類核黃素修飾電極分析與應用; 電化學分析
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(3) 目錄 圖表目錄…………………….....................................................................I 表目錄 ……………………………………………………………… ..VII 中文摘要 ................................................. i 英文摘要 ................................................ ii 第一章 緒論 .............................................. 1 1.1 類核黃素的應用...........................................................................1 1.2 電化學石英晶體微天平 ..............................................................3 1.3 電化學阻抗分析儀.......................................................................7 1.4 掃描式穿隧電流顯微鏡 ............................................................10 第二章 實驗 ............................................. 11 2.1 化學藥品..................................................................................... 11 2.2 實驗設備.....................................................................................13 2.3 類核黃素修飾電極：前處理與製備 ........................................15 2.4 交流阻抗分析儀器操作 .............................................................16 2.5 修飾電極之電化學石英震盪天平分析 .....................................17 2.6 掃瞄式穿隧顯微鏡儀器操作步驟 ............................................18 第三章 實驗結果與討論 ................................... 21 3.1 類核黃素修飾電極–修飾膜分析 ..............................................21.
(4) 3.2 修飾電極之交流阻抗分析 ........................................................31 3.3 蛋白質吸附含量分析.................................................................42 3.4 偶氮還原修飾電極之表面影像分析 ........................................53 第四章 結論........................................................................................... 66 第五章 參考資料 ......................................... 67 第六章 附錄 ............................................. 69.
(5) 圖目錄 圖 1-1 QCM 應用潛力示意圖。 ...............................................................3 圖 1-2 壓電效應與反壓電效應之示意圖。 ............................................4 圖 1-3 Randles 等效電路示意圖。 ...........................................................7 圖 1-4 代表性 Nyquist 圖譜。 .................................................................9 圖 3-1 以偶氮還原法修飾 TB 的示意圖。 ............................................21 圖 3-2 以偶氮還原修飾 TB 於 Au-QCM 電極表面之結果，其中掃瞄圈 數 10 圈。掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2 鹽酸溶液(0.1 M)。 .................................................................23 圖 3-3 以偶氮還原修飾法修飾 TB 於 Au-QCM 電極所得之 TB 吸附量 與掃瞄圈數關係。實驗條件如圖 3-2。 ................................................24 圖 3-4 以 AFM 探針刮除 ITO 電極表面 TB 吸附膜時所測得的 AFM 影像(a)與其厚度與刮除次數之關係(b)。(c)為所得膜厚與還原圈數之 關係。實驗條件：掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2 鹽酸溶液(0.1 M)。接觸力︰0.4 N；面積：1 × 0.5 m2，AFM 探針掃描速率：1 Hz。 ......................................................26 圖 3-5 TB 氧化聚合於電極表面示意圖 .................................................28 圖 3-6 以氧化聚合修飾 TB 於 Au-QCM 電極表面之結果，其中掃瞄圈 數 10 圈。掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 於 0.1M KCl. I.
(6) 溶液。.......................................................................................................29 圖 3-7 以 AFM 探針刮除 ITO 電極表面 TB 吸附膜時所測得的 AFM 影 像(a)與其厚度與刮除次數之關係(b)。(c)為所得膜厚與還原圈數之關 係。溶液為：1 mM 的 TB 於 0.1M KCl 溶液。接觸力︰0.4 N；面積： 1 × 0.5 m2，AFM 探針掃描速率：1 Hz。 ..........................................30 圖 3-8 1 mM Fe(CN)63-/4-的循環伏安圖譜。 .......................................32 圖 3-9 以偶氮還原法修飾的 ITO|TB 修飾電極添加(A) GOx（60 mg/mL） 、(B) Ferritin（5 mg/mL）與(C) Salmon testes DNA（10 mg/mL） 時所得的 EIS 圖譜，其中逐量添加體積為 40L，實點為模擬前，實 線為模擬後。...........................................................................................33 圖 3-10 串聯層模擬電路示意圖。 .........................................................35 圗 3-11 不同層數的串聯電路模擬圖(▲) 為原始實驗數據，模擬層數 分別為 (A) n = 0 (B) n = 1 (C) n = 2 (D) n = 3 (E) n = 4，模擬用的電極 為偶氮化 TB 修飾電極且表面含有吸附達飽和的葡萄糖氧化脢。..35 圖 3-12 蛋白質對 ITO|TB 偶氮環原修飾電極的 RCT 影響之比較圖，其 中(○) Salmon Testes；(△)Ferritin；(□) Glucose Oxidase。偵測電位： 0.175 V vs. SCE。頻率範圍：10k ~0.1 Hz。 ........................................37 圖 3-13 以氧化聚合法修飾的 ITO|TB 修飾電極添加(A) GOx（60 mg/mL） 、(B) Ferritin（5 mg/mL）與(C) Salmon testes DNA（10 mg/mL）. II.
(7) 時所得的 EIS 圖譜，其中逐量添加體積為 40 L，實點為模擬前，實 線為模擬後。...........................................................................................39 圖 3-14 蛋白質對 ITO|TB 氧化聚合修飾電極的 RCT 影響之比較圖，其 中(○) Salmon Testes；(△)Ferritin；(□) Glucose Oxidase。偵測電位： 0.175 V vs. SCE。頻率範圍：10k ~0.1 Hz。 ........................................41 圖 3-15 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 GOx（濃度 60 mg/mL，體 積 40L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。GOx 吸附量與其濃 度之關係。...............................................................................................43 圖 3-16 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 Ferritin（濃度 5 mg/mL，體 積 40L）時所測得的頻率與質量變化關係（上）。Ferritin 吸附量與 其濃度之關係。 ......................................................................................44 圖 3-17 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 Salmon Testes DNA（濃度 10 mg/mL，體積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。DNA 吸附量與其濃度之關係。 ......................................................................45 圖 3-18 三種蛋白質在 TB 偶氮還原修飾電極上的吸附比較。 .........46 圖 3-19 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 GOx（濃度 60 mg/mL，體 積 40. L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。GOx 吸附量與. 其濃度之關係。 ......................................................................................48 圖 3-20 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 Ferritin（濃度 5 mg/mL，體. III.
(8) 積 40. L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。Ferritin 吸附量. 與其濃度之關係。 ..................................................................................49 圖 3-21 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 Salmon Testes DNA（濃度 10 mg/mL，體積 40L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。DNA 吸附量與其濃度之關係 ..........................................................................50 圖 3-22 三種蛋白質在 TB 氧化聚合修飾電極上的吸附比較。 .........51 圖 3-23 兩種修飾膜於電極表面的示意圖。 ........................................52 圖 3-24 . (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面影像，其中 TB 是由偶氮化修飾而得。Scan size 500 nm × 500 nm，Data scale：20 nm，掃描速率 1 Hz。 .................54 圖 3-25 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面影像，其中 TB 是由氧化聚合法製備而得。 Scan size 500 nm × 500 nm，Data scale：20 nm，掃描速率 1 Hz。 .55 圖 3-26 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面粗糙度分析，其中曲線(A)為偶氮化修飾的電 極，而(B)為以氧化聚合而得。 .............................................................56 圖 3-27 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 在液相中所得的 STM 影像，其中 TB 是以偶氮環化修飾琺 製備而得。Scan size: 200 nm × 200 nm，穿隧偏壓：100mV，Data scale：. IV.
(9) 10 nm，掃描速率：15 Hz，溶液：二次去離子水。 ..........................58 圖 3-28 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 極在液相中所得的 STM 影像，其中 TB 是以氧化聚合法修 飾，Scan size：200 nm × 200 nm，穿隧偏壓：100mV，Data scale：5 nm， 掃描速率：15 Hz，溶液：二次去離子水。.........................................59 圖 3-29 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 在液相中所得的 STM 影像面粗糙度分析。其中曲線(A)為 偶氮化修飾的電極，而(B)為以氧化聚合而得。 .................................60 圖 3-30 以 AFM 導電探針對(A) ITO|TB|FT、(B) ITO|TB 與(C) ITO 所 測得的 I-V 曲線，掃瞄速度：1.97 Hz。 ..............................................61 圖 3-31 以偶氮修飾法所得的 ITO|TB 電極(a)吸附 FT (b)、GOx (c)、 與 ST (d)所測得之 C-AFM 影像，掃瞄速度：1 Hz，掃瞄範圍：1m × 1 m，Data scale：5 nA。......................................................................62 圖 3-32 以氧化聚合法所得的 ITO|TB 電極(a)吸附 FT (b)、GOx (c)、 與 ST (d)所測得之 C-AFM 影像，掃瞄速度：1 Hz，掃瞄範圍：1m × 1 m，Data scale：5 nA。......................................................................63 圖 3-33 以自製鉑銥合金探針在二次去離子水溶液中觀察單一鐵蛋白 吸附顆粒影像，Scan size: 80 nm × 80 nm，穿隧偏壓 : 100 mV，Data scale :10 nm，掃描速率：15 Hz ............................................................65. V.
