高氏柴胡癒傷組織及試管內形態發生之誘導

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 高氏柴胡癒傷組織及試管內形態發生之誘導 Induction of callus and in vitro morphogenesis of Bupleurum Kaoi. 研究生：朱以航撰指導教授：陳彥澄博士中華民國一百零一年七月.

(2) 謝誌非常感謝指導老師陳彥澄博士的栽培與教導，讓我順利從醫技領域跨越到全新植物組織的研究中，加上自己對植物的喜好，在兩年的學習及實驗過程中得到許多的知識與快樂。感謝口試委員張學偉教授與鄭竣亦老師的指正與教導，讓我得以順利的完成論文，也感謝你們對我的肯定與愛護，從老師們話語中得到了許多信心與小小成就感。謝謝芸寶生技股份有限公司提供研究材料，以及實驗室學長李伯倫、學長蔡岡倫和同學世揚在實驗室的陪伴與幫助。謝謝系辦劉先生與美純姐在一切事務上的幫忙與相助。謝謝高大的學長姐、同學以及學弟妹們，因為有你們 501 變得很熱鬧。還要感謝家人對我無限支持與照顧，讓我無壓力地完成學業，非常愛你們。最後謝謝天兵思璇、天將縕沛、鈺珊、惠敏還有心妤，謝謝你們陪我聊天玩樂紓解壓力，有你們真棒！. 國立高雄大學生物科技研究所學生朱以航謹誌 2012 年 7 月 I.

(3) 縮寫表. 2,4-D. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid. BA. N6-Benzyladenine. MS. Murashige and Skoog, 1962. NAA. 1-Naphthaleneacetic acid. TDZ. Thidiazuron. II.

(4) 目錄頁次謝誌.....................................................................................................................I 縮寫表................................................................................................................II 目錄..................................................................................................................III 表目錄...............................................................................................................V 圖目錄..............................................................................................................VI 中文摘要............................................................................................................1 英文摘要............................................................................................................3. 第一章前言.................................................................................................5 1.1. 柴胡之植物學特性...................................................................................5. 1.2. 柴胡之藥用價值.......................................................................................5. 1.3. 高氏柴胡之簡介與優勢...........................................................................7. 1.4. 柴胡組織培養之前人研究.......................................................................7. 1.5. 研究目的...................................................................................................9. 第二章材料與方法.................................................................................12 2.1. 實驗材料.................................................................................................12. 2.2. 基礎培養基.............................................................................................12. 2.3. 植物生長調節劑.....................................................................................12. 2.4. 高氏柴胡種子萌芽試驗.........................................................................12. 2.5. 高氏柴胡癒傷組織之誘導.....................................................................12. 2.6. 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗.................................................................13. 2.7 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響..............................................13 III.

(5) 目錄頁次 2.8. TDZ 對癒傷組織形態發生之影響.........................................................13. 2.9. 高氏柴胡癒傷組織細胞懸浮培養.........................................................14. 2.10 統計方式.................................................................................................15. 第三章結果...............................................................................................16 3.1. 高氏柴胡種子萌芽試驗.........................................................................16. 3.2. 高氏柴胡癒傷組織之誘導.....................................................................16. 3.3. 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗.................................................................17. 3.4 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響..............................................18 3.5. TDZ 對癒傷組織形態發生之影響.........................................................23. 3.6. 高氏柴胡癒傷組織細胞懸浮培養.........................................................24. 第四章討論.. 討論 .............................................................................................56 第五章參考文獻.. 參考文獻 ...................................................................................60. IV.

(6) 表目錄頁次表 1.1. 柴胡研究概況表.................................................................................11. 表 3.1. 高氏柴胡種子萌芽率.........................................................................26. 表 3.2. 2,4-D 及 TDZ 處理之高氏柴胡根、葉培植體癒傷組織誘導率........29. 表 3.3. NAA 及 BA 處理之高氏柴胡根、葉培植體癒傷組織誘導率...........32. 表 3.4. 2,4-D 及 TDZ 處理之高氏柴胡癒傷組織增殖率與形態..................33. 表 3.5. NAA 及 BA 處理之高氏柴胡癒傷組織增殖率與形態.....................34. 表 3.6. 高氏柴胡癒傷組織品系名稱對照表.................................................36. 表 3.7 BA 與 NAA 對高氏柴胡癒傷組織發根影響－BKL 品系.................45 表 3.8 BA 與 NAA 對高氏柴胡癒傷組織發根影響－BKLC 品系..............46 表 3.9. 高氏柴胡懸浮培養細胞之增殖率.....................................................54. V.

(7) 圖目錄頁次圖 1.1. 柴胡皂苷結構式.................................................................................10. 圖 3.1. 高氏柴胡種子萌芽情形.....................................................................25. 圖 3.2. 2,4-D 及 TDZ 對高氏柴胡葉培植體癒傷組織誘導影響..................27. 圖 3.3. 2,4-D 及 TDZ 對高氏柴胡根培植體癒傷組織誘導影響..................28. 圖 3.4. NAA 及 BA 對高氏柴胡葉培植體癒傷組織誘導影響.....................30. 圖 3.5. NAA 及 BA 對高氏柴胡根培植體癒傷組織誘導影響.....................31. 圖 3.6. 高氏柴胡癒傷組織形態與增生能力之關係.....................................35. 圖 3.7 高氏柴胡 BKL-7L 品系癒傷組織形態發生......................................37 圖 3.8 高氏柴胡 BKL-8R 品系癒傷組織形態發生......................................38 圖 3.9 高氏柴胡 BKL-10R 品系癒傷組織形態發生....................................39 圖 3.10 高氏柴胡 BKL-13L 品系癒傷組織形態發生....................................40 圖 3.11 高氏柴胡 BKL-13R 品系癒傷組織形態發生………….....….....…..41 圖 3.12 高氏柴胡 BKLC-7R 品系癒傷組織形態發生…………......….........42 圖 3.13 高氏柴胡 BKLC-12R 品系癒傷組織形態發生……….....…..….….43 圖 3.14 高氏柴胡 BKLC-13L 品系癒傷組織形態發生………..….….....….44 圖 3.15 TDZ 對高氏柴胡 BKL-7 品系癒傷組織形態發生影響……….…....47 圖 3.16 TDZ 對高氏柴胡 BKL-12 品系癒傷組織形態發生影響.....…...…...48 圖 3.17 TDZ 對高氏柴胡 BKLC 品系癒傷組織形態發生影響…………......49 圖 3.18 高氏柴胡 BKL-13R 品系癒傷組織懸浮培養試驗一……….….…..51 圖 3.19 高氏柴胡 BKL-8R 品系癒傷組織懸浮培養試驗一……….……….52. VI.

(8) 圖目錄頁次圖 3.20 高氏柴胡癒傷組織之懸浮培養試驗二......………….……..….…...53 圖 3.21 高氏柴胡癒傷組織及懸浮培養細胞（光學顯微鏡拍攝）......……55. VII.

