電極－

(2)以 20 V 的電流轉印 15 小時或以 25 V 的電流轉印 12 小時，將蛋 白質轉印到 PVDF 上。轉印後，將 gel 取出觀察轉印之效果；PVDF 則進行西方墨點法。

圖 4-1. 蛋白質轉印 (資料來源：黃依婷,2009)

PVDF膜 海綿

3M紙

膠

電極＋

電極－

3M紙 海綿

IV. 免疫點墨法 (Immunoblotting)

(1)將蛋白質已轉印完成之 PVDF 膜用 Blocking solution 振盪 30 分鐘，

以 5% BSA 作為溶劑，分別將欲測之一級抗體稀釋至適當濃度，

加入 PVDF 膜並使其均勻的覆蓋於膜上，再置於水平式旋轉器上 室溫以 50rpm 反應 2 小時後，接著置入 4℃冰箱之水平式旋轉器 上繼續以 50rpm 反應至隔天。

(2)自冰箱取出 PVDF 後，用 PBST 洗兩次，每次 3-5 分鐘，轉速為 100 rpm。依不同的一級抗體，加入特異作用的二級抗體，稀釋 倍數為 5000 倍，置於水平式旋轉器上於室溫振盪 2 小時，用 PBST 洗三次，每次 3 分鐘，轉速為 100 rpm 以清洗未接合二級抗體，

同時也可以降低背景值。

(3)接著使用冷光影像儀器，將 PVDF 膜以塑膠夾子置入黑色金屬盤 上，蛋白面朝上，將已 1:1 混合的 Chemiluminesent Substrate 以 pippet 加入於膜上，再依不同抗體的螢光強弱決定曝光時間。

八、流式細胞儀分析 (flow cytometry) (Lekmine et al., 2007) 1. 原理

(1) 細胞週期(cell cycle)

細胞週期可分為四個時期，G1 phase、G2 phase、S phase、M phase。

代表的意義也不盡相同，各時期的 DNA 含量會因為週期的循環複 製而有所差異；G2 phase 的 DNA 含量約為 G1 phase 的兩倍，而 S phase 的 DNA 含量則居於兩者之間。因此可利用螢光物質來標示細 胞 中 的 DNA 的 含 量 來 決 定 週 期 ， 之 後 再 利 用 FACS (fluorescence-activator cell sorter) 進行 DNA 含量分析。

2.試劑配製

(1) Propidium iodide (PI)染劑: 以下為每 mL 的比例 100 μg/ mL Propidium iodide (4℃)：40L

10% TritonX-100 (4℃)：100L 100 mg/ mL RNase A (-20℃)：5L 1X PBS：855L

(2) 70%分生酒精:

取用 99.8%分生專用酒精，用二次水稀釋至 70%，保存於-20℃。

3. 方法

(1)將 B16F1 及 B16F10 黑色素瘤細胞培養於含有 10% FBS、

1%NEAA、1% Glutamate 的 DMEM/High glucose 培養液中，

並皆以 1×10⁶種於 60 mm dish。

(2)隔天細胞貼壁後，換成無血清之培養液培養 24 小時，使之同週 期化。

(3)加入不同濃度 AC-10 (0-120g/ml)，於培養箱培養 24 小時。

(4) 24 小時後，取出培養盤用 trypsin 將細胞取下，收集於 15mL 離心管中，以 1600 rpm、離心 10 分鐘。

(5)去除上清液，加入 1 mL PBS 將細胞 pellet 完全打散後，再次以 1600 rpm、離心 10 分鐘。

(6)倒掉用於清洗的 PBS 後，以-20℃的 70%冰酒精進行細胞固定 步驟，將震盪器轉速調 ”3”，並緩慢的將 3 mL 之酒精以

pipetment 滴入，之後使用流式細胞儀(Flow cytometry; FACS)分 析細胞週期。

(7)固定結束後之細胞可保存於-20℃約一週；上機步驟為將樣品從 -20℃冰箱取出後離心 1600 rpm、10 分鐘以去除酒精。

(8)加入 10 mL 的 PBS 將細胞完全打散，做為清洗用途，並離心 1600 rpm、10 分鐘。

(9)去除 PBS 後，在每個 15mL 離心管中各加入 500 μL 的 PI stain mixture，用 1 mL pipette 在 15 mL 離心管中抽吸數次後，將細