(10) 圖 6-1 測量實驗時間對於 EIS 實驗的影響，測量時間分別為(A) 0 分 鐘 (B) 20 分鐘 (C) 40 分鐘 (D) 60 分鐘 (E) 80 分鐘 (F) 100 分鐘。 ...................................................................................................................69 圖 6-2 不同濃度的 Fe(CN)63-/4-進行穩定度測試，在濃度為(A) 1 mM (B) 2 mM (C) 3 mM (D) 4 mM 的 Fe(CN)63-/4-每 20 分鐘測量一次阻抗。70 圖 6-3 不同類核黃素修飾電極對於 60 mg/mL GOx 阻抗分析。 .....71. VI.
(11) 表目錄 表 3-1 以三層串聯電路進行電腦模擬所得各元件數值，其中 ITO|TC|GOx、ITO|TC|FT 與 ITO|TC|ST 為 ITO|TC 電極上蛋白質吸附 達到飽和時的代表數值。 ......................................................................16 表 3-2 模擬數據誤差（%）。 .................................................................16 表 3-3 以三層串聯電路進行電腦模擬所得各元件數值，其中 ITO|TC|GOx、ITO|TC|FT 與 ITO|TC|ST 為 ITO|TC 電極上蛋白質吸附 達到飽和時的代表數值。 ......................................................................20 表 3-4 模擬數據誤差(%) .......................................................................20 表 3-5 各種顯影技術對蛋白質粒徑進行分析所得結果比較 ..............44. VII.
(12) 摘要 本實驗室曾對Phenothiazine化合物的物理化學性質進行探討，發 現這類化合物，如toluidine blue，具有類似黃核素的電子傳遞特性以 及作為蛋白質吸附劑的應用潛力，並可藉由電化學技巧修將之飾於電 極表面。根據這些性質，本論文藉由phenothiazine以及電化學技巧如 交流阻抗分析法（Electrochemical impedance spectroscopy，簡稱EIS） 與電化學石英振盪天平（Electrochemical quartz crystal microbalance， 簡稱EQCM），對蛋白質進行定量分析。實驗結果顯示：若將toluidine blue固定於導電玻璃電極上後，再以Fe(CN)63-/4-作為分子探針，分子 探針在電極表面的電子傳遞阻抗（Charge transfer resistance）會因蛋 白質添加而逐漸上升，其中以葡萄糖氧化脢的影響最鉅。EQCM分析 也顯示類似結果，與EIS所得結果極為吻合。此外，我們也利用原子 力顯微鏡（Atomic force microscope，簡稱AFM）與掃瞄式穿隧顯微 鏡（Scanning tunneling microscope，簡稱STM）觀察蛋白質在電極表 面的吸附行為。根據實驗結果，我們證實Phenothiazine化合物具有作 為蛋白質分子膠的應用潛力，也證實交流阻抗與電化學石英振盪天平 技巧是分析蛋白質含量的有效工具之一。 關鍵字 : 交流阻抗分析，電化學石英振盪天平，類核黃素。. i.
(13) Abstract Phenothiazines, such as toluidine blue, are useful model compounds for mimicking the electron transfer in riboflavin system. Since they are also effective molecular glues for proteins, we carried out studies in this thesis to investigate their application potential in protein analysis. Analyses with the electrochemical impedance spectroscopic (EIS) and electrochemical quartz crystal microbalance techniques (EQCM) revealed that the electron transfer associated with Fe(CN)63-/4- would be imposed with increasing impedance at the toluidine blue-modified electrodes during the incorporation of proteins like glucose oxidase (GOx), giving rise to increasing charge-transfer resistance and increasing mass for the electrodes. Among the tested proteins, GOx stood out to be the one with the highest affinity for the phenothiazine-modified electrodes. For the adsorption behavior, we also analyzed the electrodes with atomic force microscopic (AFM) and scanning tunneling microscopic (STM) technique. Proteins were spotted on the electrodes, fully supporting the hypotheses made based on EIS and EQCM. According to these results, we conclude tat phenothiazine compounds are effective molecular glues for proteins and that EIS and EQCM are useful techniques for protein analysis.. Keyword : electrochemical impedance spectroscopic ; electrochemical quartz crystal microbalance techniques ; phenothiazines.. ii.
(14) 1.1 類核黃素的應用 核黃素是核黃蛋白的輔脢，因為其在生物體外難維持活性，故多 以結構類似物模擬其生化行為，以下所列為部份 Phenothiazine 化合 物可用以模擬核黃素，可視為類核黃素： H2N. S. NH2. Cl-. N. Thionine Chloride (TC). CH3 H2N. S. H3C. N. N+. CH3. Toluidine Blue O (TB) CH3 H3C. N. CH3 N+. S N. Methylene Blue (MB). 1. CH3.
(15) Phenothiazine 具有氧化還原特性，可加速或抑制生物體內電子傳 遞反應，若將此類分子修飾於電極表面，應具有生化感測器的應用潛 力。根據本實驗室研究，Phenothiazine 可以電化學氧化聚合法與偶氮 還原法修飾於電極表面。目前電化學氧化聚合法已廣泛應用於製備電 化學感測器(1~7)，至於偶氮還原法，理論上可將具有胺基的芳香族化 合物依近似單層排列方式修飾於電極表面。本實驗室過去曾利用偶氮 還原法製作修飾電極，並藉以探討物理化學性質(8)。本篇論文則嘗試 利用這些方法製備化學修飾電極，藉以探討類核黃素其與蛋白質間的 交互作用。. 2.
(16) 1.2 電化學石英晶體微天平 電化學石英晶體微天平（EQCM）是微量分析的有效工具之一， 主要是利用壓電石英晶體感測器(PQCM)(9)，以監測表面重量改變所 引起的頻率變化，目前已廣泛應用於電化學研究中(10)，如電極特性探 討(11)、電活性物質吸附分析(12,13)、介面動力學研究(14)與金屬電析(15)。. 圖 1-1 QCM 應用潛力示意圖。. 3.
(17) QCM 的發展源於 1880 年(16)，Jacques 與 Pierre Curie 發現若對石 英等壓電材料施加應力會使材料本身之晶格重新排列而產生一極化 電場。此時，若於材料兩側鍍上電極，即可測得一電位差，稱為壓電 效應（piezoelectric effect） 。他們也發現若於鍍有電極的壓電材料兩端 施加電場，則可改變晶體形變方向，產生反壓電效應（converse piezoelectric effect） ，因此若對壓電材料施加交流電場時，晶體形變會 產生規律性變化，圖 1-2 所示為壓電效應示意圖。. 圖 1-2 壓電效應與反壓電效應之示意圖。. 4.
(18) (17). 在 1959 年，Sauerbrey. 首先將壓電材料拿來作為偵測質量的工. 具，利用壓電材料偵測蒸鍍金屬，發現隨金屬沈積，振動晶體的頻率 會產生如下偏差：. 2 f 02 m f A( q q )1 / 2. 式 1-1. 其中 f0 為石英晶體之振盪基頻，ρq 為石英晶體之密度，q 為石英晶體 之剪力係數。在 1969 年，Jones(20)利用電化學方式將金屬電鍍在 QCM 電極表面上，再移至空氣中進行質量估算，成為第一個在液相中成功 利用 QCM 進行質量測量的例子。之後，Nomura(21)在液相中電鍍銅， 再以 QCM 分析其質量對電極所造成的頻率變化。值得注意的是， Sauerbrey Equation 的基本假設是沈降於晶體表面之物質必須為硬體 物且只形成單層堆積，故當晶體表面與液體接觸時，二者會因密度、 黏滯度差異顯現偏差。有鑒於此，Brukenstein 與 Shay(18)提出修正， 將液體厚度導入 Sauerbrey Equation 中。在同一年，Kanazawa 與 Gordon(19)也提出類似模型，推導出如式 1-2 所示的修正公式：. 5.
