AC-10 主成分(AC-0)對小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 之存活率 與生長情形的影響

1. AC-10 主成分(AC-0)對人類上皮角質細胞、小鼠黑色素瘤細胞 B16F1 及 B16F10 及人類黑色素瘤細胞 A2058 之細胞存活率(cell viability)影響

AC-0 為 AC-10 主成份，欲探討 AC-0 對不同類型之皮膚細胞傷害 性，因此以不同濃度之 AC-0 (0、5、10、15、20μM)，分別處理人 類上皮角質細胞 HaCaT、低轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F1、高 轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 以及人類黑色素瘤細胞 A2058 (5×10⁴/well)，作用 24 小時後，在 AC-0 (0-20μM)之濃度點可觀察 到 AC-0 對人類角質細胞 Hacat 並無細胞毒殺性，存活率皆約 90%；對於人類黑色素瘤細胞 A2058、低轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F1 以及高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 之細胞存活率分別 約 70~90%、50~70%、10~80%，因此後續實驗皆選取高轉移性小 鼠黑色素瘤細胞 B16F10 來進行探討研究(圖 5-24.)。

2. AC-10 主成分(AC-0)對高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 之細胞 型態(cell morphology)影響

以 AC-0 (0、5、10、15、20μM)處理小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 (5×10⁴/well)24 小時後，利用倒立式光學顯微鏡觀察細胞形態之變 化情形。由結果發現，隨著 AC-0 劑量的增加，細胞數目有明顯下 降的趨勢，同時有細胞變形、細胞萎縮(Cell shrinkage)、失去與鄰 近細胞的接觸以及死細胞懸浮於培養液之現象(圖 5-25.)。

第二節 AC-10 主成分(AC-0)對高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 W n t /  - c a t e n i n p a t h w a y 之調控

1. AC-0 對高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 之 W n t /  - c a t e n i n p a t h w a y p r o t e i n 之 影響

選取 AC-0(0、5、10、15、20μM) 對高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10(1×10⁶/10 cm dish)進行 Wnt 蛋白質表現之實驗，處理 24 小時後，由西方墨點法觀察到 B16F10 細胞之 Wnt 生長因子 Wnt- 5a；cannonical W n t /  - c a t e n i n p a t h w a y 特 有 表 現 之 LRP6；

以及 D v l、A x i n、 - c a te n i n 皆 有 隨 著 濃 度 增 加 而 抑 制 的 趨 勢 (圖 5-26.)。

2. AC-0 對高轉移性小鼠黑色素瘤細胞 B16F10 之 - c a t e n i n 入 核 表 現 影響

 - c a t e n i n 的 轉 位 入 核 表 現 可 啟 動 下 游 標 的 基 因 ，進 而 造 成 細 胞 增 生 及 轉 移 等 現 象， 因 此 利用西方墨點法觀察到 AC-0 可減少 B16F10 細胞核內 - c a t e n i n 表 現 ； 同 時 另 外 發 現 細 胞 質  -c a te n i n 表 現 也 遞 減 (圖 5-27.)。 另 外 ， 利用細 胞免疫螢光染色法直接觀察 -c a te n i n 入核表現，發現 AC-0 可 使 B16F10 的 -c a t e n i n 入 核 表 現 減 少 (圖 5-28.)。

3. AC-10 主 成 分 (AC-0) 對 高 轉 移 性 黑 色 素 瘤 細 胞 B16F10 中 W n t /  - c a t e n i n p a t h w a y 調 控 之 下 游 蛋 白 表 現 影 響

由上述結果可知 AC-0 可抑制 -c a te n i n 轉 位 入 核 ， 因 此 欲 探

觀察到 B16F10 中 W n t /  -c a te n i n p a t h w a y 調 控 的 特 異 性 因 子 如 c - my c 、 c y c in D 1 及 s u r v iv i n ， 這 些 轉 錄 因 子 可 調 控 細 胞 增 生 及 細 胞 凋 亡 ， AC-0 皆可減少其蛋白的 表 現 量 (圖 5-29.)。

4 . AC-10 主成分(AC-0)對 - c a t e n i n 蛋 白 的 降 解 調 控

由 前 述 結 果 得 知 細 胞 質 中  -c a te n i n 表 現 量 也 隨 著 AC -0 的 劑 量 效 應 而 減 少 表 現 量 ， 因 此 推 測  -c a te n i n 可 能 因 為 蛋 白 質 降 解 而 失 去 表 現 。  -c a te n in 在 細 胞 質 中 被 G S K 3  、 A x i n 、 A P C 組 成 之 降 解 複 合 體 磷 酸 化 後 可 走 向 p r o te a s o ma l d e g ra d a t io n ， 因 此 欲 探 討 A C-0 是否可影 響 -c a te n in 磷 酸 化 作 用 。 首 先 發 現 給 予 AC -0 後 ， P h o s p h o - G S K 3   失 活 態 之 G S K 3   具 有 顯 著 意 義 的 減 少 ； 再 者 ，  P ho s p h o - -c a te n in 蛋 白 表 現 量 ， 亦 有 顯 著 意 義 的 增 加 (圖 5-30. )， 因 此 可 推 測  - c a te n in 是 經 由 p r o t e a s o me 途 徑 降 解 而 減 少 表 現 量 。 再 利用 proteasome inhibitor (MG-132)與 AC-0 15μM 共同處理 B16F10 細胞 24 小時，