胞移於絹布製的篩子過濾到 FACS 專用管，避光並置於冰上反 應 30 分鐘。

(10)以流式細胞儀(Flow cytometry; FACS)進行樣品分析，每一 秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數據收集 10000 顆細胞，

數據以 Modfit LT^®軟體進行處理分析，每個實驗組皆三重複。

九、免疫螢光染色( immunofluenrence) (Maher et al., 2009) 1. 原理

透過化學或免疫的方法將螢光素標記在抗體上，使之成為螢光抗 體，利用螢光素標記的抗體，在一定條件下與細胞表面的抗原特異 結合。結合在細胞表面的螢光素在一定波長激發光照射下，發出一 定波長的螢光，最後使用螢光顯微鏡觀察、檢測分析。

2. 試劑

(1) 4% paraformaldehyde/PBS：將paraformaldehyde於PBS中加熱溶解 後，置於4℃貯存。

(2) 0.1% Triton X-100/PBS：配置後於4℃貯存。

(3) 10%FBS/PBS：配置後於4℃貯存。

(4) 1.5% FBS/PBS：配置後於4℃貯存。

(5) 6% BSA/PBS：配置後於4℃貯存。

3. 方法

(1)將 B16F1、B16F10 黑色素瘤 cell (2×10⁴)種於八孔 chamber slide (2)隔天細胞貼壁後，加入不同濃度的 AC-10 (0-200g/ml)，於培養 箱培養 24 小時。

(3)24 小時後抽掉原有的培養液，以 PBS 清洗一次，各加入 200 μL/well 的 4% paraformaldehyde/PBS 於培養箱固定 15~30 分鐘。

(4)去除原有的 4% paraformaldehyde/PBS，以 PBS 清洗兩次，加入 0.1% Triton X-100/PBS (200μL/well)於培養箱反應 10 分鐘，增加 細胞膜的通透性。

(5)去除原有的 0.1% Triton X-100/PBS，以 PBS 清洗兩次。

(6)使用 10%FBS/PBS (200μL/well)鋪背景 1 小時後，移除 10%

FBS/PBS，直接加入第一級抗體（1：250，1.5% FBS/PBS 稀釋）

(anti- -catenin antibody) 200μL/well，置於 37℃、5% CO2中培 養 2 小時。

(7)回收第一級抗體，用 PBS 洗兩次，每次 3 分鐘。再加入螢光二 級抗體(1:200，6% BSA/PBS 稀釋)，避光靜置於室溫一小時。

(8)接著移除第二級抗體，用 PBS 洗三次，每次 3 分鐘。

(9)加入 DAPI (200μL/well) (1:1000，1X PBS 稀釋)避光置於室溫 靜置反應 5 分鐘。

(10)去除DAPI染劑後，以PBS清洗2次，即可在螢光顯微鏡下觀察 並拍照(200X)。

(11)再使用 mounting gel 封片，並置於 4℃保存。

十、轉型作用(transformation) (Chang et al., 2009) 1. 原理

轉型作用可以為任何形式之 DNA 進入不同的細胞中，如動物、植 物等。通常擔任此媒介為勝任細胞(Competent cells)，所謂勝任細胞 現廣泛地被定義為可吸收 DNA 者，通常為大腸桿菌(E.Coli)，但大 部分的細菌只能吸收少量的 DNA，因此會使用物理性或是化學性 的方式，例如熱休克(Heat Shock)或是電穿孔方式將帶有外來 DNA 的質體轉入勝任細胞(Competent cells) 中，藉由寄主細菌的系統來 達成複製或進行基因表現的目的(圖 3-2.)。

圖 4-2.轉型示意圖

2. 試劑

(1)DH5 competent cell：即 E.Coli(Yeastern Biotech)，儲存於-80℃。

(2)50g/mL Ampicillin

(3)LB medium：25g LB粉末加入1000mL二次水，使用滅菌鍋高溫高 壓溶解後置於4℃。

(4)LB Agar：20g LB agar 粉末加入500mL二次水，使用滅菌鍋高溫 高壓溶解，待其溫度稍微降低，加入Ampicillin，並分裝至10cm dish，20mL/10 cm dish；待Agar凝固後，置於4℃保存。