(19) 2 f 02 m 3 / 2 L L 1 / 2 f f ( ) 0 A( q q )1/ 2 q q. 式 1-2. 其中L 為水溶液黏度變化，L 為水溶液密度變化。受益於式 1-2， EQCM 已成為電化學研究中重要工具之一。. 6.
(20) 1.3 電化學阻抗分析儀 電化學阻抗分析儀（EIS）在早期的電化學文獻中稱為交流阻（AC impedance） 。阻抗測量原本是電學中研究線性電路頻譜響應特性的方 法之一，引進至電化學後，便成了研究電化學的一種重要技巧。交流 阻抗分析法的主要特色，是可以在電化學系統中以常用的元件，如電 阻（resistance , R） 、電容（capacitance , C） ，建構等效電路（Equivalent circuit）以模擬系統中反應動力學。 一般而言，電極表面所遭遇的阻礙多來自於電極表面電子轉移所 產生的阻抗，即電荷轉移阻抗(Charge transfer resistance , RCT)、電極 表面電雙層對離子的阻抗，即電雙層電容（Double layer capacitance, Cdl）以及物質在溶液中的擴散，即稱 Warburg 阻抗（Zw），如圖 1-2 所示：. 圖 1-2 Randles 等效電路示意圖。. 7.
(21) 根據圖 1-2，我們可對待測系統施加一個微小擾動交流電壓，藉 由其頻率改變以量測受擾動系統內的阻抗變化，了解待測系統進行電 荷轉移時的動力學。進行交流阻抗分析時，可以定電壓或是定頻率模 式施行。由於 EIS 僅對待測系統施以微弱電位擾動，不會對待測系統 造成干擾或引起不必要的充電電流，即待測系統可視為恆處於平衡狀 態，因此理論上可得到精確的動力學資訊。 進行 EIS 時，若給予該系統一振幅為 V0 的正弦波形擾動：. V V0 sin t. 式 1-3. 則流通於電極的電流 I 可表示為：. I I 0 sin(t ). 式 1-4. 其中為角頻率，t 為時間，而θ代表電位與電流間的相位差。根據 歐姆定律，系統所產生的阻抗（impedance，Z）可表示為：. Z R iX R . i Z re Z im C. 其中 Zre 與 Zim 分別代表實部與虛部阻抗，而 i . 式 1-5. 1 。若以在 90°. 相位所得到 Zim 對在 0°相位所得到的 Zre 作圖，便可得到如圖 1-3 所 示的 Nyquist 圖譜：. 8.
(22) 圖 1-3 代表性 Nyquist 圖譜。 根據 Nyquist 圖譜，在高頻區可得到一近似半圓的圖形，而在低 頻部分會出現一條近似 45 度的直線，可藉以求得 Warburg 擴散阻抗。 至於在高頻區，可得到電解質溶液的阻抗（Rs）以及電荷傳遞阻抗 （RCT）。. 9.
(23) 1.4 掃描式穿隧電流顯微鏡 掃瞄式穿隧電流顯微鏡是 Binnig 和 Rohrer 在 1980 年所發明，藉 由探針與導體間的穿隧電流，可獲得原子級的影像解析度，惟樣品必 須為導體。掃瞄式穿隧電流顯微鏡主要是利用量子力學的穿隧效應， 若對導電探針與樣品間施加偏壓，在兩者距離相當接近時，電子會越 過古典力學中描述的能量障壁而產生電流，若將此電流值固定，則在 掃瞄過程中，探針會隨樣品表面起伏而調整高度，進而描繪出表面影 像，稱為定電流取像法(Constant current mode) 。 若將 STM 結合電化學分析，探針便可成為第四支電極，測得氧 化還原反應進行時電極表面的即時影像。惟因探針的穿隧電流會感應 到充電電流與法拉第電流的影響，因此探針必須適當絕緣，始能獲得 清晰影像。 有鑒於上述技術的優點，本論文嘗試將蛋白質固定於電極表面， 利用 EIS 與 EQCM 觀察吸附蛋白質時所產生的阻抗與質量變化，間 接證實 TB 具有蛋白質吸附潛力，並成功的觀察到蛋白質的吸附行 為，也顯示出電化學技巧對於修飾電極電極吸附蛋白質的應用潛力。. 10.
(24) 第二章 實驗 2.1 化學藥品 藥品名稱. 廠牌. 1. Toluidine blue (TB). TCI. 2. Glucose oxidase (GOx). Sigma. 3. Ferritin (FT). Sigma. 4. Deoxyribonucleic acid from salmon testes (ST). Sigma. 5.Sodium nitrite. Showa. 6. Hydrochloric acid. Fisher. 7. Potassium chloride. Showa. 8. Sulfuric acid. Echo. 9. Ethanol. Showa. 10. Potassium ferrocyanide. ACROS. 11. Potassium hydroxide. Showa. 12. Ethyl acetate. Tedia. 13. 氮氣. 豐明氣體. 14. 環氧樹酯. Huntington. 15. 銀膠. Delta technologies. 11.
(25) 16. 銅膠. 3M 露華濃經典指甲. 17. STM 探針絕緣膠 油 18. 高純水. Milli-Q reagent. 12.
(26) 2.2 實驗設備 儀器名稱. 廠牌規格. 1. 工作電極. ITO 導電玻璃(Delta Tech),HOPG. 2. 參考電極. SCE. 3. 輔助電極. Pt 電極. 4. 電位儀. Part 283、BAS-50 (Bioanalytical system)、 CHI 400 或 CHI 614A (CH instrument). 5. 交流阻抗分析儀. Autolab. 6. 超音波震盪器. Fisher scientific FS5. 7. 電子天平. Precisa 125A. 8.電化學石英震盪天平. (1)電位儀: Model 283 (EG﹠G Instrument) (2)石英振盪分析儀: QCA917 (SEIKO EG﹠ G) (3) 9 MHz Au 石英晶片: 0.2cm2. 9. 微量吸量管. Nichiryo model 5000DG. 10. 原子力顯微. Multimode AFM (NanoScope IIIA，. 鏡. Digital instruments and Veeco Metrology， Inc.，Santa Barbara，CA). 13.
(27) 15. 非接觸式掃描顯微. Budgetsensors TAP300Al. 鏡探針 16. 接觸式掃描顯微鏡. Nanosensors PPP-XYCONTR. 探針 17. 鎢絲 (STM 探針用) GUV team (直徑 0.25 mm) 18. 鉑銥合金線 (STM. Gredmann Taiwan (直徑 0.25 mm). 探針用，Pt:Ir = 90:10 wt%) 19. 銀絲 (ECSTM 參考 STREM CHEMICALS 電極) 20. Power Supply Model. Jaihsan 304C. 21. 透明膠帶. 3M. 22. 斜口鉗. VICTOR. 23. 接觸式導電掃描顯. AIST fpC10 TiN/Pt. 微鏡探針. 14.
(28) 2.3 類核黃素修飾電極：前處理與製備 A. ITO 電極製備： 1. 以鑽石刀將 ITO 導電玻璃切成約 0.5×1.0 cm2 的面積大小。 2. 以銀膠連接 ITO 導電玻璃與單芯線。待銀膠固化後再以環氧 樹脂將銀膠與單芯線裸露處完全密封，並加溫(160 oC)使環氧 樹脂硬化。 3. 依序將電極置於 0.1 M H2SO4、0.1 M NH4OH、95% C2H5OH 與高純水中，以超音波震盪器震盪 5 分鐘。完畢，烘乾備用。. B. 類核黃素氧化聚合於 ITO 電極之製備： 1. 取類核黃素溶於高純水，濃度、電壓範圍、掃描速率及掃描圈 數詳見類核黃素氧化聚合修飾之圖說。 2. 製備完成後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃瞄至 CV 圖譜穩定不 變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。. C. 類核黃素偶氮修飾於 ITO 電極之製備： 1. 取類核黃素溶於 0.1 M 的鹽酸水溶液，濃度、亞硝酸鈉當量 數、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見類核黃素偶氮還原修 飾之圖說。 2. 製備完成後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃瞄至 CV 圖譜穩定不 15.
