高氏柴胡（B. kaoi Liu Chao & Chuang）為台灣特有原生種，多年生 草本植物，有竹葉柴胡、柴胡、皇帝草等別名，其株高可達 40 至 135 公 分，早期由高木村教授等學者發現而命名為高氏柴胡。其野生族群分布 於台灣北部與中部之低海拔丘陵地區，近年來因大量被摘採而有瀕臨滅 絕的危機（鄭, 2000；劉, 2004）。
國內常用之柴胡種類包括北柴胡、三島柴胡及高氏柴胡，其中又以 台灣原生種之高氏柴胡保肝效果最佳（林和顏, 1999）。研究顯示高氏柴 胡保肝作用優於北柴胡外，其種子發芽率也高於三島柴胡，其柴胡皂苷 SSa、SSc、SSd 的含量高於三島柴胡 2~3 倍，相對於北柴胡更是高出 10 倍（林和顏, 1999）。行政院農委會農業試驗所在 2006 年柴胡之 GMP 栽 培模式與品質評價報告中，結果顯示高氏柴胡之公頃產量高於三島柴胡 及北柴胡，此外，SSa 及 SSd 之含量也以高氏柴胡為最高（劉, 2006）。
1.4 柴胡組織培養之 柴胡組織培養之 柴胡組織培養之前人 柴胡組織培養之 前人 前人研究 前人 研究 研究 研究
藥用植物廣泛被人們運用在日常生活與醫療使用，已有長遠歷史，
從秦漢時期之神農本草經中即有記載三百多種，直至南朝更增加編列至 七百三十餘種（謝, 2004）。隨著世代演進及社會進步，藥用植物的利用 更加寬廣，對此需求進而大大提高，慢慢的野生植株便開始供不應求。
因此有學者便開始針對有高經濟價值或市場需求潛力高之藥用植物進行 人工栽培，植物組織培養即是常用方法之一（蔡等, 2003）。
植物組織培養是將植物的種子、器官（根、莖、葉等）、胚胎、單一 細胞或是原生質體等部分取出，以無菌的方式在試管中給予適當養份的 培養基進行培養（孔, 2009）。利用植物組織培養進行繁殖，不僅能縮短 植株的栽培時間，並能在短時間內進行大量生產之目的，對於種原的保 育也是一大功臣（孔, 2009；蔡, 1999；蔡等, 2003）。利用組織培養技術 大量繁殖藥用植物已有許多成功的例子，如：人參（Chang and Hsing, 1979/1980）、大黃（Kaneko et al., 1986）、山藥（Forsyth and Stadn, 1982）、
毛地黃（Erdei et al., 1981）、白及（Chung et al., 1983；Ichihashi and Yamashita, 1977；Jonsson and Nylund, 1979；Luks and Shevehenk, 1977）、
半夏（Hatano et al., 1986；Shoyama et al., 1983；Tsay et al., 1989）、地黃
（Matsumoto et al., 1986；Nishioka, 1988；Xu and Davey, 1983）、百合
（Shoyama et al., 1987）、貝母（Shoyama et al., 1986）、金線連（Liu et al., 1987）、柴胡（Hiraoka et al., 1983）、防風（Hiraoka et al., 1987）、黃 耆（Fujioka et al., 1983）、紫草（Tsukaba, 1983）與當歸（Tsay and Huang, 1998）等。
1983年Hiraoka與Kodama開始著手於三島柴胡試管內培養繁殖，並於 1986年從根葉中成功誘導出癒傷組織，培養成為小植株（Hiraoka and
Kodama, 1984；Hiraoka et al., 1986）。1992年Xia等學者則是成功從狹葉 柴胡的莖節中誘導出具胚性癒傷組織，隨後也成功將這些具胚性癒傷組 織培養成為小植株（Xia et al., 1992）。1993年，許等學者利用台農一號 之三島柴胡頂芽及腋芽作為培植體進行組織培養，成功大量繁殖三島柴 胡組培苗（許等, 1993）。至1999年後，研究學者開始利用三島柴胡之種 子進行試驗，以莖節誘導癒傷組織進行懸浮培養得到原生質體藉由胚的 形成得到植株（Bang et al., 1999），或進行不定根繁殖（Kusakari et al., 2000）。直至2004年，夏及陳等學者開始研究台灣原生種高氏柴胡，其 利用腋芽或莖節作為培植體，完成芽體增生試驗，初步建立了高氏柴胡 之大量繁殖技術（陳等, 2004；陳, 2006）（表1.1）。
1.5 研究目的 研究目的 研究目的 研究目的
本研究之目的為建立高氏柴胡癒傷組織誘導系統，並以不同濃度之 植物生長調節劑將所誘導之癒傷組織進行試管內形態發生，本試驗所得 之結果，可進一步運用於種苗繁殖、基因轉殖、細胞懸浮培養及多倍體 誘導等研究。
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表表
表表 1.1 柴胡研究概況表
Species Explants In vitro
Morphogenesis B. falcatum Leaf Callus and plantlets Hiraoka et al.,
1986
B. falcatum Shoot tip Shoots Kohda et al.,
1990 B. scorzonerifolium Stem node Embryogenic calli,
protoplasts,
B. falcatum L. Anther Calli, embryoids and plantlets
Shon and Yoshida, 1997 B. falcatum L. Seeds Embryogenic callus,
protoplasts, somatic embryos and plants
Bang et al., 1999
B. falcatum L. Seeds Roots and
adventitious roots
Kusakari et al., 2000
B. fruticosum Nodal explants