3.方法：

(1)在開始transformation前，取出欲使用LB Agar放置37℃ incubator 中回溫；並將水浴鍋開至37℃備用。

(2)從-80℃冰箱拿出E.Coli，立刻流水解凍。

(3)將一管E.Coli (100L/管)分成33L/1.5mL enpendorff，可分成3 管，分裝完後置於冰上備用。

(4)加入 3L 的 circular DNA 加入分裝後的 E.Coli 中，並放回冰 上備用，注意不能 pipetting。

(5)將加好的 DNA 和 E.Coli 放入 37℃水浴鍋加熱 10 分鐘，注意不 能移動到 eppendorff。

(6)將加熱後的 DNA 和 E.Coli 放置於冰上 5 分鐘。

(7)點酒精燈，使周遭環境保持無菌，並且避免說話。將 5-10L 的 Mixture 塗上已回溫的 LB Agar 上。

(8)將已塗上菌的 LB Agar 盤正放於 37℃培養箱中 10 分鐘，而後倒

十一、質體抽取(plasmid DNA extraction) (Chang et al., 2009) I. 質體小量製備

先將搖菌管置入 3mL 的 LB medium，並加入 10L 的 50g/mL Ampicillin。以 10L 的 tip 在長了菌落的 LB Agar 上挑取，並放入 搖菌管中，置於 37℃培養箱中以 150-200 rpm 的轉速搖 12-16 小時。

II.質體大量製備

先將以滅過菌的錐形瓶置入 200mL 的 LB medium，並加入 2mL 的 50g/mL Ampicillin。將小量菌液取 2mL 放入錐形瓶中，置於 37℃

培養箱中以 150-200 rpm 的轉速搖 12-16 小時。

III.抽取質體 1.原理：

質體 DNA 是一種獨立於染色體 DNA 外的環狀小分子 DNA，通常 只有數千個鹼基對（bp），它具有自行複製的能力，也因如此，在 生物技術之應用上，質體 DNA 常被用來作為載體以選殖特定的 DNA 以及表現特定的蛋白質用。 抽取質體 DNA 的方法有很多 種，其中最常用的方法為 『鹼性溶解法』（alkaline lysis），其原 理是利用鹼處理質體 DNA 和染色體 DNA，使兩者雙股打開呈單股 狀態，再加入酸中和鹼使得單股 DNA 回復成為雙股 DNA。細菌以 NaOH 及 SDS 分解，並使蛋白質及 DNA 變性，繼之以酸中和。因 此，小分子質體 DNA 在中和後恢復原態，但大部份的細菌染色體 DNA 則無法完全復原而與 SDS-K⁺ 所形成之複合物一起沉澱下，可 以離心去除，而上清液中所含的質體則可以酒精或異丙醇將其沉澱

下來。另外，將分離下來的質體，以不同限制酵素作用，經電泳分 離 DNA 片段後，比較各 DNA 片段之分子量，用以檢定所分離到的 質體之正確性。(參考資料：國立嘉義大學基礎生物技術實驗室)

圖 4-3. 為 Plasmid Extraction kit 操作流程模擬圖 (資料來源：FAVORGEN)

Culture bacteria cells

Harvest bacteria cells Resuspend (PM1) Lyse (PM2) Neutralize (PM3)

DNA Binding Washing (PW Buffer)

DNA Elution by gravity flow (PEL Buffer)

Precipitate DNA (Ethanol) Washing

Dissolve DNA Equilibrate Plasmid Midi

Columns by gravity flow (PEQ Buffer)

Centrifuge

Centrifuge

2.試劑：

(1)使用購製於 FAVORGEN 之 Plasmid DNA Extraction Maxi Kit 檢測，內容物有:

Items Contents

PEQ Buffer 135mL*2

PM1 Buffer 215mL*2

PM2 Buffer 215mL*2

PM3 Buffer 215mL*2

PW Buffer 165mL*4

PEL Buffer 215 mL*2

RNase A (50mg/mL) 430 L*2 PM Maxi Column 20 pcs (2)異丙醇

(3)70%分生酒精:取用 99.8%分生專用酒精，用二次水稀釋至 70%，保存於-20℃。

3.方法：

(1)將 PM Maxi Column 放置於 50mL 的離心管之上，加入 12.5mL 的 PEQ Buffer 使之緩慢通過 column，而達到沖洗效果，沖洗 完畢後倒掉濾出液，將 Column 內放置紗布備用。

