間接效應

為研 究薊馬取食感染 WSMoV 的植物對薊馬生存及發育 所受的影響，

分別讓健康薊馬取食 健康西瓜葉片、經薊馬 取食的西瓜葉片與經薊馬接種感 染 WSMoV 的西瓜葉片；感染 WSMoV 的薊馬幼蟲取食健康 西瓜葉片、經 薊馬取 食的西瓜葉片與經 薊馬接種感 染 WSMoV 的西瓜葉片。 觀察記錄健 康薊馬及感染 WSMoV 的薊馬自一齡幼蟲至前蛹期之發育時間 及存活率。

14 6. 南黃薊馬成蟲之取食偏好性

設置 1 個 30 x 30 x 30 cm³ 壓克力箱，內 置入兩株不同實驗組合條件 植物 (健康植株與薊馬接種 感染 WSMoV 之植株、健康植株與經薊馬取食 植株、經薊馬取食植株與薊馬接種感染 WSMoV 之植株)，並將內有同樣性 別 10 隻薊馬成蟲的離心管 (eppendorf) 放置於 2 植株中央；植株與植株、

各植株與 離心 管之 間隔均為 30 公分。待放置 2 小時、4 小時、8 小時、

12 小時及 24 小時，後分別計 算於各 植株 上之薊馬 數量。 本實驗 每個實驗 處理均進行 3 次重覆，另外雌薊馬與雄薊馬都分別進行測試，以檢測薊馬 成蟲取食偏好性之性別差異。

7. 統計分析

南黃薊馬 傳播 WSMoV 之傳播模式檢測部分，單隻薊馬傳播 WSMoV 之傳播效率計算乃根據以下 Swallow (1985) 的群組傳播效率計算公式計算，

其中 N 為供試植物總數，R 為沒有感染成功的植物數，k 為每株供試植物 接種的薊馬數：PS = 1-﹛ R/N﹜^1/k。在持續性傳播測試一齡幼蟲獲毒、成蟲傳 毒 的 實 驗 中， 其單 隻 薊馬 成蟲 傳 播 病毒的效率為 感染植 物總數/供試總植物 數 。 不同性別成蟲傳播效率的比較以邏輯迴歸 (logistic regression) 進行分 析 。 在 WSMoV 對 薊 馬 幼 蟲 的 存 活 率 直 接 、 間 接 的 影 響 ， 本 研 究 採 用 Kaplan-Meier 法 及 存 活 分 析 (survival analysis) 檢 驗 薊 馬 幼 蟲 存 活 率 (cumulative survival rate) 或 存 活 至 前 蛹 期 的 總 蟲 數 。 利 用 對 數 等 級 檢 定 (log rank test) 檢視兩處理之間是否具有顯 著差異。 WSMoV 對薊馬幼蟲發 育時間的直接及間接效應 以負二項分布 (negative binomial distribution) 進 行比較。 薊馬成蟲對 薊馬接種感染 WSMoV 植物、經薊馬取食 植物與健康 植物取食偏好性測試，每個時間點兩植株上薊馬蟲數比較利用，以二項分佈 (binomial distribution) 為基礎之符號檢定 (sign test) 進行檢定。以上所有的 統計運算均由軟體 R (ver. 2.12.0) 執行。

15 結果 1. 南黃薊馬傳播西瓜銀斑病毒的傳播模 式 1.1 非持續性傳播模式

南 黃 薊 馬 無 法 在 15 分 鐘 AAP 與 2 小 時 IAP 的 情 況 下 傳 播 WSMoV。在 本實 驗中 一齡 幼蟲 獲毒 及傳 毒 、二齡 幼蟲 獲毒 及傳 毒、 成蟲 獲 毒及傳毒，單隻薊馬傳播 WSMoV 的效率皆為 0% (表一)。

1.2 半持續性傳播模式

南 黃 薊 馬 雖 然 可 以 在 2 小 時 AAP 與 24 小 時 IAP 的 情 況 下 傳 播 WSMoV，但 是傳 播機 率非 常低 。 在 本實 驗 中一齡 幼蟲 獲毒 及傳 毒、 二齡 幼 蟲獲毒及傳毒、成蟲獲毒及傳 毒，5 隻薊馬傳播 WSMoV 的效率分別為 3%、

6%、0% (表一)，一齡 與二齡幼蟲的傳 播效 率並沒有顯著差異 (z = -0.55, d. f.