(29) 變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。. D. 各蛋白質或 DNA 溶液之製備 1. GOx 溶液：將 60 mg GOx 溶於 1mL 去離子水中，製備濃度為 60 mg/mL 的 GOx 水溶液。 2. Ferritin 溶液：將 Ferritin 溶於 10mL 去離子水中稀釋，製備濃 度為 5 mg/mL 的 Ferritin 水溶液。 3. Salmon testes DNA 溶液：將 10 mg Salmon testes DNA 溶於 1 mL 去離子水中，製備濃度為 10mg/mL 的 Salmon testes DNA 水溶液。 2.4 交流阻抗分析儀器操作 1. 開啟交流阻抗儀 autolab， 後再將電腦開啟，點選 autolab interface， 選擇 refresh 將儀器與電腦連線。 3. 開啟 FRA 程式，method → Potentiostaic → Single potential，在 Edit procedure → page 1→ 設定形式電位值。 4. 在 Edit frequencies → 設定頻率掃描範圍(10 kHz~0.1Hz)，振幅為 ±10 mv，即可以開始測量樣品的交流阻抗值。 5. 存檔(File save data as) → 檔名 → Convert to ACSII → Select → 檔名 → convert (將檔案轉換成 P00 檔)。 6. 再開啟 ZSimp Demo 程式→ File → open → 檔名→ 16. → 選擇.
(30) 模擬元件→ R(C(RW)) →. 觀看各元件的數據值以及誤差值. → File → Save convert (將模擬數據檔案轉換成 txt 檔)。 2.5 修飾電極之電化學石英震盪天平分析 1. 首先將 Au-coated QCM 電極置於 0.5 M H2SO4 中以定電壓(-0.6 及 1.8 V)電解 300 秒，重複數次，直到電極顯現出乾淨 Au 表面應有 的 CV 圖譜。 2. 將清洗乾淨之 QCM 電極置於含 6mL TB 溶液中，分別以氧化聚合 與偶氮化修飾於電極，TB 溶液濃度與配製法、電壓範圍、掃描速 率及掃描圈數詳見類核黃素氧化聚合修飾之圖說，並記錄電極頻率 變化。 3. 將所得的 QCM|TB 電極改置入 6 mL 去離子水中，再將電極電壓定 於 0 V，並 300 秒逐量添加蛋白質於溶液中，並記錄電極的頻率變 化值。 4. 相關參數設定. A. Model 283 加入 QCM 功能: 1. Set up/ Edit/ AUX: 選擇 YES。 2. Defaults/ Experiment/ Data factors/ AUX：輸入正確 data factor。 Data factor= Δf output range ( in QCA917 )/ 10。. B. QCA 917 設定: 17.
(31) 1. 按 MEMU(切換頻率顯示螢幕至功能設定螢幕)。 2. 按 ← 或 → (移動至Δf output range 螢幕，以↑或↓選擇所需 的頻率下限)。 3. Δf 歸零: Δf standard frq.螢幕，自設頻率零點。 2.6 掃瞄式穿隧顯微鏡儀器操作步驟 A. STM 探針製備 鎢絲探針製備 1. 利用自製三叉夾與蝕刻筆固定鎢絲，調整鎢絲長度令其一 端可侵入 4 M KOH 中達 0.5 cm 深，並保持與液面垂直， 以做出較為對稱的針尖。 2. 將鎢絲與電源供應器正極連接，並以另一支鎢絲與電源供 應器負極連接，開啟電源，以直流電解分式進行下列氧化 還原反應: 陽極 : W(S) + 8OH-(aq) → WO42-(aq) + 4H20 + 6e陰極 : 6H2O + 6e- → 3H2(g)+6OH-(aq) 總反應 : W(S) + 2OH-(aq) + 2H2O→ WO42-(aq) + 3H2(g) 3. 電解時，先施予 10 V 電壓，並以顯微鏡觀察電解過程， 當鎢絲與液面接觸處變細時，隨即調整電壓至 0.1 V，並 改以觸放方式控制電流輸送，至鎢絲分離為止，保留上段. 18.
(32) 做為 STM 用探針。 4. 以去離子與丙酮反覆清洗探針，以去除殘留的 KOH，以 氮氣吹乾備用。 鉑銥合金探針製備 1. 以鑷子緊夾鉑銥合金絲，再以斜口鉗以 10~15o 角迅速裁 剪之。 2. 於溶液中進行 ECSTM 影像分析時，探針須先絕緣，首先 以鑷子夾住探針，再以小刷將指甲油液滴施於針尖後端約 0.5 cm 處，順勢往外滑出，使指甲油包覆針尖，並注意毛 刷不可觸碰到探針，正反面各一次上述步驟即可，不可使 探針針尖被完全絕緣，乾燥後移入收納盒備用。 B. 儀器操作步驟 1. 儀器開機前，先將電位儀與儀器以排線串接，並且將機台 置於懸吊式避震系統上。 2. 依序打開機台與電腦，機台切換為 STM mode。 3. 開啟 Nanoscope R(III)程式，點選程式所示的”di”字樣，再 從跳出的對話框選擇 Quadrexed EC MultiMode，以進入主 要調控視窗。 4. 將樣本以銅膠固定於鐵片上，並將 ITO 與鐵片之間用銀. 19.
(33) 膠導通，先用三用電表確認之。之後，再置入機台上。 5. 將 STM 探針以鑷子裝入 STM 專用的 Converter head，並 與電位儀連接，可用肉眼確認探針尖端是否垂直朝下。 6. 利用機台上的板鈕調整下針，用肉眼觀察探針與樣本之間 距離約 1 mm。 7. 進行 ECSTM 測量時，將有固定樣本之鐵片上方加上鐵氟 龍反應槽，以螺絲鎖住四角，再將溶液注入，確定溶液沒 有漏出後置於機台上，此時，Converter head 上的參考電 極(銀絲) 與輔助電極(白金絲) 應置於溶液面下，並且與 探針和樣本不能互相接觸。 8. 從控制程式中的 Universal Potentiostat 參數設定中的 Cell Select 從 Dummy 改為 Normal，Cell 改為 On，點選下針 按鈕，待儀器發出聲響後即下針完畢，可以開始掃瞄並顯 示影像於螢幕上。. 20.
(34) 第三章 實驗結果與討論 3.1 類核黃素修飾電極–修飾膜分析 根據文獻報導（9），含有一級胺基的芳香化合物在酸性環境下可與 一定當量的亞硝酸鈉（NaNO2）進行反應，產生偶氮衍生物，若將該 衍生物予以還原，可進行脫氮反應而形成自由基。在電極表面瞬間形 成的高活性的自由基會因而吸附於電極表面。本實驗嘗試利用此一方 式，將類核黃素修飾於 ITO 導電玻璃或 Au-QCM 晶片上，再進行 EIS 與 EQCM 分析。下圖所示即是以偶氮還原修飾法將 TB 修飾於電極 表面的示意圖： CH3. CH3 H2N. S. H3C. N. N+. CH3. +. NaNO2 HCl. N2. S. H 3C. N. +e-. H3C. N. CH3. -N2. CH3 S. N+. CH3. +. ·. CH3. N. H3 C. 圖 3-1 以偶氮還原法修飾 TB 的示意圖。. 21. S N. N+. CH3.