(9) 高氏柴胡癒傷組織及試管內形態發生之誘導指導教授：陳彥澄博士國立高雄大學生物科技研究所學生：朱以航國立高雄大學生物科技研究所摘要本論文建立高氏柴胡癒傷組織誘導系統，並以不同種類及濃度之植物生長調節劑，將所誘導之癒傷組織進行試管內形態發生。種子萌芽試驗結果顯示，以 1.25%之次氯酸鈉處理二十分鐘的萌芽率最高（60%）。切取萌芽八週的實生苗之根及葉作為培植體，以不同濃度之生長素（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D 或 1-Naphthaleneacetic acid, NAA）與細胞分裂素（Thidiazuron, TDZ 或 N6-Benzylaminopurine, BA）搭配進行癒傷組織誘導，共獲得十七個品系癒傷組織，這些癒傷組織穩定地生長並以相同的培養條件下持續進行繼代。各品系癒傷組織之形態結構有所差異。藉由增殖率試驗及癒傷組織形態分析，挑選形態為黃色或淡黃色之結構緊密且增殖率高的癒傷組織，包含 BKL-7L、BKL-8R、BKL-10R、BKL-13L、BKL-13R、BKLC-7R、BKLC-12R 及 BKLC-13L 共八品系，繼續進行形態發生試驗。形態發生試驗過程中，各品系癒傷組織培養在光照環境，開始由淡黃色或黃色逐漸轉為綠色。其中 BKL-8R、BKL-10R、BKL13R、 BKLC-7R、BKLC-12R 及 BKLC-13R 癒傷組織在光照培養下，逐漸形成根器官。以不同濃度 BA 及 NAA 誘導下，BKL-10R、BKL-13L、BKL-13R、BKLC-7R、BKLC-12R 及 BKLC-13R 癒傷組織產生根器官。BKL-13L 癒傷組織於 0.1 mg/L BA+10 mg/L NAA、BKLC-7R 癒傷組織於 1 mg/L BA+1 mg/L NAA 及 BKLC-12R 癒傷組織於 0.1 mg/L BA+10 mg/L NAA、1 mg/L BA+1 mg/L NAA 試驗組中發根率為最高，比率達到 100%。由 NAA 與 BA 所誘導之癒傷組織品系，在癒傷組織培養時期即有根生成，而 1.

(10) 各品系癒傷組織搭配不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導過程中，陸續也出現發根現象。推測 NAA 與 BA 對高氏柴胡癒傷組織具有促進發根的作用。在 TDZ 誘導癒傷組織形態發生過程中，BKL-7L、BKL-7R、BKL-12L、BKL-12R、BKLC-2R、 BKLC-7R 及 BKLC-12R 共七品系癒傷組織，除 BKLC-2R 品系外，其餘品系在光照培養下開始轉綠，但經八週培養後，仍無發根現象。高氏柴胡細胞懸浮培養試驗結果顯示，BKL-13R 品系癒傷組織細胞之平均月增殖量無論在不添加水晶洋菜之原培養基或 D2 培養基中都比 BKL-8R 品系高。現階段試驗結果顯示，BKL-13R 品系癒傷組織應較有利於未來高氏柴胡進行細胞懸浮培養、基因轉殖及多倍體試驗等研究。. 關鍵字：關鍵字：形態發生、形態發生、細胞懸浮培養、細胞懸浮培養、高氏柴胡、高氏柴胡、植物生長調節劑、植物生長調節劑、癒傷組織誘導. 2.

(11) Induction of callus and in vitro morphogenesis of Bupleurum Kaoi Advisor：Dr. Chen, Jen-Tsung Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student：Chu, Yi-Hang Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT This thesis attempts to develop a protocol for induction of callus from explants taken from seedlings of Bupleurum kaoi, and subsequently the in vitro morphogenesis of callus that was induced by different types and concentrations of plant growth regulators (PGRs) were evaluated. It was found that the treatment of 1.25% sodium hypochlorite for 20 min gave the highest germination rate (60%). Segments taken from roots and leaves of 8-week-old seedling were used as explants for callus induction. The results displayed that there were 17 callus lines could be obtained on culture media supplemented with different combinations of auxins (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D or 1-Naphthaleneacetic acid, NAA) with cytokinins (Thidiazuron, TDZ or N6-Benzylaminopurine, BA). These callus showed stable growth and could be subcultured on the same culture medium. They possessed obvious variations on their color and shape among these callus lines. By systematically selection on proliferation rate and callus morphology, yellow or whitish-yellow compact callus, comprising lines BKL-7L, BKL-8R, BKL-10R, BKL-13L, BKL-13R, BKLC-7R, BKLC-12R and BKLC-13L, having high proliferation rate were further selected for in vitro 3.

(12) morphogenesis. Then, all of the callus which were cultured in light for induction gradually turned from yellow or whitish-yellow into green. Furthermore, root formations were found in callus lines BKL-8R, of BKL-10R, BKL13R,-7R BKLC, BKLC-12R and BKLC-13R. Additionally, it was found that roots could be induced from callus lines BKL-10R, BKL-13L, BKL-13R, BKLC-7R BKLC-12R and BKLC-13R on media supplemented with different combinations of BA and NAA. The results showed that line BKL-13L at 0.1 mg/L BA+10 mg/L NAA, BKLC-7R at 1 mg/L BA+1 mg/L NAA and BKLC-12R at 0.1 mg/L BA+10 mg/L NAA or at 1 mg/L BA+1 mg/L NAA had a 100% rate of root formation. Callus induced from different combinations of NAA and BA had ability to form roots during callus subculture, and more roots could be obtained when they were transferred onto different combinations of BA and NAA for induction. It was suggested that combinations of NAA and BA could promote root formation from callus cultures in Bupleurum kaoi. Seven callus lines, including BKL-7L, BKL-7R, BKL-12L, BKL-12R, BKLC-2R, BKLC-7R and BKLC-12R, were used to evaluate the ability of induction in vitro morphogenesis under different concentrations of TDZ. After eight weeks, except for line BKLC-2R, all of the callus lines which was cultured in light turned into green. Besides, no roots could be found in all of the treatments. The result showed that cell suspension culture was established from callus of Bupleurum kaoi, the average of monthly proliferation of callus lines BKL-13R in terms of using liquid media by omitting of gelling agent or D2 medium were higher than BKL-8R. The results suggested that callus line BKL-13R should be more conducive to cell suspension culture, transgenic and polyploid research of Bupleurum kaoi in the future. Keywords: morphogenesis, cell suspension culture, Bupleurum kaoi, plant growth regulator, callus induction 4.

(13) 第一章前言 1.1 柴胡之植物學特性柴胡（Bupleuri radix）為繖形科（Umbelliferae）柴胡屬（Bupleurum）之多年生草本植物，有茈胡、地熏、山菜及茹草等別名，其物種約一百種以上，產於中國東北、華北、河南、河北、湖南、湖北、江蘇、四川、西北、山東等地區，另於韓國、日本、台灣等地也有不同品種之柴胡分布（甘, 1991；黃, 1997；傅, 2003）。柴胡株高一般可達 30 至 125 公分，屬主根較粗大之植株，收成兩年生之植株為佳，於春秋兩季採收，將莖葉去除後加以清洗，曬乾或乾燥使用（古等, 2006；徐等, 1997；劉, 2004）。柴胡屬常異交植物，鮮少有人為選殖栽培，植物品種間之遺傳變異大，其種子成熟時間不同步，導致同期採收之種子成熟度不一，加上柴胡種子發芽喜好低溫（18℃～22℃）且休眠期長、自然發芽率不佳，增加栽培之難度（黃和郭, 1995）。. 1.2 柴胡之藥用價值柴胡之藥用部分為乾燥根部（Bupleurum spp. Root），常用品種包括來自於中國的北柴胡（B. chinense DC.）、狹葉柴胡（B. scorzonerifolium Willd.）及日本的三島柴胡（B. falcatum L. var. komarowi Koso-Polj）等（古等, 2006；凌, 2004）。神農本草經將柴胡列為「上品」，並記載其性味「苦. 5.

