類核黃素的應用

第一章緒論

1.1 類核黃素的應用

核黃素是核黃蛋白的輔脢，因為其在生物體外難維持活性，故多以結構類似物模擬其生化行為，以下所列為部份 Phenothiazine 化合物可用以模擬核黃素，可視為類核黃素：

N S

H

₂

N NH

₂

Cl

-Thionine Chloride (TC)

Toluidine Blue O (TB)

N

Methylene Blue (MB)

Phenothiazine 具有氧化還原特性，可加速或抑制生物體內電子傳遞反應，若將此類分子修飾於電極表面，應具有生化感測器的應用潛力。根據本實驗室研究，Phenothiazine 可以電化學氧化聚合法與偶氮還原法修飾於電極表面。目前電化學氧化聚合法已廣泛應用於製備電化學感測器^(1~7)，至於偶氮還原法，理論上可將具有胺基的芳香族化合物依近似單層排列方式修飾於電極表面。本實驗室過去曾利用偶氮還原法製作修飾電極，並藉以探討物理化學性質⁽⁸⁾。本篇論文則嘗試利用這些方法製備化學修飾電極，藉以探討類核黃素其與蛋白質間的交互作用。

1.2 電化學石英晶體微天平

電化學石英晶體微天平（EQCM）是微量分析的有效工具之一，

主要是利用壓電石英晶體感測器(PQCM)⁽⁹⁾，以監測表面重量改變所引起的頻率變化，目前已廣泛應用於電化學研究中⁽¹⁰⁾，如電極特性探討⁽¹¹⁾、電活性物質吸附分析^(12,13)、介面動力學研究⁽¹⁴⁾與金屬電析⁽¹⁵⁾。

圖 1-1 QCM 應用潛力示意圖。

QCM 的發展源於 1880 年⁽¹⁶⁾，Jacques 與 Pierre Curie 發現若對石英等壓電材料施加應力會使材料本身之晶格重新排列而產生一極化電場。此時，若於材料兩側鍍上電極，即可測得一電位差，稱為壓電效應（piezoelectric effect）。他們也發現若於鍍有電極的壓電材料兩端施加電場，則可改變晶體形變方向，產生反壓電效應（converse piezoelectric effect），因此若對壓電材料施加交流電場時，晶體形變會產生規律性變化，圖 1-2 所示為壓電效應示意圖。

圖 1-2 壓電效應與反壓電效應之示意圖。

在1959 年，Sauerbrey⁽¹⁷⁾首先將壓電材料拿來作為偵測質量的工

Sauerbrey Equation 的基本假設是沈降於晶體表面之物質必須為硬體物且只形成單層堆積，故當晶體表面與液體接觸時，二者會因密度、

黏滯度差異顯現偏差。有鑒於此，Brukenstein 與 Shay⁽¹⁸⁾提出修正，

將液體厚度導入 Sauerbrey Equation 中。在同一年，Kanazawa 與 Gordon⁽¹⁹⁾也提出類似模型，推導出如式 1-2 所示的修正公式：

1.3 電化學阻抗分析儀

電化學阻抗分析儀（EIS）在早期的電化學文獻中稱為交流阻（AC impedance）。阻抗測量原本是電學中研究線性電路頻譜響應特性的方法之一，引進至電化學後，便成了研究電化學的一種重要技巧。交流阻抗分析法的主要特色，是可以在電化學系統中以常用的元件，如電阻（resistance , R）、電容（capacitance , C），建構等效電路（Equivalent circuit）以模擬系統中反應動力學。

一般而言，電極表面所遭遇的阻礙多來自於電極表面電子轉移所產生的阻抗，即電荷轉移阻抗(Charge transfer resistance , RCT)、電極表面電雙層對離子的阻抗，即電雙層電容（Double layer capacitance, Cdl）以及物質在溶液中的擴散，即稱 Warburg 阻抗（Zw），如圖 1-2 所示：

根據圖 1-2，我們可對待測系統施加一個微小擾動交流電壓，藉

圖 1-3 代表性 Nyquist 圖譜。

根據 Nyquist 圖譜，在高頻區可得到一近似半圓的圖形，而在低頻部分會出現一條近似 45 度的直線，可藉以求得 Warburg 擴散阻抗。

至於在高頻區，可得到電解質溶液的阻抗（Rs）以及電荷傳遞阻抗

（RCT）。

1.4 掃描式穿隧電流顯微鏡

掃瞄式穿隧電流顯微鏡是 Binnig 和 Rohrer 在 1980 年所發明，藉由探針與導體間的穿隧電流，可獲得原子級的影像解析度，惟樣品必須為導體。掃瞄式穿隧電流顯微鏡主要是利用量子力學的穿隧效應，

若對導電探針與樣品間施加偏壓，在兩者距離相當接近時，電子會越過古典力學中描述的能量障壁而產生電流，若將此電流值固定，則在掃瞄過程中，探針會隨樣品表面起伏而調整高度，進而描繪出表面影像，稱為定電流取像法(Constant current mode) 。