(35) 圖 3-2 所示為在 1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2 鹽酸溶液(0.1 M) 中以循環伏安法將 TB 修飾於 Au-QCM 電極上的代表結果，其中電位 掃瞄範圍為 0 ~ - 0.6 V。隨電位來回掃瞄，我們發現電極的振盪頻率 隨之降低，同時在- 0.45 V 處的電流訊號也會隨之下降。推測其原因， 應是在還原過程中，電極表面逐漸被吸附物吸附，致使電極有效面積 逐漸變小所致。根據頻率變化與 Sauerbrey equation：. 2 f 02 m f A( q q )1 / 2. 式 1-1. 其中 f0 為石英晶體之振盪基頻；ρq 為石英晶體之密度；q 為石英晶體 之剪力係數。我們推算 TB 吸附量再與掃瞄圈數進行比較，發現連續 掃瞄 30 圈時 TB 吸附量即近飽和，此時質量增加量幾近 108 ng，如 圖 3-3 所示。. 22.
(36) Current (A). 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 -600. f (Hz). -650 -700 -750 -800 -850 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6. E (V) vs. SCE. 圖 3-2 以偶氮還原修飾 TB 於 Au-QCM 電極表面之結果，其中掃瞄圈 數 10 圈。掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2 鹽酸溶液(0.1 M)。. 23.
(37) 120. m (ng). 100. 80. 60. 40. 20 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. 45. CV cycle 圖 3-3 以偶氮還原修飾法修飾 TB 於 Au-QCM 電極所得之 TB 吸附量 與掃瞄圈數關係。實驗條件如圖 3-2。. 24.
(38) 我們也藉由原子力顯微鏡(接觸模式 AFM)探討 TB 吸附膜厚度與 在修飾中被還原掃瞄圈數之關係。實驗結果顯示：當電極表面被 AFM 探針刮除三次時，已可將表面覆蓋物刮除乾淨。有鑒於此，爾後實驗 均以刮除三次為準(圖 3-4)。實驗結果顯示：以偶氮還原修飾法所製 得的極限膜約為 3.5 nm。. 25.
(39) (b) 3.68 3.67. Depth (nm). 3.66 3.65 3.64 3.63 3.62 3.61 1. 2. 3. 4. 5. Scratching No.. (c) 4.0. Depth (nm). 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. CV cycle 圖 3-4 以 AFM 探針刮除 ITO 電極表面 TB 吸附膜時所測得的 AFM 影像(a)與其厚度與刮除次數之關係(b)。(c)為所得膜厚與還原圈數之 關係。實驗條件：掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 與 1.2 mM 的 NaNO2 鹽酸溶液(0.1 M)。接觸力︰0.4 N；面積：1 × 0.5 m2，AFM 探針掃描速率：1 Hz。. 26.
(40) 我也嘗試著利用氧化聚合法來製作修飾電極，本實驗室過去曾利 用此種方式製作電極，其機制如圖 3-5 所示。我們也配合 CV 與 EQCM 進行探討 TB 在氧化聚合過程中的質量變化，如圖 3-6 所示。從循環 伏安圖譜中可以看到在 - 0.3V 處顯線一對特徵峰，其電流值會隨著 氧化過程而逐漸增大，由於聚合物的導電度較低，致使電極表面流通 的電流量會隨 TB 的聚合度增加而下降。但因為 TB 的氧化還原中心 並沒有被破壞，故在-0.3V 處的特徵峰會隨 TB 聚合度增大而增加， 從 EQCM 可以觀察到氧化聚合的過程，表面頻率隨之下降，代表聚 合物逐漸沉積在電極錶面上。 同樣的我也用 AFM 接觸模式，進行膜厚分析，結果如圖 3-7 所 示。我們發現連續刮除次數達三次時，就可將表面修飾物刮除乾淨， 測得氧化聚合膜的極限膜厚為 6.8 nm。. 27.
(41) CH3 H2N. H3C. N+. S. CH3. N. - eCH3 H2N. H3C. N+. S. CH3 H2N. N. N. H3C. CH3. N H3C. N+ CH3. N+. S. CH3. S. NH2 HN. H3C. 圖 3-5 TB 氧化聚合於電極表面示意圖. 28. CH3 S. N. N+. CH3. CH3.
(42) Current (A). 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 1400. F (Hz). 1200 1000 800 600 400 200 1.2. 0.9. 0.6. 0.3. 0.0. -0.3 -0.6. E (V) vs. SCE 圖 3-6 以氧化聚合修飾 TB 於 Au-QCM 電極表面之結果，其中掃瞄圈 數 10 圈。掃瞄速率為：0.02 V s-1。溶液為：1 mM 的 TB 於 0.1M KCl 溶液。. 29.
(43) (b). 6.8 6.6. Depth(nm). 6.4 6.2 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 1. 2. 3. 4. 5. Scratching No.. (c). 7.5 7.0. Depth(nm). 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. CV cycle 圖 3-7 以 AFM 探針刮除 ITO 電極表面 TB 吸附膜時所測得的 AFM 影 像(a)與其厚度與刮除次數之關係(b)。(c)為所得膜厚與還原圈數之關 係。溶液為：1 mM 的 TB 於 0.1M KCl 溶液 。；接觸力︰0.4 N；面 積：1 × 0.5 m2，AFM 探針掃描速率：1 Hz。. 30.
(44) 3.2 修飾電極之交流阻抗分析 在本實驗中，我們也利用電化學交流阻抗分析法(Electrochemical impedance spectroscopy，簡稱 EIS)探討蛋白質吸附於類核黃素修飾電 極時所引起的電極阻抗變化。進行實驗時，我們利用 1 mM Fe(CN)63-/4做為分子探針，以觀察類核黃素修飾電極表面的電子傳遞速率變化， 根據文獻報導(22)，在做 EIS 時，分子探針的濃度與測量時間皆會影響 實驗結果，我們也針對這些誤差因素加以測試，如附錄圖 6-1 與 6-2， 發現在 1 mM 的 Fe(CN)63-/4-下進行實驗 100 分鐘內，所產生的自然誤 差並不會對實驗造成明顯的影響。根據 Fe(CN)63-/4-的循環伏安圖譜 (圖 3-8)，Fe(CN)63-/4-的形式電位為 0.175 V vs. SCE，因此我們進行 EIS 時將電壓固定於 0.175 V vs. SCE，再施加一振幅為±10 mV、頻率為 10 kHz~0.1 Hz 的交流擾動，以分析電極的電子傳遞與物質輸送速 率。實驗結果如圖 3-9 所示。我們發現：在 EIS 圖譜的高頻區出現一 半圓，其半徑會隨著 TB 的修飾與蛋白質添加而變大，暗示 Fe(CN)63-/4在電極表面的電子轉移阻抗(RCT)會隨電極表面修飾物而越加困難。. 31.
(45) Current (A). 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 0.6. 0.4. 0.2. 0.0. -0.2. E (V) vs. SCE 圖 3-8 1 mM Fe(CN)63-/4-的循環伏安圖譜。. 32. -0.4.
(46) 700. -Z" (). 600 500 400 300 200 100. (A). 0 0. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200. Z' (). 500. -Z" (). 400 300 200 100. (B). 0 0. 300. 600. 900. Z' (). 1200. 1500. 1800. 250. -Z" (). 200. 150. 100. 50. (C) 0 200. 400. Z' (). 600. 800. 圖 3-9 以偶氮還原法修飾的 ITO|TB 修飾電極添加(A) GOx（60 mg/mL） 、(B) Ferritin（5 mg/mL）與(C) Salmon testes DNA（10 mg/mL） 時所得的 EIS 圖譜，其中逐量添加體積為 40 L，實點為模擬前，實 線為模擬後。. 33.
(47) 對於上述變化，我們先以圖 1-2 所示的 Randles 等效電路進行模 擬，發現利用簡易等效電路模擬所得數據與實驗值存在明顯誤差，顯 見 ITO|TB 修飾電極的微觀結構並不單純。假設電極表面的 TB 修飾 層是以多層吸附附著於 ITO 上，我們改圖 3-10 所示的多層串聯等效 電路進行模擬，代表性結果如圖 3-11 所示。我們發現隨 RC 電路的串 聯數增加，所得數據的吻合度也隨之提高。當串聯數達三層(n=2)時， 模擬數據幾乎與實驗值完全一致。有鑒於此，我們於是利用三層等效 電路模擬，並將所得各元件數值列於表 3-1 中，誤差則列於表 3-2 中。 我們發現逐量添加蛋白質時，溶液電阻（Rs）僅顯現些微變化，暗示 蛋白質不導電，不會引起溶液導電度變化。根據電極的電雙層電容 （Cdl），我們也發現蛋白質吸附不致阻礙離子進出 TB 膜。又根據物 質輸阻抗(Zw)，Fe(CN)63-與 Fe(CN)64-的物質輸送速率也沒有受到蛋白 質影響，而最主要影響則在 Fe(CN)63-/4-的電荷傳遞組抗（RCT） 。進一 步比較各種蛋白質所對 RCT 所造成的影響，我們發現以 GOx 影響最 大（圖 3-12），與本實驗室同學以漫射式螢光光譜法所得結論極為吻 合。. 34.