(14) 平」，主「心腹腸胃結氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新。」，為傳統上對於肝膽保健及疾病治療常用中藥，可廣泛應用於感冒、炎症、肝膽等消化系統與免疫等相關疾病（田, 2004；邱等, 2001；黃, 1997）。柴胡含有柴胡皂苷（Saikosaponin）、甾醇、揮發油、柴胡醇（Bupleurumol）、脂肪酸、多醣類以及黃酮類等成分（徐, 1997；顏, 1998）。其主要藥用成分為柴胡皂苷，又細分為 Saikosaponin A（SSa）、Saikosaponin B1（SSb1）、 Saikosaponin B2（SSb2）、Saikosaponin C（SSc）及 Saikosaponin D（SSd）（圖 1.1），其中以 SSa 與 SSd 在保肝、消炎、抗 B 型肝炎病毒、抗氧化、抑制癌細胞等扮演重要角色（Chen et al., 2006； Cheng et al., 2005/2003； Chiang et al., 2003；Hsu et al., 2004）。除了提高免疫系統之免疫反應外，另外也有研究發現柴胡萃取物能抑制因 B 型肝炎所誘發的肝癌細胞、誘使肺癌細胞細胞凋亡以及抗冠狀病毒和病毒複製等功用（Chen et al. 2006；Cheng et al., 2003；Cheng et al., 2005；Cheng et al., 2006；Chiang et al. 2003；Hsu et al. 2004；Ushio et al. 1991）。另外，研究顯示 SSd 亦具有抑制乳癌細胞生長、抑制免疫系統過度反應並降低發炎和自體免疫疾病發生、防止肝臟纖維化傷害與抑制肝細胞纖維化等能力（Bermejo et al. 1998；Chen et al. 2003；Dang et al. 2006；Fan et al. 2007；Leung et al. 2005）。. 6.

(15) 1.3 高氏柴胡之簡介與優勢高氏柴胡（B. kaoi Liu Chao & Chuang）為台灣特有原生種，多年生草本植物，有竹葉柴胡、柴胡、皇帝草等別名，其株高可達 40 至 135 公分，早期由高木村教授等學者發現而命名為高氏柴胡。其野生族群分布於台灣北部與中部之低海拔丘陵地區，近年來因大量被摘採而有瀕臨滅絕的危機（鄭, 2000；劉, 2004）。國內常用之柴胡種類包括北柴胡、三島柴胡及高氏柴胡，其中又以台灣原生種之高氏柴胡保肝效果最佳（林和顏, 1999）。研究顯示高氏柴胡保肝作用優於北柴胡外，其種子發芽率也高於三島柴胡，其柴胡皂苷 SSa、SSc、SSd 的含量高於三島柴胡 2~3 倍，相對於北柴胡更是高出 10 倍（林和顏, 1999）。行政院農委會農業試驗所在 2006 年柴胡之 GMP 栽培模式與品質評價報告中，結果顯示高氏柴胡之公頃產量高於三島柴胡及北柴胡，此外，SSa 及 SSd 之含量也以高氏柴胡為最高（劉, 2006）。. 1.4 柴胡組織培養之前人柴胡組織培養之前人研究前人研究藥用植物廣泛被人們運用在日常生活與醫療使用，已有長遠歷史，從秦漢時期之神農本草經中即有記載三百多種，直至南朝更增加編列至七百三十餘種（謝, 2004）。隨著世代演進及社會進步，藥用植物的利用更加寬廣，對此需求進而大大提高，慢慢的野生植株便開始供不應求。. 7.

(16) 因此有學者便開始針對有高經濟價值或市場需求潛力高之藥用植物進行人工栽培，植物組織培養即是常用方法之一（蔡等, 2003）。植物組織培養是將植物的種子、器官（根、莖、葉等）、胚胎、單一細胞或是原生質體等部分取出，以無菌的方式在試管中給予適當養份的培養基進行培養（孔, 2009）。利用植物組織培養進行繁殖，不僅能縮短植株的栽培時間，並能在短時間內進行大量生產之目的，對於種原的保育也是一大功臣（孔, 2009；蔡, 1999；蔡等, 2003）。利用組織培養技術大量繁殖藥用植物已有許多成功的例子，如：人參（Chang and Hsing, 1979/1980）、大黃（Kaneko et al., 1986）、山藥（Forsyth and Stadn, 1982）、毛地黃（Erdei et al., 1981）、白及（Chung et al., 1983；Ichihashi and Yamashita, 1977；Jonsson and Nylund, 1979；Luks and Shevehenk, 1977）、半夏（Hatano et al., 1986；Shoyama et al., 1983；Tsay et al., 1989）、地黃（Matsumoto et al., 1986；Nishioka, 1988；Xu and Davey, 1983）、百合（Shoyama et al., 1987）、貝母（Shoyama et al., 1986）、金線連（Liu et al., 1987）、柴胡（Hiraoka et al., 1983）、防風（Hiraoka et al., 1987）、黃耆（Fujioka et al., 1983）、紫草（Tsukaba, 1983）與當歸（Tsay and Huang, 1998）等。 1983年Hiraoka與Kodama開始著手於三島柴胡試管內培養繁殖，並於 1986年從根葉中成功誘導出癒傷組織，培養成為小植株（Hiraoka and. 8.

(17) Kodama, 1984；Hiraoka et al., 1986）。1992年Xia等學者則是成功從狹葉柴胡的莖節中誘導出具胚性癒傷組織，隨後也成功將這些具胚性癒傷組織培養成為小植株（Xia et al., 1992）。1993年，許等學者利用台農一號之三島柴胡頂芽及腋芽作為培植體進行組織培養，成功大量繁殖三島柴胡組培苗（許等, 1993）。至1999年後，研究學者開始利用三島柴胡之種子進行試驗，以莖節誘導癒傷組織進行懸浮培養得到原生質體藉由胚的形成得到植株（Bang et al., 1999），或進行不定根繁殖（Kusakari et al., 2000）。直至2004年，夏及陳等學者開始研究台灣原生種高氏柴胡，其利用腋芽或莖節作為培植體，完成芽體增生試驗，初步建立了高氏柴胡之大量繁殖技術（陳等, 2004；陳, 2006）（表1.1）。. 1.5 研究目的本研究之目的為建立高氏柴胡癒傷組織誘導系統，並以不同濃度之植物生長調節劑將所誘導之癒傷組織進行試管內形態發生，本試驗所得之結果，可進一步運用於種苗繁殖、基因轉殖、細胞懸浮培養及多倍體誘導等研究。. 9.

(18) H. HO HO. O. HO O H O OH. HO. O. H O. H. OH. H OH. OH Saikosaponin A. OH HO. O. O HO. O. H O. H. OH HO. OH. H. O OH. OH. HO. OH. HO. O. O. H. H OH. OH OH. HO. OH. H O. OH Saikosaponin B1. Saikosaponin B2. OH OH. HO O OH HO HO. O H O HO. OH. H. O. O O. H O. H. OH. H. OH Saikosaponin C. H. HO HO HO. HO O H O OH. O O. H O. H. H OH. OH Saikosaponin D. 圖 1.1 柴胡皂苷結構式 (鄭竣亦老師繪製)。. 10. OH. OH.