若將 STM 結合電化學分析，探針便可成為第四支電極，測得氧化還原反應進行時電極表面的即時影像。惟因探針的穿隧電流會感應到充電電流與法拉第電流的影響，因此探針必須適當絕緣，始能獲得清晰影像。

有鑒於上述技術的優點，本論文嘗試將蛋白質固定於電極表面，

利用 EIS 與 EQCM 觀察吸附蛋白質時所產生的阻抗與質量變化，間接證實 TB 具有蛋白質吸附潛力，並成功的觀察到蛋白質的吸附行為，也顯示出電化學技巧對於修飾電極電極吸附蛋白質的應用潛力。

第二章實驗

2.1 化學藥品

藥品名稱廠牌

1. Toluidine blue (TB) TCI 2. Glucose oxidase (GOx) Sigma

3. Ferritin (FT) Sigma

4. Deoxyribonucleic acid from salmon testes (ST) Sigma

5.Sodium nitrite Showa

6. Hydrochloric acid Fisher 7. Potassium chloride Showa

8. Sulfuric acid Echo

9. Ethanol Showa

10. Potassium ferrocyanide ACROS 11. Potassium hydroxide Showa

12. Ethyl acetate Tedia

13. 氮氣豐明氣體

14. 環氧樹酯 Huntington

15. 銀膠 Delta technologies

16. 銅膠 3M

17. STM 探針絕緣膠

露華濃經典指甲油

18. 高純水 Milli-Q reagent

2.2 實驗設備

儀器名稱廠牌規格

1. 工作電極 ITO 導電玻璃(Delta Tech),HOPG 2. 參考電極 SCE

3. 輔助電極 Pt 電極

4. 電位儀 Part 283、BAS-50 (Bioanalytical system)、

CHI 400 或 CHI 614A (CH instrument) 5. 交流阻抗分析儀 Autolab

6. 超音波震盪器 Fisher scientific FS5 7. 電子天平 Precisa 125A

8.電化學石英震盪天平 (1)電位儀: Model 283 (EG﹠G Instrument) (2)石英振盪分析儀: QCA917 (SEIKO EG﹠

(3) 9 MHz Au 石英晶片: 0.2cm² 9. 微量吸量管 Nichiryo model 5000DG

10. 原子力顯微鏡

Multimode AFM (NanoScope IIIA，

Digital instruments and Veeco Metrology，

Inc.，Santa Barbara，CA)

15. 非接觸式掃描顯微鏡探針

Budgetsensors TAP300Al

16. 接觸式掃描顯微鏡探針

Nanosensors PPP-XYCONTR

17. 鎢絲 (STM 探針用) GUV team (直徑 0.25 mm)

STREM CHEMICALS

20. Power Supply Model

Jaihsan 304C

21. 透明膠帶 3M

22. 斜口鉗 VICTOR

23. 接觸式導電掃描顯微鏡探針

AIST fpC10 TiN/Pt

2.3 類核黃素修飾電極：前處理與製備 A. ITO 電極製備：

1. 以鑽石刀將 ITO 導電玻璃切成約 0.5×1.0 cm²的面積大小。

2. 以銀膠連接 ITO 導電玻璃與單芯線。待銀膠固化後再以環氧樹脂將銀膠與單芯線裸露處完全密封，並加溫(160 ^oC)使環氧樹脂硬化。

3. 依序將電極置於 0.1 M H2SO4、0.1 M NH4OH、95% C2H5OH 與高純水中，以超音波震盪器震盪 5 分鐘。完畢，烘乾備用。

B. 類核黃素氧化聚合於 ITO 電極之製備：

1. 取類核黃素溶於高純水，濃度、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見類核黃素氧化聚合修飾之圖說。

2. 製備完成後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃瞄至 CV 圖譜穩定不變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。

C. 類核黃素偶氮修飾於 ITO 電極之製備：

1. 取類核黃素溶於 0.1 M 的鹽酸水溶液，濃度、亞硝酸鈉當量數、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見類核黃素偶氮還原修飾之圖說。

變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。

D. 各蛋白質或 DNA 溶液之製備

1. GOx 溶液：將 60 mg GOx 溶於 1mL 去離子水中，製備濃度為 60 mg/mL 的 GOx 水溶液。

2. Ferritin 溶液：將 Ferritin 溶於 10mL 去離子水中稀釋，製備濃度為 5 mg/mL 的 Ferritin 水溶液。

3. Salmon testes DNA 溶液：將 10 mg Salmon testes DNA 溶於 1 mL 去離子水中，製備濃度為 10mg/mL 的 Salmon testes DNA 水溶液。

2.4

交流阻抗分析儀器操作

1. 開啟交流阻抗儀 autolab，後再將電腦開啟，點選 autolab interface，

選擇 refresh 將儀器與電腦連線。

3. 開啟 FRA 程式，method → Potentiostaic → Single potential，在 Edit procedure → page 1→ 設定形式電位值。

