 (參照表十一)抗性能維持七代以上。故選擇蕈褶組織為鮑魚菇 後續轉形時所使用之主要材料類型。
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圖十八 農桿菌 colony PCR 電泳結果
(A)以引子 EGFP-f 與 EGFP-r 進行 PCR 之產物 (B)以引子 Hph-f 與 Hph-r 進行 PCR 之產物
Figure 18. Agarose gel electrophoresis of agrobacterium colony PCR products amplified with primers EGFP-F/EGFP-R or Hph-f /Hph-r.
(A)
(B) kb
0.5 3 1
kb
1 1.5
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表十一 農桿菌株對應質體與鮑魚菇轉形株之簡稱
Table 11. Abbreviated names of A.tumefaciens strains and P. ostreatus transformants with specific plasmid
Abbreviated name A.tumefaciens strain Plasmid P. ostreatus materials used P. ostreatus transformants
A10 AGL-1 pCAMBIA1302 Gill tissues GA10
L10 LBA4404 pCAMBIA1302
AP AGL-1 pPiH-PiEGFP
LP LBA4404 pPiH-PiEGFP Gill tissues GLP
APsp AGL-1 pPiH-PiEGFP-SP Gill tissues GAPsp
LPsp LBA4404 pPiH-PiEGFP-SP
AA AGL-1 pAiH-AiEGFP Gill tissues GAA
LA LBA4404 pAiH-AiEGFP
AF AGL-1 pAiH-FiEGFP
LF LBA4404 pAiH-FiEGFP Blended mycelia MLF
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圖十九 鮑魚菇 MMP 轉形株生長情形
以鮑魚菇單核MMP (上列圖)與雙核 MMP (下列圖)作為轉形材料，二次轉移至新鮮 選擇性培養基上生長情形
Figure 19. P. ostreatus monokaryotic MMP (upper panel) and dikaryotic MMP (lower panel) as transformation material grow on selective medium.
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圖二十 以鮑魚菇雙核菌絲液作為轉形材料於選擇性培養基上初次生長情形
Figure 20. P. ostreatus dikaryotic blended mycelium (left : 200 μM AS; right : 500 μM AS ) as transformation materials grown on selective medium the first time.
圖二十一 轉形株 MLF-2 於選擇性培養基上生長情形良好 圖中左上角數字為轉形株於選擇性培養基上繼代次數
Figure 21. The transformant MLF-2 grown well on selective medium. Number on each figure indicates the subculture time on selective medium.
2nd 3rd
4th 5th
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圖二十二 以鮑魚菇蕈褶組織作為轉形材料第一次於選擇性培養基上生長情形 Figure 22. P. ostreatus gill tissue as transformation material grown on selective medium the first time.
圖二十三 鮑魚菇蕈褶組織轉形株繼代生長情形
以鮑魚菇蕈褶組織作為轉形材料時，菌絲接種至新鮮選擇性培養基上皆能生長出 擴展菌絲，圖中文字為轉形株簡稱，括號內為繼代次數。
Figure 23. P. ostreatus mycelium developed on fresh selective medium when using gill tissue as transformation material. The subculture times of each transformant was symbolized in parentheses.
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