(19) 表 1.1 柴胡研究概況表 Species. Explants. In vitro Morphogenesis. References. Bupleurum falcatum. Leaf. Callus. Hiraoka and Kodama, 1984. B. falcatum. Leaf. Callus and plantlets. Hiraoka et al., 1986. B. falcatum. Shoot tip. Shoots. Kohda et al., 1990. B. scorzonerifolium Stem node. Embryogenic calli, protoplasts, somatic embryos and plantlets. Xia et al., 1992. B. falcatum L. cv. Tainung No. 1. Apical buds and axillary buds. Shoots. 許等, 1993. B. falcatum L.. Anther. Calli, embryoids and plantlets. Shon and Yoshida, 1997. B. falcatum L.. Seeds. Embryogenic callus, Bang et al., 1999 protoplasts, somatic embryos and plants. B. falcatum L.. Seeds. Roots and adventitious roots. Kusakari et al., 2000. B. fruticosum. Nodal explants. Shoots and roots. Fraternale et al., 2002. B. kaoi. Axillary buds Shoots. Chen et al., 2004. B. kaoi. Nodal segments. Chen et al., 2006. B. kaoi. Axillary buds Shoots and callus. Shoots. 11. Chen, 2006.

(20) 第二章材料與方法 2.1 實驗材料高氏柴胡種子（芸寶生技股份有限公司提供）。. 2.2 基礎培養基基礎培養基成分為全量 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類含維他命，添加 30 g/L 蔗糖（sucrose）與 1 g/L 蛋白腖（peptone）及 3 g/L 水晶洋菜（gelrite）。培養基 pH 為 5.8 ± 0.01。. 2.3 植物生長調節劑試驗所使用之植物生長調節劑：包括生長素 2,4-D （2,4-Dichlorophenoxyacetic acid）和 NAA（1-Naphthaleneacetic acid）以及細胞分裂素 TDZ（Thidiazuron）和 BA（N 6 -Benzyladenine）。. 2.4 高氏柴胡種子萌芽試驗將高氏柴胡種子以濃度 1%、1.25%、1.67%及 2.5%之次氯酸鈉（sodium hypochlorite, NaOCl）進行 20、30 與 40 分鐘消毒，培養至每試管含 10 ml 之固態基礎培養基中進行萌芽，八週後記錄萌芽情形。於 16 小時光照下以溫度 18 ± 1℃培養。. 2.5 高氏柴胡癒傷組織之誘導切取八週的實生苗之根及葉作為培植體進行癒傷組織誘導。以基礎培養基搭配不同濃度 2,4-D（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）及不同濃度 TDZ 12.

(21) （0、0.5 和 1 mg/L），或搭配不同濃度 NAA（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）及不同濃度 BA（0、0.5 和 1 mg/L），共三十組試驗。每一試驗組中種入約一公分之根或一片葉，並進行三重複試驗。於黑暗環境下以溫度 22 ± 1℃培養。試驗四週後拍照紀錄生長情形，並於六週後進行繼代，繼代時只取癒傷組織進行培養，隨後每隔六週進行繼代。. 2.6 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗高氏柴胡癒傷組織增殖試驗將各組試驗取得之癒傷組織，取約 0.1 克培養於原培養基中進行四週之增殖試驗。每組各五重複。增殖率（比值）＝四週後增殖鮮重（克）÷ 初始鮮重（克）. 2.7 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響將穩定生長之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃度之 NAA（0、0.01、0.1、1 和 10 mg/L）與不同濃度之 BA（0、0.01、 0.1、1 和 10 mg/L），共六組試驗。各試驗組中挑取約 3×3×3 mm3 大小之癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，並每八週進行繼代。. 2.8 TDZ 對癒傷組織形態發生之影響挑選由單一生長素（2,4-D 或 NAA）從高氏柴胡根培植體或葉培植體中所誘導之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃度之 TDZ（0、0.1、0.5、1 及 5 mg/L），共五組試驗。各試驗組中取約 3×3×3 13.

(22) mm3 大小之癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，並每八週進行繼代。. 2.9 高氏柴胡癒傷組織高氏柴胡癒傷組織細胞癒傷組織細胞懸浮培養細胞懸浮培養挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結構鬆散的癒傷組織，以不添加水晶洋菜之原培養基進行液態懸浮培養。每組試驗含 100 ml 之液態培養基，並挑取約 0.3 克之癒傷組織進行培養，以 120 rpm 轉速在數位式迴轉振盪器（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔兩週進行繼代，培養環境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。另一懸浮培養試驗，同樣挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結構鬆散的癒傷組織，以含有全量 MS 鹽類含維他命，添加 30 g/L 蔗糖與 0.2 mg/L 2,4-D 之 D2 培養液進行培養，每組試驗含 20 ml 之液態培養基，挑取約 0.5 克之癒傷組織進行培養，以 80 rpm 轉速在數位式迴轉振盪器（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔三週進行繼代，培養環境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。挑取與試驗中相同鮮重之 BKL-8R 與 BKL-13R 品系癒傷組織（0.3 或 0.5 克），加以烘乾而求得乾重，並與試驗結束所得之乾重相減而求得總增殖重量，隨後求得總增殖率。因各品系所進行試驗之時間不同，遂另將每試驗所得總增殖率，求出平均一個月之增殖量以比較各試驗之增殖差異進行比較。總增殖率（比值）＝試驗總增殖乾重（克）÷ 初始乾重（克）月平均增殖率＝總增殖率 ÷ 試驗月數 14.

(23) 2.10 統計方式試驗結果利用 COSTAT 統計分析軟體進行鄧肯氏多變域分析（Duncan’s Multiple Range Test），比較各處理組之間平均值的差異。取 P 值小於 0.05 之顯著水準下進行比較，以字母區分各組間之差異性，如兩數據出現相同字母代表兩者無顯著性差異。. 15.

(24) 第三章結果 3.1 高氏柴胡種子萌芽試驗觀察高氏柴胡種子之萌芽，大多於兩週後即開始發根，八週後生長為含四葉以上之小苗（圖 3.1）。萌芽試驗結果顯示，長時間（40 分鐘）消毒之條件下，除了低濃度 1.25%之次氯酸鈉處理有萌芽（萌芽率 18.18%），其餘濃度處理下皆無萌芽。此外，在 20 及 30 分鐘之消毒條件處理下，各濃度試驗皆有部分萌芽現象，其中以濃度 1.25%之次氯酸鈉處理 20 分鐘的萌芽率最高（60%）（表 3.1）。. 3.2 高氏柴胡癒傷組織之誘導試驗四週後初步觀察結果顯示，2,4-D 搭配 TDZ 的試驗組在葉培植體處理組中，控制組及單一使用 2,4-D 的情況下無任何誘導反應發生，且葉片開始呈現褐化，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產生，隨後形成癒傷組織（圖 3.2 a）。經過兩次繼代後，葉培植體處理組之控制組及單獨使用 2,4-D 情形下確認無法誘導出癒傷組織，而單獨使用 0.5 及 1 mg/L TDZ 試驗組所誘導出的透明晶狀物則無法持續生長為癒傷組織。其餘試驗組中，包含濃度 0.1、0.5、1 及 2 mg/L 2,4-D 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L TDZ 共八組試驗可得到持續生長之癒傷組織（圖 3.2 b）。根培植體處理組中，試驗四週後初步觀察結果顯示，除控制組外共十四組試驗組中，根培植體周圍皆可見透明晶狀物產生，並於兩次繼代後其透明晶狀物可持續生長成為癒傷組織（圖 3.3）。癒傷組織誘導率結果顯示，葉培植體於控制組及單獨使用 2,4-D 誘導之下無任何癒傷組織形成，而搭配 TDZ 用後則能成功誘導癒傷組織形成。然而，單獨使用 TDZ 誘導 16.