4. 在 Edit frequencies → 設定頻率掃描範圍(10 kHz~0.1Hz)，振幅為

±10 mv，即可以開始測量樣品的交流阻抗值。

模擬元件→ R(C(RW)) → 觀看各元件的數據值以及誤差值 → File → Save convert (將模擬數據檔案轉換成 txt 檔)。

2.5 修飾電極之電化學石英震盪天平分析

1. 首先將 Au-coated QCM 電極置於 0.5 M H2SO4中以定電壓(-0.6 及 1.8 V)電解 300 秒，重複數次，直到電極顯現出乾淨 Au 表面應有的 CV 圖譜。

2. 將清洗乾淨之 QCM 電極置於含 6mL TB 溶液中，分別以氧化聚合與偶氮化修飾於電極，TB 溶液濃度與配製法、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見類核黃素氧化聚合修飾之圖說，並記錄電極頻率變化。

3. 將所得的 QCM|TB 電極改置入 6 mL 去離子水中，再將電極電壓定於 0 V，並 300 秒逐量添加蛋白質於溶液中，並記錄電極的頻率變化值。

4. 相關參數設定

A. Model 283 加入 QCM 功能:

1. Set up/ Edit/ AUX: 選擇 YES。

2. Defaults/ Experiment/ Data factors/ AUX：輸入正確 data factor。

Data factor= Δf output range ( in QCA917 )/ 10。

1. 按 MEMU(切換頻率顯示螢幕至功能設定螢幕)。

2. 按 ← 或 → (移動至Δf output range 螢幕，以↑或↓選擇所需的頻率下限)。

3. Δf 歸零: Δf standard frq.螢幕，自設頻率零點。

2.6 掃瞄式穿隧顯微鏡儀器操作步驟 A. STM 探針製備

鎢絲探針製備

1. 利用自製三叉夾與蝕刻筆固定鎢絲，調整鎢絲長度令其一端可侵入 4 M KOH 中達 0.5 cm 深，並保持與液面垂直，

以做出較為對稱的針尖。

2. 將鎢絲與電源供應器正極連接，並以另一支鎢絲與電源供應器負極連接，開啟電源，以直流電解分式進行下列氧化還原反應:

陽極 : W(S) + 8OH^-(aq⁾→ WO4

2-(aq) + 4H20 + 6e 陰極 : 6H2O + 6e^- → 3H2(g)+6OH^-(aq)

總反應 : W(S) + 2OH^-(aq⁾ + 2H2O→ WO4

2-(aq) + 3H2(g)

做為 STM 用探針。

4. 以去離子與丙酮反覆清洗探針，以去除殘留的 KOH，以氮氣吹乾備用。

鉑銥合金探針製備

1. 以鑷子緊夾鉑銥合金絲，再以斜口鉗以 10~15^o 角迅速裁剪之。

2. 於溶液中進行 ECSTM 影像分析時，探針須先絕緣，首先以鑷子夾住探針，再以小刷將指甲油液滴施於針尖後端約 0.5 cm 處，順勢往外滑出，使指甲油包覆針尖，並注意毛刷不可觸碰到探針，正反面各一次上述步驟即可，不可使探針針尖被完全絕緣，乾燥後移入收納盒備用。

B. 儀器操作步驟

1. 儀器開機前，先將電位儀與儀器以排線串接，並且將機台置於懸吊式避震系統上。

2. 依序打開機台與電腦，機台切換為 STM mode。

3. 開啟 Nanoscope R(III)程式，點選程式所示的”di”字樣，再從跳出的對話框選擇 Quadrexed EC MultiMode，以進入主要調控視窗。

膠導通，先用三用電表確認之。之後，再置入機台上。

5. 將 STM 探針以鑷子裝入 STM 專用的 Converter head，並與電位儀連接，可用肉眼確認探針尖端是否垂直朝下。

6. 利用機台上的板鈕調整下針，用肉眼觀察探針與樣本之間距離約 1 mm。

7. 進行 ECSTM 測量時，將有固定樣本之鐵片上方加上鐵氟龍反應槽，以螺絲鎖住四角，再將溶液注入，確定溶液沒有漏出後置於機台上，此時，Converter head 上的參考電極(銀絲) 與輔助電極(白金絲) 應置於溶液面下，並且與探針和樣本不能互相接觸。

8. 從控制程式中的 Universal Potentiostat 參數設定中的 Cell Select 從 Dummy 改為 Normal，Cell 改為 On，點選下針按鈕，待儀器發出聲響後即下針完畢，可以開始掃瞄並顯示影像於螢幕上。

第三章實驗結果與討論

圖 3-2 所示為在 1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2鹽酸溶液(0.1 M)

在文檔中類核黃素修飾電極分析與應用; 電化學分析 (頁 14-0)

第一章 緒論