(2)將錐形瓶的菌液倒入 50mL 離心管，45mL/管，共可倒成四管，

於 4℃離心 6000xg、15 分鐘。

(3)倒掉上清液，加入 PM1 Buffer (已加入 RNase A) 5mL/管和 pellet 混合。

(4)加入 PM2 Buffer 5mL/管，並且緩慢的左右搖動管身約 15 次。

不要 vortex 以避免 genomic DNA 的釋出。

(5)室溫放置五分鐘，此時溶液應呈現清澈狀。

(6)加入 PM3 Buffer 5mL/管，並立刻反轉管身約十次，使之混勻。

(7)4℃離心 15000xg、20 分鐘。

(8)把上清液倒入已沖洗過之 PM Maxi Column，並使其緩慢過 濾，倒掉濾出液。

(9)去除紗布後，加入 30mL 的 PW Buffer 至 PM Maxi Column，

並使其緩慢過濾，倒掉濾出液。

(10)將 PM Maxi Column 放置在新的 50mL 離心管上，再加入 15mL 的 PEL Buffer 並使其緩慢過濾，以溶解 DNA。

(11)去除 PM Maxi Column，加入 11mL 的異丙醇，反轉瓶身約 10 次。

(12)4℃離心 20000xg、30 分鐘。

(13)小心的移除上清液，並且以 5mL 的 70%室溫分生酒精清洗，

緩慢的搖動瓶身達到清洗作用。

(14)4℃離心 20000xg、10 分鐘。

(15)小心的移除上清液，並且將 DNA pellet 放置於操作台中風 乾，風乾後的 pellet 呈現透明狀。

(16)以滅過菌的二次水回溶 DNA pellet。

(17)使用 Nano Drop 1000 Spectrophotometer 作測定，測定 DNA 在 260 nm 及 280 nm 吸光值之比較，由數值大小判定 DNA 的純度。OD260/OD280＝1.8 表示 DNA 的純度高，若數值

<1.8，表示純度低，故單由 OD260測得的 DNA 含量較不可

十二、轉染作用(transfection) (Park et al., 2005) 1.原理:

常用的轉染技術是將外源基因使用特殊的方法送入細胞表現，轉染 作用通常分為過渡性轉染（transient transfection）及穩定性轉染

（stable transfection）兩種類型，前者是將基因送入活細胞內，但不 會嵌入細胞的染色體中，其基因表達分析一般可在2~3天內進行。

後者是將基因傳送入活細胞，被送入細胞內的基因不是嵌入染色體 基因中，而是成為基因附體（episome）存在於細胞內。常用的方法 為磷酸鈣（calcium phosphate）、DEAE-dextran、脂小體（liposome）、

電穿孔（electroporation）、顯微注射（microinjection）、病毒感染

（retrovirus infection）以及基因槍（gene-gun）等轉染方式。

本實驗是採用脂小體(liposomes)的方式， DNA帶負電之磷酸根會與 脂小體表面之正電荷結合，脂小體帶正電荷的部分又會與細胞表面 帶負電荷的唾液酸（sialic acid）結合，藉以進行轉染(圖3-4)。

圖4-4.為liposome轉染示意圖 (資料來源：Molecular Station Website)

2.試劑:

(1)Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, U.S.A.) (2)OPTI-MEM

(3)DNA與Lipofectamine mixture：

A溶液: 50L OPTI-MEM、TOP/FOP (0.4g/well)、green fluorescent protein,GFP (0.2g/well)、-galactosidase(0.2g/well)

B溶液: 50L OPTI-MEM、2μl Liofectamine 2000(per well)

B 溶液配好後，靜置 5 分鐘；之後將 A 溶液緩緩加入 B 溶液中，

離心管上下緩慢混合，勿使用震盪器或劇烈搖動，靜置 20 分鐘 即可開始實驗。

3.方法:

(1)將 B16F10 黑色素瘤細胞(5×10⁴)種於 24 well 中。

(2)隔天以 PBS 清洗兩次並更換不含抗生素、FBS、Glutamine 之培 養液，等待 5 小時以上。

(3) 先 將 細 胞 的 培 養 液 更 換 成 0.5mL/well 不 含 抗 生 素 、 FBS 、

(3) 先 將 細 胞 的 培 養 液 更 換 成 0.5mL/well 不 含 抗 生 素 、 FBS 、

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/41330 (頁 93-135)