(48) 圖 3-10 串聯層模擬電路示意圖. A B C D E. 900 800. -Z" (). 700 600 500 400 300 200 100 0 0. 500. 1000. 1500. 2000. 2500. Z' () 圗 3-11 不同層數的串聯電路模擬圖(▲) 為原始實驗數據，模擬層數 分別為 (A) n = 0 (B) n = 1 (C) n = 2 (D) n = 3 (E) n = 4，模擬用的電極 為偶氮化 TB 修飾電極且表面含有吸附達飽和的葡萄糖氧化脢。. 35.
(49) 表 3-1 以三層串聯電路進行電腦模擬所得各元件數值，其中 ITO|TC|GOx、ITO|TC|FT 與 ITO|TC|ST 為 ITO|TC 電極上蛋白質吸附 達到飽和時的代表數值。 ____________________________________________________ ITO ITO|TB ITO|TB|GOx ITO|TB|FT. ITO|TB|ST. ____________________________________________________ Rs/ 222.8 213.6 182.5 215.3 264 Cdl1/F 5.8E-7 1.1E-6 2.9E-6 1.1E-6 4.9E-7 RCT1/ 103.6 87.93 560.9 123.7 135 Cdl2/F 1.8E-6 3.7E-6 7.1E-7 3.7E-6 0.001 RCT2/ 36.62 213.1 132.2 612.7 80.92 Cdl3/F 1.3E-5 5.9E-5 7.6E-6 2.6E-5 2.2E-6 RCT3/ w 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 ____________________________________________________. 表 3-2 模擬數據誤差（%）。 ____________________________________________________ ITO ITO|TB ITO|TB|GOx ITO|TB|FT. ITO|TB|ST. ____________________________________________________ Rs/ 0.795 0.7193 1.048 0.877 1.09 Cdl1/F 4.419 4.808 3.386 4.619 5.574 RCT1/ 2.703 5.253 7.843 3.511 4.803 Cdl2/F 12.99 5.4 4.172 2.333 12.56 RCT2/ 8.535 2.576 3.274 3.708 9.605 Cdl3/F 14.09 11.26 9.896 10.83 6.426 RCT3/ w 0.9476 3.869 4.975 2.151 1.621 ____________________________________________________ 36.
(50) 1000. RCT(). 800. Selmon Teste Ferritin Glucose Oxidase. 600. 400. 200. 0 -100. 0. 100. 200. 300. 400. 500. 600. 添加體積(L) 圖 3-12 蛋白質對 ITO|TB 偶氮環原修飾電極的 RCT 影響之比較圖，其 中(○) Salmon Testes；(△)Ferritin；(□) Glucose Oxidase。偵測電位： 0.175 V vs. SCE。頻率範圍：10k ~0.1 Hz。. 37.
(51) 我們同樣以相同手法對氧化聚合修飾電極做阻抗分析，實驗結果 如圖 3-13 與圖 3-14 所示，所得模擬元件分析數值結果如表 3-3，模 擬誤差如表 3-4，我們發現元件數值變化情形與偶氮還原法修飾電極 即為相似。 我們也嘗試著利用 GOx 對三種不同類核黃素修飾電極進行分析 比較，發現 GO 在 TC 電極表面的吸附效果最好，如附錄圖 6-3。惟 因 TC 修飾電極再現性不佳，所以本論文討論主要以 TB 修飾電極為 主。. 38.
(52) 300. -Z" (). 200. 100. (A). 0. 200. 400. 600. Z' (). 800. 1000. 350 300. -Z" (). 250 200 150 100 50. (B). 0 -50 200. 400. 600. 800. Z' (). 1000. 250. -Z" (). 200. 150. 100. 50. 0 200. (C) 400. 600. 800. 1000. Z' (). 圖 3-13 以氧化聚合法修飾的 ITO|TB 修飾電極添加(A) GOx（60 mg/mL） 、(B) Ferritin（5 mg/mL）與(C) Salmon testes DNA（10 mg/mL） 時所得的 EIS 圖譜，其中逐量添加體積為 40 L，實點為模擬前，實 線為模擬後。 39.
(53) 表 3-3 以三層串聯電路進行電腦模擬所得各元件數值，其中 ITO|TC|GOx、ITO|TC|FT 與 ITO|TC|ST 為 ITO|TC 電極上蛋白質吸附 達到飽和時的代表數值。 ____________________________________________________ ITO ITO|TB ITO|TB|GOx ITO|TB|FT. ITO|TB|ST. ____________________________________________________ Rs/ 222.8 215.7 199.9 215 264 Cdl1/F 5.8E-7 8.2E-6 5.9E-7 3.6E-6 5.046E-7 RCT1/ 103.6 94.04 123.3 298 127.1 Cdl2/F 1.8E-6 1.3E-6 2.5E-6 1.1E-6 2.573E-6 RCT2/ 36.62 96.45 283.1 106.1 276.3 Cdl3/F 1.3E-5 0.0001 2.1E-5 3.3E-5 3.415E-5 RCT3/ w 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 ____________________________________________________. 表 3-4 模擬數據誤差(%) ____________________________________________________ ITO ITO|TB ITO|TB|GOx ITO|TB|FT. ITO|TB|ST. ____________________________________________________ Rs/ 0.795 0.9188 0.9977 0.7127 0.8669 Cdl1/F 4.419 14.83 4.323 3.926 5.449 RCT1/ 2.703 6.16 4.213 3.755 3.893 Cdl2/F 12.99 5.707 4.703 4.151 4.774 RCT2/ 8.535 6.032 4.1884 4.354 2.719 Cdl3/F 14.09 8.968 14.56 14.84 10.59 RCT3/ w 0.9476 1.287 1.073 1.112 0.9974 ____________________________________________________ 40.
(54) Salmon testes Ferritin GOx. RCT(). 180 160 140 120 100 80 60 40 -50. 0. 50. 100. 150. 200. 250. 300. 350. 400. 添加體積(L) 圖 3-14 蛋白質對 ITO|TB 氧化聚合修飾電極的 RCT 影響之比較圖，其 中(○) Salmon Testes；(△)Ferritin；(□) Glucose Oxidase。偵測電位： 0.175 V vs. SCE。頻率範圍：10k ~0.1 Hz。. 41.
(55) 3.3 蛋白質吸附含量分析 為了進一步確認 Phenothiazine 修飾電極可否吸附蛋白質，我們 也利用電化學石英晶體微天平技術（Electrochemical quartz crystal microbalance，簡稱 EQCM）對修飾電極表面重量變化進行分析，實 驗所使用的石英晶片為鍍金晶片，振盪基頻為 9 MHz，中央金電極部 份面積為 0.198 cm2。若將各項參數帶入 Sauerbrey 方程式 (式 1-1 ) 中，可得頻率變化 1 Hz 相當於質量變化 1.08 ng。. 2 f 02 m f A( q q )1 / 2. 式 1-1. f0 為石英晶體之振盪基頻 = 9 MHz ρq 為石英晶體之密度 = 2.648 g/cm3 q 為石英晶體之剪力係數 = 2.947 × 1011 g/cm*s2 A 為石英晶體之金電極面積 = 0.198 cm2 m (ng) -1.08 × f (Hz). 式 3-2. 進行 EQCM 分析時，我們先以偶氮還原法在石英片上修飾一層 3.5 nm 厚的 TB 修飾膜，置於去離子水環境後，再移至一法拉第箱 內，以避免溫度與電磁波的干擾。實驗時，每 300 秒逐量添加蛋白質 一次（體積 40 L），所得結果如圖 3-15~3-17 所示。. 42.
