第二章 材料與方法
4. 鮑魚菇轉形株篩選與分析
4. 鮑魚菇轉形株篩選與分析
4.1 選擇性培養基篩選
將共培養完畢之鮑魚菇轉形材料以無菌水沖洗數次，滅菌過的擦手紙拭乾後，
移至含有 30 μg/ml Hygromycin 之選擇性培養基培養(添加 200 μM cefotaxime 抑制 農桿菌生長)，待可能之轉形株菌絲長出後，再次接種於新鮮的選擇性培養基 (含 30μg/ml Hygromycin 與 200 μM cefotaxime)，重複接種至新鮮選擇性培養基一次，
以確認菌絲是否的確具有潮黴素抗性。
4.2 螢光顯微鏡觀察
以滅菌過之牙籤挑取在選擇性培養基上生長於邊緣之菌絲或利用微量吸管以
滅菌過之tip 吸取液態培養基中之菌絲至玻片上，蓋上蓋玻片除去氣泡後，以鉛筆 末端橡皮擦將菌絲輕輕敲散，並在玻片周圍塗上指甲油封片。利用螢光顯微鏡 Eclipse E600 (Nikon, Kanagawa, Japan) 觀察菌絲表現 EGFP 情形。
(Excitation wavelength：450 ~ 490 nm，Emission wavelength：520 nm)
4.3 蛋白質分析
4.3.1 轉形株總可溶蛋白質粗萃取
接種生長於選擇性培養基邊緣之菌絲於 10 ml PDB，待 2 ~ 3 個禮拜後收取菌 絲體，先於-80oC 預冷一小時後，置入 Speed Vac 抽乾至隔日，將乾燥之菌絲體佐 以液態氮磨碎均質後，秤取乾重，每1 mg 菌粉加入 20 μl 蛋白質萃取緩衝液(50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 1mM PMSF, 0.1% Triton X-100, pH 7.4) 混勻後放 置冰上 1 小時，於 4 oC 以 13000g 條件離心半小時後，直接使用於 BCA 定量、
ELISA 分析，或經濃縮後做為西方式雜合分析之用，另分裝凍於-20 oC 備用。
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4.3.2 蛋白質定量
4.3.2.1 總可溶蛋白質 BCA 定量
以 BSA (Sigma, Germany)配製 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.125, 0 mg/ml 之濃度 做為標準曲線，將欲測樣品稀釋適當倍數(10 或 20 倍)後，各取 10 μl 二重複加入 96 孔微量滴定盤，再加入 200 μl BCATM Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)使用 前均勻混合之 BCA working reagent (reagent A : B = 50 : 1)，避光放置於 37oC 反應 半小時後，偵測 562 nm 吸光值。將所得 O.D.562代入BSA 標準曲線算得蛋白質量，
再回乘稀釋倍數為轉形株總可溶蛋白質粗抽液內蛋白質含量(Total soluble protein, TSP, 單位為 mg/ml)。
4.3.2.2 三明治法酵素連結免疫吸附分析 (sandwich ELISA)
配製 coating buffer (0.1 M carbonate / bicarbonate, pH 9.6)，將 mouse anti – GFP 單株抗體 (ab1218, Abcam, Cambridge, UK) 以 coating buffer 稀釋 4000 倍，取 100 μl 加入 ELISA 專用 96 孔微量滴定盤 (Nunc, Denmark) 放置於 4 oC 200 μl PBST 清洗四次後，加入 100μl blocking buffer (0.25% gelatin in PBST)，室溫 靜置兩小時。200 μl PBST 清洗四次後，加入 100 μl blocking buffer 稀釋適當倍數 之rabbit anti-GFP 多株抗體(ab6556, Abcam, Cambridge, UK) 4 oC 靜置一小時後，同 樣以200 μl PBST 清洗四次後，加入 100 μl 以 blocking buffer 稀釋適當倍數之 goat anti rabbit HRP conjugate (PerkinElmer)於 4 oC 靜置一小時，200 μl PBST 清洗四次 後加入100 μl 3,3’5,5’- tetramethylbenzidine 基質溶液(TMB One Component HRP Microwell Substrate, BioFX, MD, USA)靜置 5 分鐘後，偵測 O.D.650吸光值，每5 分 鐘偵測一次至半小時，選取標準曲線R2值較高者之時段測得的吸光值，推算轉形 株蛋白質原始粗抽液內可溶性EGFP 含量(單位為 pg/ml)。
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轉形株總可溶蛋白質中所測得 EGFP 含量之比例即為各轉形株以同樣萃取 方式抽出之EGFP 含量比較依據，表示為 EGFP / TSP (ng/g)。
4.3.3 西方雜合分析
取轉形株蛋白質粗萃液 500μl 以離心過濾裝置 Microcon YM-10 (Millipore Corporation Bedford, U.S.A)於 4oC，6000 g 進行濃縮至體積約 50μl，取 15 μl 與 5 μl 5x SDS 樣品緩衝液混合均勻，100oC 加熱 10 分鐘後，放置冰上冷卻 3 分鐘，離心 半分鐘後備用。
配製 12% SDS 聚丙醯胺膠體，架設於電泳槽，於內外槽倒入 SDS 電泳緩衝 液(0.01% SDS, 2.5 mM EDTA, 80 mM Boric acid, 90 mM Tris, pH 8.4)後，以微量吸 管置入樣品，先以80 伏特電壓使之焦集 30 ~ 40 分鐘，待樣品到達分離膠體時再 提高電壓至140 伏特，約一小時後即可取出膠片浸泡於轉印緩衝液中(1x 電泳緩衝 液含15 %甲醇)。先將 PVDF (0.45 μm)浸泡於 100%甲醇中，以半乾式電泳轉漬槽 (Genmedika Biotechnology, 台北)，依序放置轉印緩衝液浸濕之濾紙兩片、電泳膠 片、PVDF 膜、轉印緩衝液浸濕之濾紙兩片，單片轉漬條件為 75 mA，15 分鐘。
轉漬後之 PVDF 膜以 TSW buffer (0.25% Gelatin, 0.1% Triton X-100, 0.02%
SDS, 0.9 % NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4)震盪浸洗 1.5 小時(80 rpm)，再置換為 TSW 稀 釋 6000 倍之 mouse anti-GFP 一次抗體(Living colors A.v. Monoclonal [JL-8], Clontech, Mountain View, CA, USA)室溫震盪反應 14 小時，以 TSW 稍微搖晃清洗 一次後，震盪浸洗三次，每次十分鐘。加入以 TSW buffer 稀釋 5000 倍之 goat anti-mouse IgG AP congujate 二次抗體(PerkinElmer, Boston, MA, USA)室溫震盪反 應1 小時，再以 TSW 稍微搖晃清洗一次後，震盪浸洗三次，每次十分鐘，以 AP buffer 平衡15 分鐘，加上基質 NBT/BCIP 避光靜置反應 15 ~ 20 分鐘，待色帶出現以一 次水漂洗終止反應。
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