(25) 之下其誘導比率較低。根培植體方面則是除了控制組外皆能成功誘導癒傷組織形成（表 3.2）。 NAA 搭配 BA 的試驗組中，四週後初步誘導觀察顯示，葉培植體處理之控制組及單一使用濃度 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 的情況下無任何誘導反應發生，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產生，隨後形成癒傷組織（圖 3.4 a）。但單獨使用 BA 之試驗組在一開始所產生的癒傷組織甚少，且繼代結果顯示單獨使用 BA 的試驗組所誘導之癒傷組織無法持續生長。經過兩次繼代後，葉培植體處理組在濃度 2 mg/L NAA 試驗組及 0.1、0.5、1 及 2 mg/L NAA 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L BA 試驗組中可得到共九組持續生長之癒傷組織（圖 3.4 b）。根培植體處理組中，試驗四週後初步觀察顯示，除了控制組外各試驗組皆有透明晶狀物產生（圖 3.5 a）。兩次繼代後，單獨使用 1 mg/L BA 之試驗組所得到之癒傷組織無法持續生長外，其餘試驗組共十三組皆可持續生長（圖 3.5 b）。癒傷組織誘導率結果顯示，葉培植體於控制組及單獨使用 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 誘導之下無任何癒傷組織形成，其餘試驗組皆能成功誘導出癒傷組織，其中以 2 mg/L NAA 及單獨使用 BA 誘導之下其誘導比率較低。根培植體同樣除了控制組外皆能成功誘導癒傷組織形成（表 3.3）。癒傷組織誘導試驗顯示，癒傷組織於持續繼代過程中，以 NAA 搭配 BA 試驗組所誘導之癒傷組織即有根生成現象（圖 3.5 箭頭標示處），而 2,4-D 搭配 TDZ 試驗組中則無此現象。. 3.3 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗癒傷組織誘導試驗過程中，因培植體為多細胞之成熟器官（根、葉）， 17.

(26) 導致誘導出各癒傷組織形態有所差異且生長速度也不盡相同，故將進行增殖試驗以區分各癒傷組織之生長速度快慢。增殖試驗結果顯示，以 2,4-D 與 TDZ 所誘導的癒傷組織而言，根培植體中以 0.5 mg/L 2,4-D + 1 mg/L TDZ 所誘導之癒傷組織增殖比率最高（8.458 倍），其癒傷組織顏色為黃色、觸感偏硬且結構緊密，次高者為由根培植體中以 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 誘導之淡黃色、觸感偏硬且結構緊密的癒傷組織（5.84 倍）以及 0.5 mg/L 2,4-D 所誘導之淡黃偏透白、觸感柔軟蓬鬆且結構緊密的癒傷組織（4.74 倍）（表 3.4）。NAA 與 BA 所誘導的癒傷組織中，由根培植體中所誘導出的淡黃偏透白之觸感較鬆散的癒傷組織增殖速度較快，其中又以 1 mg/L NAA 所誘導出的根癒傷組織增殖比例最高（5.16 倍），以 2 mg/L NAA 所誘導之癒傷組織次之（3.3 倍）（表 3.5）。增殖試驗結果顯示出癒傷組織形態與增殖能力彼此間有一定之相關性，以外觀及生長速率可大致將癒傷組織分成四類。首先以觸感偏硬或鬆散之黃色癒傷組織生長，其生長速率為最快速（例如：0.5 mg/L 2,4-D + 1 mg/L TDZ-8.458 倍、2 mg/L 2,4-D + 0.5 TDZ-5.84 倍、0.5 mg/L NAA + 1 mg/L BA-2.44 倍等）；形態蓬鬆之淡黃白色或半透明狀的癒傷組織之生長速率次之（例如：1 mg/L NAA-5.16 倍、0.5 mg/L 2,4-D-4.74 倍、2 mg/L NAA-3.75 倍等）；結構為小團塊狀或顆粒狀之紅褐色癒傷組織生長速率稍慢；形態軟爛、水浸狀之灰白色癒傷組織之生長速率最為緩慢甚至無增生之現象（例如：2 mg/L 2,4-D 此組因癒傷組織量甚少故無法進行增殖試驗）（圖 3.6）。. 18.

(27) 3.4 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響先前研究顯示，結構緊密或鬆散之黃色、霜白色癒傷組織之再生能力較好（Khanna et al., 2006；Songstad et al., 1992；Visarada et al., 2002）。因此，本試驗將依照增殖試驗結果，挑選出生長情形佳且呈黃色或淡黃色之結構緊密的癒傷組織，進行形態發生試驗。共挑取 2,4-D 與 TDZ 所誘導之五品系癒傷組織（BKL-7L、BKL-8R、BKL-10R、BKL-13L 及 BKL-13R，癒傷組織品系名稱之試驗組別參照表 3.6）以及 NAA 與 BA 所誘導之三品系癒傷組織（BKLC-7R、BKLC-12R、BKLC-13L，癒傷組織品系名稱之試驗組別參照表 3.6）。形態發生試驗兩週後觀察顯示，所有試驗組在移置 16 小時光照下處理後癒傷組織因照光開始行光合作用，由原本的淡黃色或黃色開始轉變為綠色，且大多癒傷組織轉換至形態發生培養基後，仍有持續增生之情形，部分癒傷組織會由團塊狀逐漸轉變成為小球狀。而這些小球狀組織大多進一步形成根器官。所有八品系癒傷組織進行形態發生試驗過程中，當培養至第八週會癒傷組織開始有轉白之現象，而待繼代更換新培養基後即會再次漸漸綠化，推測繼代時間應以六至八週為佳。 BKL-7L 品系以 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA、10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度較快且生長情形較佳，而控制組、0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組生長較慢。十二週後癒傷組織雖有明顯褐化情形，但部分仍有持續生長與變化（圖 3.7）。 BKL-8R 品系以 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度為 19.

(28) 快，又以後兩者生長情形為佳，10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度次之，而控制組及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度生長較慢，此情形與 BKL-7L 品系癒傷組織不同。控制組於第八週觀察有發根之情形，除了控制組及 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織有較多褐化現象外，其餘試驗組皆僅轉綠而無發根現象（圖 3.8）。 BKL-10R 品系相對於前兩品系而言其控制組生長狀況良好，無褐化情形，且於第六週開始有根生成現象。0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度為快，0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組次之，以上試驗之癒傷組織外觀有部分新生癒傷組織形態為偏白霜色且呈小球狀或團塊狀，第十四週後觀察這些呈小球狀或團塊狀之癒傷組織開始偏向根發育之路徑（圖 3.9）。 BKL-13L 品系與其餘組別比較下其轉綠情形比較偏深綠色，除了控制組及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長較為緩慢外，其餘四種形態發生試驗結果其癒傷組織生長情形皆良好，褐化情形少。觀察顯示其根發育情形明顯多於其餘品系，包含 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組，於第十週後有明顯根生成。在 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組走向根系發育之前，其癒傷組織會先形成較大粒的球狀細胞隨後發育為根，而根形態偏粗短；而 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織則是在轉綠的癒傷組織團塊上直接生長出根，相較於由球形細胞所生成之根，其根形態較偏細長（圖 3.10）。 BKL-13R 品系其癒傷組織生長速度以 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 20.