(56) 100 200. 50. 0 100. -50. m (ng). f (Hz). 150. 50. -100 0. -150 -300. 0. 300. 600. 900. 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000. Time(sec) 200. m (ng). 150. 100. 50. 0 0.0. 0.5. 1.0. 1.5. 2.0. 2.5. 3.0. 3.5. [GOx](mg/mL) 圖 3-15 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 GOx（濃度 60 mg/mL，體 積 40L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。GOx 吸附量與其濃 度之關係。 43.
(57) 100. 200. 150. f (Hz). 100 0. 50. m (ng). 50. -50 0 -100. 0. 300. 600. 900. 1200. 1500. 1800. 2100. 2400. -50 2700. Time(sec). 160 140. m (ng). 120 100 80 60 40 20 0 0.00. 0.06. 0.12. 0.18. 0.24. 0.30. 0.36. [Ferritin] (mg/mL) 圖 3-16 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 Ferritin（濃度 5 mg/mL，體 積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上）。Ferritin 吸附量與 其濃度之關係。 44.
(58) 50. 630. 40. 30. 620. 20 610. m (ng). f (Hz). 640. 10 600 0 590. -300. 0. 300. 600. 900. 1200. 1500. 1800. 2100. -10 2400. Time(sec) 50. m (ng). 40. 30. 20. 10. 0 -0.1. 0.0. 0.1. 0.2. 0.3. 0.4. 0.5. 0.6. 0.7. [Salmon Testes](mg/mL) 圖 3-17 TB 偶氮還原修飾電極逐量添加 Salmon Testes DNA（濃度 10 mg/mL，體積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。DNA 吸附量與其濃度之關係。 45.
(59) 我們將上述三種蛋白質的吸附進行比較，結果（圖 3-18）顯示， 蛋白質確實會吸附於 TB 偶氮環原修飾電極上，其中 GOx 的吸附量 最高，約為 189 ng。此一結果不僅證實 TB 具有蛋白質的潛力，也證 實 EIS 實驗中電極表面所觀察到的電子傳遞阻抗變化應是由蛋白質 吸附所造成。. Selmon Test Ferritin GOx. 200. m (ng). 150. 100. 50. 0 0. 40. 80. 120. 160. 200. 240. 280. 320. 添加體積(L) 圖 3-18 三種蛋白質在 TB 偶氮還原修飾電極上的吸附比較。. 46.
(60) 我們也嘗試在石英電極上利用氧化聚合法修飾一層膜厚約為 6.8 nm 的 TB 修飾膜，再比較各種蛋白質的吸附情形，結果如圖 3-19 ~ 22 所示，我們發現其結果與偶氮還原法相似，其中 GOx 的吸附量最高。 若與偶氮化法所製備的電極相比較，以氧化聚合法所修飾的電極其蛋 白質吸附容量較小，與以 EIS 所得的結果相似。對此，我們推測其原 因可能是利用偶氮還原法修飾 TB 時，修飾物多以直立式排列，因此 其正電荷部位可有效地與蛋白質接觸，反關氧化聚合膜則是以平躺方 式吸附於電極表面，因此較難有效與蛋白質接觸，所以吸附量較低； 兩種修飾膜於電極表面的示意圖如 3-23 所示。. 47.
(61) 120. -230 -240 -250. 90. f (Hz). -270 60. -280 -290 -300. 30. m (ng). -260. -310 -320 0. -330 -340 -350 -300. 0. 300. 600. 900. 1200. 1500. 1800. 2100. 2400. 2700. Time(sec). m (ng). 100 80 60 40 20 0 0.0. 0.5. 1.0. 1.5. 2.0. 2.5. 3.0. 3.5. [GOx](mg/mL) 圖 3-19 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 GOx（濃度 60 mg/mL，體 積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上）。GOx 吸附量與其 濃度之關係。. 48.
(62) 120. -180. -210. 80. 60 -240 40. m (ng). f (Hz). 100. 20 -270 0. -20. -300 -300. 0. 300. 600. 900. 1200. 1500. 1800. 2100. 2400. 2700. Time(sec). m (ng). 100 80 60 40 20 0 -0.05. 0.00. 0.05. 0.10. 0.15. 0.20. 0.25. 0.30. 0.35. [Ferritin] (mg/mL) 圖 3-20 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 Ferritin（濃度 5 mg/mL，體 積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上）。Ferritin 吸附量與 其濃度之關係。 49.
(63) -100. 80. -140. -160. 40. -180. -200. m (ng). f (Hz). -120. 0. -220 -300. 0. 300. 600. 900. 1200. 1500. 1800. 2100. 2400. 2700. Time(sec). m (ng). 80. 60. 40. 20. 0 0.0. 0.1. 0.2. 0.3. 0.4. 0.5. 0.6. 0.7. [Salmon Testes](mg/mL) 圖 3-21 TB 氧化聚合修飾電極逐量添加 Salmon Testes DNA（濃度 10 mg/mL，體積 40 L）時所測得的頻率與質量變化關係（上） 。DNA 吸附量與其濃度之關係 50.
(64) Selmon Test Ferritin GOx. m (ng). 100 80 60 40 20 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 300. 添加體積(L) 圖 3-22 三種蛋白質在 TB 氧化聚合修飾電極上的吸附比較。. 51.
(65) (A) Diazotation H3C N H3C H3C. N. H2N. S. S N. N+ CH3 CH3 N+ CH3. S CH3 N CH3. CH3. (B) Polymerization ClH3C + N CH3. 圖 3-23 兩種修飾膜於電極表面的示意圖。. 52. N. CH3. S H3C. N + N. N S CH3. CH3 N n.
(66) 3.4 偶氮還原修飾電極之表面影像分析 對於蛋白質吸附於 Phenothiazine 修飾電極表面的行為，我們也 利用原子力顯微鏡(AFM，Tapping mode)與掃瞄式穿隧顯微鏡(STM) 顯影技術進行影像分析，其中我們也以導電模式原子力顯微鏡 (C-AFM)進行分析比較。理論上，AFM 是以原子間交互作用力得到 待測物表面形貌，而 STM 則是藉由探針與待測物間穿隧電流成像， 至於 C-AFM，則是利用導電度差異進行顯像。利用 Tapping mode AFM 對 ITO、ITO|TB、ITO|TB|FT、ITO|TB|GOx 與 ITO|TB|ST 進行表面分 析所得影像如圖 3-24 與 3-25 所示。若進一步將圖中表面粗糙度進行 分析，其結果如圖 3-26 所示。我們發現以偶氮化製得的電極經蛋白 質修飾後，其表面粗糙度比未修飾前大，顯示 TB 可將蛋白質吸附於 其表面。我們也發現：雖然以氧化聚合而得的電極，經蛋白質修飾後 的表面粗糙度變小，顯示蛋白質可能吸附於 TB 膜凹槽之內，但因其 表面粒子寬度明顯變大，與前者結論頗為一致。. 53.
(67) 圖 3-24 . (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面影像，其中 TB 是由偶氮化修飾而得。Scan size 500 nm × 500 nm，Data scale：20 nm，掃描速率 1 Hz。. 54.
(68) 圖 3-25 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面影像，其中 TB 是由氧化聚合法製備而得。 Scan size 500 nm × 500 nm，Data scale：20 nm，掃描速率 1 Hz。. 55.
(69) Roughness (nm). A B. 11 10 9 8 7 6 5 4 a. b. c. d. e. 圖 3-26 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 之 AFM 表面粗糙度分析，其中曲線(A)為偶氮化修飾的電 極，而(B)為以氧化聚合而得。. 56.
(70) 由於 STM 的探針針尖比 AFM 細緻，理論上應可獲得較精確的待 測物表面，我也在液相中對前述電極進行 STM 影像分析，其結果如 圖 3-27 與 3-28 所示。也對表面影像做粗糙度分析，如圖 3-29，發現 ITO|TB 電極表面粗糙度變化情形與 AFM 結果相符，但由於粗糙度無 法分辨蛋白質粒徑所以我改用寬度做分析。我們也藉由 C-AFM 進行 分析，最後並將三種顯影技術對於蛋白質粒徑進行分析，所得結果如 表 3-2 所示。我們發現：由 STM 所測得的粒徑大小與文獻(23~25)最為 接近，代表探針針尖大小與成像方式是觀察奈米級影像的重要因素。. 57.