= 1, P = 0.57)。

1.3 持續性傳播模式

南 黃薊 馬 主要 以 持續 性 傳播模 式 傳播 WSMoV，其中以一齡幼蟲獲毒 成蟲傳毒的傳播效率最高。本實驗中一齡幼蟲及二齡幼蟲獲毒，且於羽化為 成蟲後傳播病毒，單隻薊馬的 傳播效率分別為 76% 及 0.6% (表一)。一齡 幼蟲獲毒二齡幼蟲傳毒部分，單隻薊馬的傳播效率為 0.6% (表一)。成蟲獲 毒及傳毒部分，單隻薊馬的傳播效率為 1.2% (表一)。雌成蟲與雄成蟲傳播 WSMoV 的傳播效率，分別為 71% 及 81% ，兩者間無顯著差異 (z = -0.23, d. f. = 1, P = 0.81)。

16

表一、南黃薊馬 (Thrips palmi) 傳播西瓜銀斑病毒 (Watermelon silver mottle virus, WSMoV) 之傳播效率

Table 1. Transmission efficiency of Watermelon silver mottle virus (WSMoV) by Thrips palmi

Transmission mode

Acquired instar Inoculated instar Transmission efficiency^a

Ps^b

Nonpersistent

transmission First-instar larvae First-instar larvae 0% 0%

Second-instar larvae Second-instar larvae 0% 0%

Adults Adults 0% 0%

Semipersistent

transmission First-instar larvae First-instar larvae 3% 0.6%

Second-instar larvae Second-instar larvae 6% 1.2%

Adults Adults 0% 0%

Persistent

transmission First-instar larvae Second-instar larvae 3% 0.6%

Second-instar larvae Adults 76% 76%

Second-instar larvae Adults 3% 0.6%

Adults Adults 6% 1.2%

a Transmission efficiency cauculated as the number of WSMoV-infected plants/

the number of test plants.

b The maximum likelihood estimator of transm ission probability for replicates with five thrips per plant was counted according to Swallow (1985).

17 2. 西瓜銀斑病毒於南黃薊馬體內的複製

不 管 是 感 染 WSMoV 的 西 瓜 或 感 染 WSMoV 的 南 黃 薊 馬 ， 其 total RNA 經 2-step RT-PCR 之 後 產 出 WSMoV M RNA 之 vc RNA 的 RT-PCR 產物 (圖三)，並經由定序確 認。 結果顯示 WSMoV 確實於南黃薊 馬體內進行複製。

圖三、西瓜銀斑病毒 (Watermelon silver mottle virus, WSMoV)，於西瓜及南 黃薊馬 (Thrips palmi) 體內複製。將 total RNA 以引子 NSmR 進行 反轉錄 (reverse transcription) 成 cDNA 後，再以引子對 NSmF 及 NSmR 進行聚合酶 連鎖反應。Ｍ: marker; negative control (lane 1)；健 康西瓜 (lane 2)；感染 WSMoV 的西瓜 (lane 3)；健康薊馬 (lane 4)；

感染 WSMoV 的 薊馬 (lane 5)。箭頭指出 WSMoV M RNA 之 vc RNA 的 RT-PCR 產物，大小為 275bp。

Fig. 3. The replication of Watermelon silver mottle virus (WSMoV) in Citrullus lanatus and Thrips palmi. Total RNA was reverse transcripted to cDNA by using the primer NSmR, and then the polymerase chain reaction was performed by using the cDNA and the primers NSmF and NSmR. M:

marker; negative control (lane 1); hea lthy watermelon (lane 2);

WSMoV-infected watermelon (lane 3); healthy thrips (lane 4);

WSMoV-infected thrips (lane 5). The arrow indicated the RT-PCR product (275bp) of WSMoV M RNA vc RNA.

M 1 2 3 4 5

1 kb 500 bp 250 bp

18

3. 西瓜銀斑病毒對南黃薊馬幼蟲發育速 率 及存活率之影響 3.1 直接效應

比較健康及感染 WSMoV 的南黃薊馬飼養於花豆上的存活率 (圖四)，

兩者間並無顯著差異 (² = 2.84, d. f. = 1, P = 0.09)。健康薊馬與感染 WSMoV 的薊馬於花豆上發育至前蛹期的時間分別為 119.4 ± 31.6 小時及 122.9 ± 18.4 小時，兩者間無顯著差異 (表二，Log-likelihood: -339.09, P = 0.73)。以 上結果顯示 WSMoV 的感染對薊馬幼蟲的存活率及發育至前蛹期的 時間無 直接影響。

表 二 、 西 瓜 銀 斑 病 毒 (Watermelon silver mottle virus) 的 感 染 對 南 黃 薊 馬 (Thrips palmi) 於花豆苗上的幼蟲 存活率與 幼蟲發育至前 蛹期時間 的 直接效應

Table 2. Direct effects of Watermelon silver mottle virus infection on larval survival rate and developmental time from newly larvae hatched to prepupae of Thrips palmi on kidney bean seedlings

Test statistic P-value

Survival rate 2.81^a 0.09

Developmental time -339.09^b 0.73

a The log-rank test was used for planned comparison. d. f. = 1.

b The negative binomial distribution was used for planned co mparision.