(29) 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組最快，控制組及 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組次之。觀察結果顯示，控制組在第六週即有多量的根在癒傷組織團塊表面開始生成，其根形態偏為細長，1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織也同樣於第六週開始進行根發育，其根形態為細長型。而 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 兩組試驗中，癒傷組織在第八週開始明顯分化成為較大的球型細胞，且其癒傷組織為半透明且結構蓬鬆，尚無根生成現象。10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度最慢，其癒傷組織從第八週開始褐化，細胞生長呈衰退之現象（圖 3.11）。 BKLC-7R 品系除控制組外其餘五組癒傷組織皆生長快速。控制組中於第六週有根生成。0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織隨培養時間越長，外圍長出越多的蓬鬆半透明形態之癒傷組織。明顯發根組別還有 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組，其根形態也多為細長型。而 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組中，癒傷組織慢慢形成小球狀，有少數開始發育為根（圖 3.12）。 BKLC-12R 品系其癒傷組織增生沒有其餘品系來的快但根系發育卻很旺盛。由控制組、0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組中皆有根發育之情形，且其根毛發育也非常茂密。而 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度緩慢外，也在第八週開始有褐化之現象，但仍有再生出新癒傷組織並轉綠的情形（圖 3.13）。 BKLC-13L 品系控制組、10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度慢，而 0.01 mg/L BA + 10 21.

(30) mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L 試驗組則生長快速。生長快速之三試驗組，在原癒傷組織外圍開始生成蓬鬆半透明之新癒傷組織，其中 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 兩組試驗癒傷組織偏向於大球狀的生長，並於第六週開始有類似根的發育，但發育與上述其餘品系之發根組比較下顯得緩慢許多。控制組則在第八週開始有根生成現象，其根形態為細長型（圖 3.14）。將所有發根情形加以統整量化，觀察不同濃度之 BA 與 NAA 對於各品系癒傷組織影響的結果。首先在 BKL 所挑選之五品系試驗組中，除 BKL-7L 之外，其餘品系之控制組皆在試驗過程中有根發育現象，其中以 BKL-13R 發根率最高（80%）。低濃度 BA（0.1 及 0.01 mg/L）搭配高濃度 NAA（10 mg/L）處理誘導下，各品系大部份有發根情形，以 BKL-13L 在 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組誘導下之發根率最高（100%）。濃度 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 的試驗中，除了 BKL-8R 及 10R 品系，其餘品系皆有 40%發根率。高濃度 BA（10 mg/L）搭配低濃度 NAA（0.1 及 0.01 mg/L）處理誘導下，各品系皆無任何根形成（表 3.7）。另外，由 BKLC 品系所挑選之三品系癒傷組織形態發生試驗中，其控制組發根率有 60 至 80%。低濃度 BA（0.1 及 0.01 mg/L）搭配高濃度 NAA（10 mg/L）處理誘導下，除了 BKLC-7R 在 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組中無發根外，其餘皆有根生成現象，其中又以 BKLC-12R 之 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組發根率最高（100%）。濃度 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 的試驗中，BKLC-7R 及 12R 皆有 100%的發根率，BKLC-13L 則無發根現象。高濃度 BA（10 mg/L）搭配低濃度 NAA（0.1 及 0.01 mg/L）處理誘導下，三品系癒傷組織皆無任何根形成（表 3.8）。 22.

(31) 3.5 TDZ 對癒傷組織形態發生之影響 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響試驗中，其癒傷組織形態變化日前觀察僅只有轉綠以及部分根生成現象，仍未有任何明確芽體產生。此試驗將挑選由低濃度生長素（0.1 mg/L 2,4-D 或 NAA）所誘導之癒傷組織品系，包含 BKL-7L、BKL-7R、BKL-12L、BKL-12R、BKLC-2R、 BKLC-7R 及 BKLC-12R 共七品系，將上述癒傷組織以單獨使用細胞分裂素 TDZ 來誘導其形態發生，測試是否能誘導癒傷組織長出芽體的可能。 TDZ 誘導形態發生試驗第二週觀察顯示，除 BKLC-2R 品系外，其餘品系癒傷組織同樣因光照下開始行光合作用而有轉綠情形，第六週觀察顯示，部分癒傷組織開始有褐化現象，但部分褐化之癒傷組織仍有生成新癒傷組織的能力（圖 3.15－17）。BKL-7L 品系癒傷組織於不同濃度 TDZ 誘導下，其癒傷組織生長速度無顯著差異，第六週開始，除 1 mg/L 及 5 mg/L TDZ 之試驗外，其餘三組有部分褐化，另外，控制組有發根情形，其餘試驗組則仍無發根情形產生（圖 3.15 a）。BKL-7R 品系癒傷組織之轉綠情形較其餘品系癒傷組織不明顯，且癒傷組織生長速度及形態變化皆無明顯差異（圖 3.15 b）。BKL-12L 品系癒傷組織於控制組及 5 mg/L TDZ 試驗中，其生長速度較緩，且有明顯褐化現象，控制組於試驗第八週發現有根形成（圖 3.16 a）。相較於 BKL-12L 品系，BKL-12R 品系癒傷組織生長情形除控制組有部分褐化外，其餘試驗組生長皆較佳，但無明顯根生成現象（圖 3.16 b）。BKLC-2R 品系癒傷組織原形態為蓬鬆且半透明狀，此種癒傷組織形態發生能力不佳，故無轉綠現象也無明顯形態變化，僅維持原癒傷組織形態持續增長，但於控制組及 5 mg/L TDZ 試驗組中其癒傷組織生長較緩（圖 3.17 a）。BKLC-7R 品系癒傷組織之控制組 23.

(32) 發根情形最顯著，於試驗第二週即有根生成，且根生成現象快速，其餘試驗組無根生成現象（圖 3.17 b）。BKLC-12R 品系癒傷組織除控制組生長較緩外，其餘試驗組生長良好，無任何根生成現象（圖 3.17 c）。. 3.6 高氏柴胡癒傷組織細胞懸浮培養懸浮培養試驗試驗一為不含水晶洋菜之原癒傷組織繼代培養基，置於數位式迴轉振盪器中以 120 rpm 轉速培養。BKL-13R 品系癒傷組織進行為期十五週之懸浮培養，於培養第二週後觀察顯示其原置入之癒傷組織開始有褐化現象，第七週後褐化之癒傷組織周圍開始生成黃色小團塊之新癒傷組織，第十一週後癒傷組織顯得更為細散且有明顯增生之現象（圖 3.18）。BKL-8R 品系癒傷組織進行為期十週之懸浮培養，起初所置入之癒傷組織較 BKL-13R 品系鬆散，隨後其褐化現象情形也較少。於第六週觀察顯示其癒傷組織型態更為細緻鬆散（圖 3.19）。懸浮培養試驗二為使用 D2 培養基（20 ml），置於數位式迴轉振盪器中以轉速 80 rpm 進行為期八週的培養。試驗第四週後，兩品系癒傷組織皆有細小癒傷組織生成，而 BKL-13R 品系癒傷組織少部分由原本黃色變成黃綠色，BKL-8R 品系癒傷組織則是有部分褐化現象（圖 3.20）。將所有懸浮培養細胞收成之後測得乾重，並計算出懸浮培養增殖率（表 3.9）。表中為平均一個月之增殖數據，增殖數據顯示 BKL-13R 品系無論在試驗一或試驗二的條件培養下，其增殖數量都比 BKL-8R 品系來的高。另外，在繼代懸浮培養過程中，將更換培養液後之廢液於顯微鏡下觀察顯示，相較於原癒傷組織團塊，其懸浮培養可得到較散開之細胞團，甚至有單一細胞體的散出（圖 3.21）。 24.

(33) a. b. 圖 3.1 高氏柴胡種子萌芽情形。a.種子於兩週後發根（bar＝1.0 mm）。b. 播種後八週所發育之小苗（bar＝8.0 mm）。. 25.