Shoots and roots Fraternale et al., 2002
B. kaoi Axillary buds Shoots Chen et al., 2004
B. kaoi Nodal
segments
Shoots Chen et al., 2006 B. kaoi Axillary buds Shoots and callus Chen, 2006
第二章 第二章 第二章
第二章 材料與方法 材料與方法 材料與方法 材料與方法
2.1 實驗材料 實驗材料 實驗材料 實驗材料
高氏柴胡種子（芸寶生技股份有限公司提供）。
2.2 基礎培養基 基礎培養基 基礎培養基 基礎培養基
基礎培養基成分為全量 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類含維 他命，添加 30 g/L 蔗糖（sucrose）與 1 g/L 蛋白腖（peptone）及 3 g/L 水 晶洋菜（gelrite）。培養基 pH 為 5.8 ± 0.01。
2.3 植物生長調節劑 植物生長調節劑 植物生長調節劑 植物生長調節劑
試 驗 所 使 用 之 植 物 生 長 調 節 劑 ： 包 括 生 長 素 2 , 4 - D
（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid）和 NAA（1-Naphthaleneacetic acid）以 及細胞分裂素 TDZ（Thidiazuron）和 BA（N6-Benzyladenine）。
2.4 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗
將高氏柴胡種子以濃度 1%、1.25%、1.67%及 2.5%之次氯酸鈉（sodium hypochlorite, NaOCl）進行 20、30 與 40 分鐘消毒，培養至每試管含 10 ml 之固態基礎培養基中進行萌芽，八週後記錄萌芽情形。於 16 小時光照下 以溫度 18 ± 1℃培養。
2.5 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導
切取八週的實生苗之根及葉作為培植體進行癒傷組織誘導。以基礎 培養基搭配不同濃度 2,4-D（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）及不同濃度 TDZ
（0、0.5 和 1 mg/L），或搭配不同濃度 NAA（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）
及不同濃度 BA（0、0.5 和 1 mg/L），共三十組試驗。每一試驗組中種入 約一公分之根或一片葉，並進行三重複試驗。於黑暗環境下以溫度 22 ± 1℃培養。試驗四週後拍照紀錄生長情形，並於六週後進行繼代，繼代時 只取癒傷組織進行培養，隨後每隔六週進行繼代。
2.6 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗 高氏柴胡癒傷組織 增殖試驗 增殖試驗 增殖試驗
將各組試驗取得之癒傷組織，取約 0.1 克培養於原培養基中進行四週 之增殖試驗。每組各五重複。
增殖率（比值）＝四週後增殖鮮重（克）÷ 初始鮮重（克）
2.7 BA 與 與 與 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響
將穩定生長之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃 度之 NAA（0、0.01、0.1、1 和 10 mg/L）與不同濃度之 BA（0、0.01、
0.1、1 和 10 mg/L），共六組試驗。各試驗組中挑取約 3×3×3 mm3大小之 癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，並每八週 進行繼代。
2.8 TDZ 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響
挑選由單一生長素（2,4-D 或 NAA）從高氏柴胡根培植體或葉培植 體中所誘導之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃度 之 TDZ（0、0.1、0.5、1 及 5 mg/L），共五組試驗。各試驗組中取約 3×3×3
mm3大小之癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度 為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，
並每八週進行繼代。
2.9 高氏柴胡 高氏柴胡 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡 癒傷組織 癒傷組織 癒傷組織細胞 細胞 細胞 細胞懸浮培養 懸浮培養 懸浮培養 懸浮培養
挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結構鬆散的癒傷組織，以不 添加水晶洋菜之原培養基進行液態懸浮培養。每組試驗含 100 ml 之液態 培養基，並挑取約 0.3 克之癒傷組織進行培養，以 120 rpm 轉速在數位式 迴轉振盪器（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔兩週進行繼 代，培養環境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。
另一懸浮培養試驗，同樣挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結 構鬆散的癒傷組織，以含有全量 MS 鹽類含維他命，添加 30 g/L 蔗糖與 0.2 mg/L 2,4-D 之 D2 培養液進行培養，每組試驗含 20 ml 之液態培養基，