由結果發現，MG-132 與 AC-10 共同處理組可阻止 -c a te n i n 表 現 量 減 少 ， 表示 AC-10 的確影響 -c a te n in 蛋白降解路徑(圖 5-31. )。

5 . AC-10 主成分(AC-0)對降解 - c a t e n i n 之 G S K 3  依 賴 型 調 控 已 知 G S K 3  、 A x i n 、 A PC 組 成 之 降 解 複 合 體 可 磷 酸 化

 - c a t e n i n 而 導 致 降 解 ， 因 此 欲 探 討 AC - 0 是 否 依 賴

50M 與 AC-0 15μM 共同處理 B16F10 細胞 24 小時，由結果發現，

相較於單獨給予 AC-0 組別，SB216763 與 AC-0 共同處理組無法阻 止 -c a te n in 表 現 量 減 少，表示 AC-0 降解 -c a te n in 之 調 控 為 GSK3 非 依 賴 型 (圖 5-32. )。

6 . AC-10 主成分(AC-0)對 - c a t e n i n、 A xi n 、 G S K 3  蛋 白 複 合 體 的 調 控

由上述結果得知， - c a te n i n 可不依賴 GSK3而被磷酸化後降解，

為了確定 GSK3的無作用性，因此利 用 免 疫 沉 澱 法 (I P )探 討

 - c a t e n i n 與 其 降 解 複 合 體 ( d e s t r u c t io n c o mp l e x ) 的 蛋 白 間 交 互 作 用 ， 再利用西方墨點法觀察到 AC-0 的給予無法增加

 - c a t e n i n 與 GSK3 之 間 的 交 互 作 用 ； 但 可 使 複 合 體 蛋 白 A x in 增 加 表 現 量 (圖 5-33.)。

7 . AC-10 主成分(AC-0)抑制 - c a t e n i n 調 控 的 轉 錄 能 力 影 響 將 高 轉 移 性 小 鼠 黑 色 素 瘤 B1 6 F1 0 利 用 脂 小 體 轉 染 的 方 式 給 予 T o p p la s mid ( 內 含 TC F 的 4 個 b in d in g s ite ) 以 及 Fo p p la s mid ( 為 mu t a n t 之 TC F b in d s ite ) ， 以 偵 測 AC -0 對  -c a te n in 調 控 之 轉 錄 能 力 的 影 響 。

給 予 AC -0 (0、5、10、15、20μM)處理 24 小時後， 可 觀 察 出 A C - 0 的 確 具 有 劑 量 效 應 抑 制  - c a t e n i n 調 控 的 轉 錄 活 性 ( 圖 5 - 3 4 . ) 。

8 . AC-10 主成分(AC-0)對 - c a t e n i n m R N A 表 現 量 的 影 響

察 -c a te n in 基因表現是否同樣的也受到 AC-0 的調控，因此利 用 Reverse-Transcription PCR 去檢測分析。以 AC-0 15μM 分別處 理 B16F10 細胞 6、12、24 小時後，檢測  -c a te n in 的 mRNA 表 現量。由實驗結果得知，AC-0 的給予並不會改變 -c a te n i n 的 mR N A 表現。(圖 5-35.)

9 . AC-10 主成分(AC-0)對 - c a t e n i n 蛋 白 質 穩 定 性 影 響

由於 AC-0 並不會影響 -c a te n in 基因表現，因此接續探討 AC-0 使 -c a te n i n 表 現 量 的 減 少 ， 是 否 與 影 響  - c a te n i n 蛋 白 質 的 穩 定 度 有 關 ； 因 此 給 予 C H X ( 蛋 白 質 合 成 抑 制 劑 ) 探 討 蛋白質的半衰期變化是否會受到 AC-0 的調控。

a. 利用 Cycloheximide (CHX；translation inhibitor) (50μg/mL)單獨 處理 B16F10 細胞，發現 -c a te n in 蛋 白 質 半 衰 期 皆 為 1 2 小 時 左 右 (圖 5-36.)。

b. 利用 CHX (50μg/mL)與 AC-0 15μM 共同處理 B16F10 細胞 6 至 24 小時，發現  - c a t e n i n 蛋 白 質 半 衰 期 在 1 2 小 時 前 皆

無 變 化 ， 在 2 4 小 時 才 有 明 顯 的 減 少 ， 表 示 AC - 0 並 不 影 響  - c a t e n i n 蛋 白 質 的 穩 定 性 (圖 5-36.)。

第三節 AC-10 主成份(AC-0)誘發高轉移性小鼠黑色素瘤 B16F10 細