(34) 表 3.1 高氏柴胡種子萌芽率 Sodium hypochlorite (%). Time (min). Germination percentage (%). 1.25. 20. 60 a. 1.25. 30. 36.36 abc. 1.25. 40. 18.18 bc. 1.67. 20. 50 ab. 1.67. 30. 33.33 abc. 1.67. 40. 0c. 2.5. 30. 30 abc. 2.5. 40. 0c. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~c 字母出現相同者表無顯著差異。. 26.

(35) 0. 0.1. 2,4-D (mg/L) 0.5. 1. 2. 0.1. 2,4-D (mg/L) 0.5. 1. 2. 1. TDZ (mg/L) 0.5. 0. a.. 0. 1. TDZ (mg/L) 0.5. 0. b.. 圖 3.2 2,4-D 及 TDZ 對高氏柴胡葉培植體癒傷組織誘導影響。a.四週之各試驗誘導情形（bar＝5.0 mm）。b.繼代兩次後穩定生長之癒傷組織（bar＝5.0 mm）。. 27.

(36) 0. 0.1. 2,4-D (mg/L) 0.5. 0. 0.1. 2,4-D (mg/L) 0.5. 1. 2. 1. 2. 1. TDZ (mg/L) 0.5. 0. a.. 1. TDZ (mg/L) 0.5. 0. b.. 圖 3.3 2,4-D 及 TDZ 對高氏柴胡根培植體癒傷組織誘導影響。a.四週之各試驗誘導情形（bar＝5.0 mm）。b.繼代兩次後穩定生長之癒傷組織（bar＝5.0 mm）。. 28.

(37) 表 3.2 2,4-D 及 TDZ 處理之高氏柴胡根、葉培植體癒傷組織誘導率 Test. Induction ratio of. Induction ratio of callus from root (%). 2,4-D (mg/L). TDZ (mg/L). callus from leaf (%). 0. 0. 0. e. 0. 0.1. 0. 0. e. 100. a. 0.5. 0. 0. e. 100. a. 1. 0. 0. e. 100. a. 2. 0. 0. e. 100. a. 0. 0.5. 66.67. 100. a. 0.1. 0.5. 100. 100. a. 0.5. 0.5. 75. 100. a. 1. 0.5. 100. a. 100. a. 2. 0.5. 100. a. 100. a. 0. 1. 33.33. 100. a. 0.1. 1. 100. a. 100. a. 0.5. 1. 100. a. 100. a. 1. 1. 100. a. 100. a. 2. 1. 100. a. 100. a. c. a. b. d. e. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~e 字母出現相同者表無顯著差異。. 29.

(38) 0. 0.1. NAA (mg/L) 0.5. 0. 0.1. NAA (mg/L) 0.5. 1. 2. 1. 2. 1. BA (mg/L) 0.5. 0. a.. 1. BA (mg/L) 0.5. 0. b.. 圖 3.4 NAA 及 BA 對高氏柴胡葉培植體癒傷組織誘導影響。a.四週之各試驗誘導情形（bar＝5 mm）。b.繼代兩次後穩定生長之癒傷組織（bar ＝5 mm）。. 30.

(39) 0. 0.1. NAA (mg/L) 0.5. 0. 0.1. NAA (mg/L) 0.5. 1. 2. 1. 2. 1. BA (mg/L) 0.5. 0. a.. 1. BA (mg/L) 0.5. 0. b.. 圖 3.5 NAA 及 BA 對高氏柴胡根培植體癒傷組織誘導影響。a.四週之各試驗誘導情形（bar＝5 mm）。b.繼代兩次後穩定生長之癒傷組織（箭頭處為根形成）（bar＝5 mm）。. 31.

(40) 表 3.3 NAA 及 BA 處理之高氏柴胡根、葉培植體癒傷組織誘導率 Test. Induction ratio of. Induction ratio of. callus from leaf (%). callus from root (%). NAA (mg/L). BA (mg/L). 0. 0. 0. g. 0. 0.1. 0. 0. g. 80. 0.5. 0. 0. g. 100. a. 1. 0. 0. g. 100. a. 2. 0. 60. d. 100. a. 0. 0.5. 20. f. 80. 0.1. 0.5. 40. e. 100. a. 0.5. 0.5. 80. b. 100. a. 1. 0.5. 80. b. 100. a. 2. 0.5. 100. 100. a. 0. 1. 40. 0.1. 1. 100. 0.5. 1. 80. 1. 1. 100. 2. 1. 100. a e a. g b. b. 75. c. 100. a. 100. a. a. 100. a. a. 100. a. b. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~g 字母出現相同者表無顯著差異。. 32.

(41) 表 3.4 2,4-D 及 TDZ 處理之高氏柴胡癒傷組織增殖率與形態 Treatments (mg/L) 2,4-D. TDZ. 0. 0. 0.1. 0. 0.5 1. Proliferation rate of callus Leaf. Root. 4.74. 0. Leaf. f. 0.4. 0. Callus morphology Root reddish-brown. bc. soft, granular yellowish-white. f. soft, compact reddish-brown. 0.66. soft, granular gray, necrotic. 2. 0. 0. 0.5. 0.1. 0.5. 1.04. 0.5. 0.5. 1. 1.58. def. b. 1.22. ef. 0.78. b. 3.4. 0.5. 1.46. b. 0.66. f. 2. 0.5. 0.62. b. 5.84. b. 0. 1. 0.1. 1. 1.46. b. 0.94. 0.5. 1. 2.44. a. 8.458. 1. 1. 0.7. 2. 1. 0.66. 2.98. b. b. 1.62. cd. yellow hard, compact yellow hard, compact yellow soft, granular reddish-brown soft, granular. yellow hard, compact yellow soft, granular whitish-yellow hard, compact. yellow hard, compact yellow hard, compact reddish-brown with yellow portion hard, granular reddish-brown with yellow portion hard, granular. reddish-brown with yellow portion hard, granular yellow hard, compact yellow hard, compact slightly yellow with brown portion hard, granular yellow with brown portion soft, granular. cde. f. a. def. 0.66. f. yellow hard, compact yellow hard, compact. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~f 字母出現相同者表無顯著差異。 33.

(42) 表 3.5 NAA 及 BA 處理之高氏柴胡癒傷組織增殖率與形態 Treatments (mg/L) NAA. BA. 0. 0. 0.1. 0. 0.5 1. Proliferation rate of callus Leaf. Root 2.3. 0. 5.16. a. soft, compact yellowish-white. 3.75. b. transparent with brown portion soft, granular. 2.04. de. yellow hard, compact reddish-brown soft, granular. 0. 0.36. 0 0.1. 0.5 0.5. 0.86. b. 0.5. 0.5. 0.5. b. 1.1. 1. 0.5. 1.3. b. 1.56. 2. 0.5. 0.3. b. 3.3. 0 0.1. 1 1. 0.5. b. 1.62. 2.44. 1. 1. 0.4. 2. 1. 0.46. a. b. b. yellowish-white soft, compact yellowish-white. 2. 1. Root. bcd. b. 0.5. Leaf. cde. 2.78. 0. Callus morphology. ef. ef. reddish-brown soft, granular reddish-brown with yellow portion hard, compact. bc. def. 0.76. reddish-brown with yellow portion hard, compact yellow hard, compact reddish-brown soft, compact reddish-brown hard, compact. f. 0.8. f. 0.44. f. soft, compact yellowish-white soft, compact. yellow hard, compact reddish-brown with yellow portion hard, compact yellowish-white soft, compact yellowish-white soft, compact. yellow hard, compact yellow hard, compact reddish-brown hard, compact yellowish-white soft, compact. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05)。各數據間 a~f 字母出現相同者表無顯著差異。 34.