19

圖四、幼蟲存活率 (Kaplan–Meier)。健康南黃薊馬 (Thrips palmi) 幼蟲飼育於花豆 苗上的存活率 (n = 65, 黑線) 與感染西瓜銀斑病毒 (Watermelon silver mottle virus) 的南黃薊馬幼蟲於花豆苗上存活率 (n = 70, 虛線)。

Fig. 4. Cumulative survival rate of Thrips palmi larvae (Kaplan–Meier). Healthy thrips larvae were raised on kidney bean seedlings (n=65, drawn line).

Watermelon silver mottle virus-infected thrips larvae were raised on

kidney bean seedlings (n=70, dashed line).

3.2 間接效應

健 康南 黃薊 馬 幼蟲 飼 育 於 健康植 株 、 經 薊 馬 取 食植株及薊馬接種 感染 WSMoV 的植株之幼蟲存活率，三者 之間 沒有顯著差異 (表二、圖五 A，²= 4.6, d. f. = 2, P = 0.31)。結果顯示薊馬取食與 WSMoV 並不會透過薊馬的寄主 植物間接影響薊馬的存活率。發育至前蛹期時間方面，健康南黃薊馬幼蟲於 健康植株及薊馬取食 植株發育時間有顯著差異 (表三、圖六，Log-likelihood:

-235.10, P < 0.05)；但健康南黃薊馬幼蟲於薊馬接種感染 WSMoV 之植株與 經薊馬取食之植株的發育時間，沒有顯著差異 (Log-likelihood: -163.44, P = 0.52)；健康南 黃薊 馬幼蟲於 健康 植株 與薊 馬接種 感染 WSMoV 的植株發育

Time (hours)

20 40 60 80 100

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Cummulative survival rate

20

時間亦無顯著差異 (Log-likelihood: -220.80, P = 0.53)。結果顯示 WSMoV 並 不會透過薊馬的寄主植物間接影響，薊馬的存活率與發育時間。

感染 WSMoV 之南黃薊馬幼蟲於健康植株、經薊馬取食植株及薊馬接 種感染 WSMoV 的植株之存活率，三者之間沒有顯著差異 (圖五B，²= 3.5, d. f. = 2, P = 0.17)。經薊馬取食與 WSMoV 對感染 WSMoV 之薊馬的存活率 沒有間接效應，此結果與健康薊馬的結果相同。

21 Healthy thrips larvae were raised on healthy watermelon seedlings (n=47, drawn line), on thrips-damaged watermelon seedlings (n=32, dashed line) and on thrips-inoculated watermelon seedlings (n=32, grey line). (B) Watermelon silver mottle virus-infected thrips larvae were raised on healthy watermelon seedlings (n=46, drawn line), on thrips-damaged watermelon seedlings (n=26, dashed line) and on thrips-inoculated watermelon seedlings (n=40, grey line).

Time (hours)

22

發育至前蛹期時間方面，感染 WSMoV 的薊馬幼蟲於健康植株與薊馬 取食植 株之發育速 率有顯著差異 (表三、圖六，log-likelihood: 193.58, P <

0.01)； 感 染 WSMoV 的 薊 馬幼 蟲 於 薊 馬 接 種 感 染 WSMoV 的 植 株及健康 植 株 之 發 育 速 率 有 顯 著 差 異 (log-likelihood: -266.85, P < 0.01) ； 感 染 WSMoV 的薊馬幼蟲於 薊馬接種 感染 WSMoV 的植株及經薊馬 取食植株之 發育速率有顯著差異 (log-likelihood: -193.58, P < 0.01)。感染 WSMoV 的 薊 馬 幼 蟲 於健 康植 株上發 育至 前蛹期 的 時 間最長 ，其次 為 於 薊馬接 種感 染 WSMoV 者，最短者為於經薊 馬取食植株發 育者。結 果顯示不論薊 馬有無感 染 WSMoV，當薊馬幼蟲飼育於 經薊馬取食的植株上會縮短薊馬幼蟲發育至 前蛹的發育時間，但 WSMoV 的感染會減弱薊馬取食植株造成的影響。

表三、西瓜銀斑病毒 (Watermelon silver mottle virus, WSMoV) 對南黃薊馬 (Thrips palmi) 於西瓜苗上的幼蟲發育至前 蛹期時間的 間接效應 Table 3. Indirect effects of Watermelon silver mottle virus (WSMoV) on larva

developmental time from newly hatched to prepupa of Thrips palmi on watermelon seedlings

Comparision

Healthy larvae WSMoV-infected larvae Test statistic^a P Test statistic^a P

Healthy vs. thrips-damaged -235.10 < 0.05 -203.92 < 0.05

Thrips-inoculated vs.

thrips-damaged

-163.44 0.52 -193.58 < 0.01

Healthy vs. thrips-inoculated -220.80 0.53 -266.85 < 0.01

a. The negative binomial distribution was used for planned comparision.