(71) 圖 3-27 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 在液相中所得的 STM 影像，其中 TB 是以偶氮環化修飾琺 製備而得。Scan size: 200 nm × 200 nm，穿隧偏壓：100mV，Data scale： 10 nm，掃描速率：15 Hz，溶液：二次去離子水。. 58.
(72) 圖 3-28 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 極在液相中所得的 STM 影像，其中 TB 是以氧化聚合法修 飾，Scan size：200 nm × 200 nm，穿隧偏壓：100mV，Data scale：5 nm， 掃描速率：15 Hz，溶液：二次去離子水。. 59.
(73) A B. Roughness (nm). 9 8 7 6 5 4 a. b. c. d. e. 圖 3-29 (a) ITO、(b) ITO|TB、(c) ITO|TB|FT、(d) ITO|TB|GOx 與(e) ITO|TB|ST 在液相中所得的 STM 影像面粗糙度分析。其中曲線(A)為 偶氮化修飾的電極，而(B)為以氧化聚合而得。. 60.
(74) 進行 C-AFM 分析前，我們先對 ITO；ITO|TB 以及蛋白質修飾後 電極進行 I-V curve 分析，發現若將偏壓設於 0.5 V 時，三者差異最 大，結果如圖 3-30 所示。有鑑於此，我們便將 C-AFM 偏壓固定於. Current (pA). 0.5 V，以分析蛋白質吸附情形，結果如圖 3-31 與 3-32 所示。. 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35. (C) (B) (A). 1.5. 1.0. 0.5. 0.0 -0.5 -1.0 -1.5. E (V) vs. SCE 圖 3-30 以 AFM 導電探針對(A) ITO|TB|FT、(B) ITO|TB 與(C) ITO 所 測得的 I-V 曲線，掃瞄速度：1.97 Hz。. 61.
(75) 圖 3-31 以偶氮修飾法所得的 ITO|TB 電極(a)吸附 FT (b)、GOx (c)、 與 ST (d)所測得之 C-AFM 影像，掃瞄速度：1 Hz，掃瞄範圍：1 m × 1 m，Data scale：5 nA。. 62.
(76) 圖 3-32 以氧化聚合法所得的 ITO|TB 電極(a)吸附 FT (b)、GOx (c)、 與 ST (d)所測得之 C-AFM 影像，掃瞄速度：1 Hz，掃瞄範圍：1 m × 1 m，Data scale：5 nA。. 63.
(77) 為降低基材粗糙度對 STM 影像分析之影響，我們也把鐵蛋白滴 在 HOPG 上，在水相進行 STM 分析，並成功觀察到鐵蛋白影像， 其高度為 12 nm，寬度約為 14 nm，如圖 3-34 所示，與理論值頗為 吻合。. 表 3-5 各種顯影技術對蛋白質粒徑進行分析所得結果比較 _______________________________________________ AFM/nm STM/nm C-AFM/nm _______________________________________________ GOx 25.39 12.01 21.31 FT 20.05 12.89 24.58 ST 33.39 34.79 29.92 _______________________________________________. 64.
(78) 圖 3-34 以自製鉑銥合金探針在二次去離子水溶液中觀察單一鐵蛋白 吸附顆粒影像，Scan size: 80 nm × 80 nm，穿隧偏壓 : 100 mV，Data scale :10 nm，掃描速率：15 Hz. 65.
(79) 第四章 結論 1. 本論文藉由 EQCM 與 EIS，對氧化聚合、偶氮還原兩種修飾方式 進行蛋白質吸附分析比較，其中以偶氮還原法所得的電極對蛋白 質偵測能力較為敏銳。葡萄醣氧化脢的吸附量最大，顯示修飾物 與蛋白質的正、負電荷吸引是影響吸附的因素之一。 2. 本論文亦利用上述手法觀察到修飾電極表面質量變化與阻抗變 化的趨勢，發現導蛋白質會影響電極表面電荷傳遞阻抗，但不影 響其他模擬元件數值。 3. 本論文也藉由 AFM 與 STM 觀察 TB 修飾電極固定蛋白質前後的 粗糙度差異，發現偶氮還原法修飾電極吸附蛋白質前後粗糙度會 變大，而氧化聚合法修飾電極則變小，可能是蛋白質陷於聚合膜 凹陷處所致。. 66.
(80) 第五章 參考資料 (1).. Cox, J. A.; Kulesza, P. J. Anal. Chem. 1984, 56, 1021.. (2).. Kulesza, P. J.; Brajter, K.; Dabek-Zlotorzynska, E. Anal. Chem. 1987, 59, 2776.. (3).. Cox, J. A.; Gray, T.; Kulkarni,; K. R., Anal. Chem. 1988, 60, 1710. (4).. Thomsen , K. N.; Baldwin , R. P., Anal. Chem.. 1989, 61, 2594.. (5).. Hou, W.; Wang , E., Anal. Chem. Acta 1992, 257, 275.. (6).. Dequaire, M.; Degrand,C.; Limoges , B. , J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6946.. (7).. Corgier, B. P. ; Marquette, C. A.; Blum , L. J., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 18328.. (8).. 黃祥盈, ”類核黃素修飾電極製備及其與蛋白質間的交互作用探 討”, 碩士論文, 國立台灣師範大學, 2009.. (9).. Lu, C.; Czanderna , A. W., Application of Piezoelectric Quartz Crystal Microbalance, Elsevier. 1984.. (10).. Bard , J., Marcel Dekker Inc. 1991, 17, 2.. (11).. Wilde, P.; Cliff, S. V. D.; Hui ,K. C.; Brett, D. J. L., Electrochim. Acta 2000, 45, 3649.. (12).. Jusys, Z.; Bruckenstein, S.; Electrochem. Commun. 2000, 2, 412.. (13).. Niu, L.; You, T.; Gui, J.; Dong, S.; Wang, E., Electroanalysis. 1999, 11, 1112.. (14).. Pinto, E. M., Barsan, M. M.; Brett ,C. M. A., J. Phys. Chem. B. 2010, 114, 15354.. (15).. Naohara, H.; Ye, S.; Uosaki , K., Colloid Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 1999, 154, 201. 67.
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(82) 第六章 附錄 600 A B C D E F. 500. -Z" (). 400 300 200 100 0 100. 200. 300. 400. 500. 600. 700. 800. 900. Z' () 圖 6-1 測量實驗時間對於 EIS 實驗的影響，測量時間分別為(A) 0 分 鐘 (B) 20 分鐘 (C) 40 分鐘 (D) 60 分鐘 (E) 80 分鐘 (F) 100 分鐘。. 69.
(83) 200. 0 20 40. 180. 200 0 20 40. 150. 140 120. -Z" (). -Z" (). 160. 100 80 60. 100. 50. 40 0. 20. (B). (A). 0 200. 200. 300. 400. Z' (). 500. -50 100. 600. 300. 400. 500. Z' (). 0 20 40. 180. 200. 140. 160. 0 20 40. 120 100. 120. -Z" (). -Z" (). 140. 100 80 60 40 20. (C). 0 200. 300. 400. 500. 80 60 40. (D). 20 0 150. 600. Z' (). 200. 250. 300. 350. 400. 450. 500. 550. Z' (). 圖 6-2 不同濃度的 Fe(CN)63-/4-進行穩定度測試，在濃度為 (A) 1 mM (B) 2 mM (C) 3 mM (D) 4 mM 的 Fe(CN)63-/4-每 20 分鐘測量 一次阻抗。. 70.
(84) TB TC MB. 7000 6000. RCT (). 5000 4000 3000 2000 1000 0 0.0. 0.5. 1.0. 1.5. 2.0. 2.5. 3.0. GOx(mg/mL) 圖 6-3 不同類核黃素修飾電極對於 60 mg/mL GOx 阻抗分析。. 71.
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