挑取約 0.5 克之癒傷組織進行培養，以 80 rpm 轉速在數位式迴轉振盪器
（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔三週進行繼代，培養環 境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。
挑取與試驗中相同鮮重之 BKL-8R 與 BKL-13R 品系癒傷組織（0.3 或 0.5 克），加以烘乾而求得乾重，並與試驗結束所得之乾重相減而求得 總增殖重量，隨後求得總增殖率。因各品系所進行試驗之時間不同，遂 另將每試驗所得總增殖率，求出平均一個月之增殖量以比較各試驗之增 殖差異進行比較。
總增殖率（比值）＝ 試驗總增殖乾重（克）÷ 初始乾重（克）
月平均增殖率 ＝ 總增殖率 ÷ 試驗月數
2.10 統計方式 統計方式 統計方式 統計方式
試 驗 結 果 利 用 COSTAT 統 計 分 析 軟 體 進 行 鄧 肯 氏 多 變 域 分 析
（Duncan’s Multiple Range Test），比較各處理組之間平均值的差異。取 P 值小於 0.05 之顯著水準下進行比較，以字母區分各組間之差異性，如兩 數據出現相同字母代表兩者無顯著性差異。
第三章 第三章 第三章
第三章 結果 結果 結果 結果
3.1 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗
觀察高氏柴胡種子之萌芽，大多於兩週後即開始發根，八週後生長 為含四葉以上之小苗（圖 3.1）。萌芽試驗結果顯示，長時間（40 分鐘）
消毒之條件下，除了低濃度 1.25%之次氯酸鈉處理有萌芽（萌芽率 18.18%），其餘濃度處理下皆無萌芽。此外，在 20 及 30 分鐘之消毒條件 處理下，各濃度試驗皆有部分萌芽現象，其中以濃度 1.25%之次氯酸鈉 處理 20 分鐘的萌芽率最高（60%）（表 3.1）。
3.2 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導
試驗四週後初步觀察結果顯示，2,4-D 搭配 TDZ 的試驗組在葉培植 體處理組中，控制組及單一使用 2,4-D 的情況下無任何誘導反應發生，
且葉片開始呈現褐化，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產 生，隨後形成癒傷組織（圖 3.2 a）。經過兩次繼代後，葉培植體處理組之 控制組及單獨使用 2,4-D 情形下確認無法誘導出癒傷組織，而單獨使用 0.5 及 1 mg/L TDZ 試驗組所誘導出的透明晶狀物則無法持續生長為癒傷 組織。其餘試驗組中，包含濃度 0.1、0.5、1 及 2 mg/L 2,4-D 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L TDZ 共八組試驗可得到持續生長之癒傷組織（圖 3.2 b）。根培 植體處理組中，試驗四週後初步觀察結果顯示，除控制組外共十四組試 驗組中，根培植體周圍皆可見透明晶狀物產生，並於兩次繼代後其透明 晶狀物可持續生長成為癒傷組織（圖 3.3）。癒傷組織誘導率結果顯示，
葉培植體於控制組及單獨使用 2,4-D 誘導之下無任何癒傷組織形成，而 搭配 TDZ 用後則能成功誘導癒傷組織形成。然而，單獨使用 TDZ 誘導
之下其誘導比率較低。根培植體方面則是除了控制組外皆能成功誘導癒 傷組織形成（表 3.2）。
NAA 搭配 BA 的試驗組中，四週後初步誘導觀察顯示，葉培植體處 理之控制組及單一使用濃度 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 的情況下無任何誘導 反應發生，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產生，隨後形 成癒傷組織（圖 3.4 a）。但單獨使用 BA 之試驗組在一開始所產生的癒傷 組織甚少，且繼代結果顯示單獨使用 BA 的試驗組所誘導之癒傷組織無 法持續生長。經過兩次繼代後，葉培植體處理組在濃度 2 mg/L NAA 試驗 組及 0.1、0.5、1 及 2 mg/L NAA 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L BA 試驗組中可 得到共九組持續生長之癒傷組織（圖 3.4 b）。根培植體處理組中，試驗四 週後初步觀察顯示，除了控制組外各試驗組皆有透明晶狀物產生（圖 3.5 a）。兩次繼代後，單獨使用 1 mg/L BA 之試驗組所得到之癒傷組織無法
NAA 搭配 BA 的試驗組中，四週後初步誘導觀察顯示，葉培植體處 理之控制組及單一使用濃度 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 的情況下無任何誘導 反應發生，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產生，隨後形 成癒傷組織（圖 3.4 a）。但單獨使用 BA 之試驗組在一開始所產生的癒傷 組織甚少，且繼代結果顯示單獨使用 BA 的試驗組所誘導之癒傷組織無 法持續生長。經過兩次繼代後，葉培植體處理組在濃度 2 mg/L NAA 試驗 組及 0.1、0.5、1 及 2 mg/L NAA 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L BA 試驗組中可 得到共九組持續生長之癒傷組織（圖 3.4 b）。根培植體處理組中，試驗四 週後初步觀察顯示，除了控制組外各試驗組皆有透明晶狀物產生（圖 3.5 a）。兩次繼代後，單獨使用 1 mg/L BA 之試驗組所得到之癒傷組織無法