23 watermelon leaf. Black columns: healthy thrips on thrips-inoculated plants (number of prepupa = 16); Watermelon silver mottle virus (WSMoV)-infected thrips on thrips-inoculated plants (number of prepupa = 28); Grey columns: healthy thrips on thrips-damaged plants (number of prepupa = 20); WSMoV-infected thrips on thrips-damaged plants (number of prepupa = 15); White columns: healthy thrips on healthy plants (number of prepupa = 32); WSMoV-infected thrips on healthy plants (number of prepupa = 28). Different letters indicate statistical differences between means at P < 0.05 analyzed by negative binomial distribution.

0 50 100 150

Developmental time (hours)

Healthy thrips WSMoV-infected thrips ab

b

a a

c b

24 4. 南黃薊馬成蟲之取食偏好性

將 南黃 薊馬 成 蟲釋放於 健康植株 及 經 薊 馬 取食 的植 株 之間， 雌薊 馬在 2、8、12、24 或雄薊馬在釋放 2、12、24 小時均對薊馬取食植 物有較高的 偏好性 (圖七)。當南黃薊馬釋放於經薊馬取食及薊馬接種感染 WSMoV 的 植株間，雌薊馬在任何時間點對兩種植物的偏好性沒有差異，雄薊馬於釋放 2、 4 小 時 對薊 馬 接 種 感染 WSMoV 的 植株 有 較 高 的 偏好 性 (圖 八)。 這指 出 WSMoV 的感染可增加雄薊馬對植株的偏好度。當 南黃薊馬 釋放於健康 植株及薊馬接種感染 WSMoV 的植株間，雄薊馬在釋放後 4、8、12、24 小 時或雌薊馬在任何時間點對薊馬接種感染 WSMoV 的植株有較高的偏好性 (圖九)。結果顯示南黃薊馬偏 好取食感染 WSMoV 的植株。

25 thrips-damaged (grey columns) and healthy seedlings (white columns) in three trials. (B) Number of female thrips adults on thrips-damaged (grey columns) and healthy seedlings (white columns) in three trials.

Ten adults were released between the two seedlings at the beginning of the experiment. * and ** indicate significant differences (P < 0.05 and P < 0.01) between numbers of thrips adults on thrips-damaged and healthy seedlings by sign test. Error bars indicate the standard error of the mean.

0

Time after thrips release (hours)

(A) (B)

Time after thrips release (hours)

26 Watermelon silver mottle virus (WSMoV)-infected watermelon seedlings. (A) Number of male thrips adults on thrips-damaged (grey columns) and WSMoV-infected seedlings (black columns) in three trails. (B) Number of female thrips adults on thrips-damaged (grey columns) and WSMoV-infected seedlings (black columns) in three trials. Ten adults were released between the two plants at the beginning of the experiment. * and

** indicate significant differences (P < 0.05 and P < 0.01) between numbers of thrips adults on thrips-damaged and WSMoV-infected seedlings by sign test.

Error bars indicate the standard error of the mean.

0

Time after thrips release (hours) Time after thrips release (hours)

27

Fig. 9. Feeding preference of Thrips palmi adults to thrips-damaged versus Watermelon silver mottle virus (WSMoV)-infected watermelon seedlings. (A) Number of male thrips adults on healthy (white columns) and WSMoV-infected seedlings (black columns) in three trials. (B) Number of female thrips adults on healthy (white columns) and WSMoV-infected seedlings (black columns) in three trials. Ten adults were released between the two plants at the beginning of the experiment. * and

** indicate significant differences (P < 0.05 and P < 0.01) between numbers of thrips adults on thrips-damaged and WSMoV-infected seedlings by sign test. Error bars indicate the standard error of the mean.

0

Time after thrips release (hours) Time after thrips release (hours)

28 et al., 1999a; Whitfield et al., 2005)。另外，煙草花薊馬的一齡與 二齡幼蟲也 可以傳播 TSWV (Sakimura, 1963)。東方番茄薊馬 (Ceratothripoides claratris) 傳 播 與 WSMoV 相 同 血 清 群 之 番 椒 黃 化 病 毒 (Capsicum chlorosis virus, TSWV 雌薊馬成蟲與雄薊 馬成蟲的取食 電 位 (electrical penetration graphs)，