(43) a. b. c. d. 圖 3.6 高氏柴胡癒傷組織形態與增生能力之關係。a.淡黃、黃色之結構緊密或鬆散的癒傷組織增生能力為最快速（bar＝5.0 mm）。b.淡黃白色或半透明狀之結構蓬鬆的癒傷組織增生能力快速（bar＝ 5.0 mm）。c.紅褐色之小團塊狀或顆粒狀的癒傷組織增生能力中等（bar＝5.0 mm）。d.灰白色之軟爛、水浸狀的癒傷組織增生能力緩慢甚至停止生長(bar＝2.5 mm)。. 35.

(44) 表 3.6 高氏柴胡癒傷組織品系名稱對照表 2,4-D. TDZ. (mg/L) (mg/L). Callus lines Leaf. NAA. BA. (mg/L) (mg/L). Root. 0. 0. 0. 0.1. 0. BKL-2R. 0.5. 0. BKL-3R. 1. 0. BKL-4R. 2. 0. 0. 0.5. 0.1. 0.5. 0.5. 0.1. Callus lines Leaf. Root. 0 0. BKLC-2R. 0.5. 0. BKLC-3R. 1. 0. BKLC-4R. 2. 0. BKL-6R. 0. 0.5. BKL-7L. BKL-7R. 0.1. 0.5. BKL-8L. BKL-8R. 1. 0.5. BKL-9L. 2. 0.5. 0. BKLC-5L. BKLC-5R. 0.5. BKLC-7L. BKLC-7R. 0.5. 0.5. BKLC-8L. BKLC-8R. BKL-9R. 1. 0.5. BKLC-9L. BKLC-9R. BKL-10L BKL-10R. 2. 0.5. BKLC-10L BKLC-10R. 1. BKL-11R. 0. 1. 0.1. 1. BKL-12L BKL-12R. 0.1. 1. BKLC-12L BKLC-12R. 0.5. 1. BKL-13L BKL-13R. 0.5. 1. BKLC-13L BKLC-13R. 1. 1. BKL-14L BKL-14R. 1. 1. BKLC-14L BKLC-14R. 2. 1. BKL-15L BKL-15R. 2. 1. BKLC-15L BKLC-15R. 36.

(45) C. 1. BA and NAA (mg/L) 2 3. 4. 5. 2W. 4W. Culture time. 6W. 8W. 10W. 12W. 14W. 16W. 圖 3.7 高氏柴胡 BKL-7L 品系癒傷組織形態發生。BKL-7L 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 37.

(46) C. 1. BA and NAA (mg/L) 2 3. 4. 5. 2W. 4W. Culture time. 6W. 8W. 10W. 12W. 14W. 16W. 圖 3.8 高氏柴胡 BKL-8R 品系癒傷組織形態發生。BKL-8R 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 38.

(47) C. 1. BA and NAA (mg/L) 2 3. 4. 5. 2W. 4W. Culture time. 6W. 8W. 10W. 12W. 14W. 16W. 圖 3.9 高氏柴胡 BKL-10R 品系癒傷組織形態發生。將 BKL-10R 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 39.

(48) C. 1. BA and NAA (mg/L) 2 3. 4. 5. 2W. 4W. Culture time. 6W. 8W. 10W. 12W. 14W. 16W. 圖 3.10 高氏柴胡 BKL-13L 品系癒傷組織形態發生。將 BKL-13L 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 40.

(49) C. 1. BA and NAA (mg/L) 2 3. 4. 5. 2W. 4W. Culture time. 6W. 8W. 10W. 12W. 14W. 16W. 圖 3.11 高氏柴胡 BKL-13R 品系癒傷組織形態發生。將 BKL-13R 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 41.

(50) C. BA and NAA (mg/L) 1 2 3. 4. 5. 2W 4W. Culture time. 6W 8W. 10W 12W 14W. 16W 18W 圖 3.12 高氏柴胡 BKLC-7R 品系癒傷組織形態發生。將 BKLC-7R 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生試驗，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 42.

(51) C. BA and NAA (mg/L) 1 2 3. 4. 5. 2W 4W. Culture time. 6W 8W. 10W 12W 14W. 16W 18W. 圖 3.13 高氏柴胡 BKLC-12R 品系癒傷組織形態發生。將 BKLC-12R 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 43.

(52) C. BA and NAA (mg/L) 1 2 3. 4. 5. 2W 4W. Culture time. 6W 8W. 10W 12W 14W. 16W 18W. 圖 3.14 高氏柴胡 BKLC-13L 品系癒傷組織形態發生。將 BKLC-13L 品系癒傷組織以不同濃度之 BA 與 NAA 進行形態發生誘導，於每兩週進行拍攝記錄。C, control (no plant growth regulator)；1, 0.01 mg/L BA 10 mg/L NAA；2, 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA；3, 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA；4, 10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA；5, 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA；W, week；Bar＝5.0 mm. 44.

(53) 表 3.7 BA 與 NAA 對高氏柴胡癒傷組織發根影響–BKL 品系 Callus lines. BKL-7L. BKL-8R. BKL-10R. BKL-13L. BKL-13R. Treatments BA (mg/L) NAA (mg/L) 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01. Root formation rate (%) 0d 0d 40 bcd 40 bcd 0d 0d 20 cd 40 bcd 0d 0d 0d 0d 80 ab 20 cd 20 cd 0d 0d 0d 60 abc 20 cd 100 a 40 bcd 0d 0d 80 ab 60 abc 0d 40 bcd 0d 0d. 試驗結果採鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~d 字母出現相同者表無顯著差異。. 45.

(54) 表 3.8 BA 與 NAA 對高氏柴胡癒傷組織發根影響–BKLC 品系 Callus lines. BKLC-7R. BKLC-12R. BKLC-13L. Treatments BA (mg/L) NAA (mg/L) 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01. Root formation rate (%) 60 abc 0d 60 abc 100 a 0d 0d 80 ab 60 abc 100 a 100 a 0d 0d 60 abc 40 bcd 60 abc 0d 0d 0d. 試驗結果採鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a~d 字母出現相同者表無顯著差異。. 46.

(55) a.. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W. b.. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W 圖 3.15 TDZ 對高氏柴胡 BKL-7 品系癒傷組織形態發生影響。a.BKL-7L 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。b.BKL-7R 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。(C, control (no plant growth regulator)；W, week；Bar＝5.0 mm.) 47.

(56) a.. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W. b.. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W 圖 3.16 TDZ 對高氏柴胡 BKL-12 品系癒傷組織形態發生影響。a.BKL-12L 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。b.BKL-12R 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。(C, control (no plant growth regulator)；W, week；Bar＝5.0 mm.) 48.

(57) a.. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W. b.. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W. 49.

(58) c.. C. TDZ (mg/L) 0.1 0.5. 1. 5. Culture time. 2W. 4W. 6W. 8W. 圖 3.17 TDZ 對高氏柴胡 BKLC 品系癒傷組織形態發生影響。a.BKLC-2R 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。b.BKLC-7R 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。c.BKLC-12R 品系癒傷組織，每兩週進行拍照紀錄。(C, control (no plant growth regulator)；W, week；Bar ＝5.0 mm.). 50.

(59) a. b. c. d. 圖 3.18 高氏柴胡 BKL-13R 品系癒傷組織懸浮培養試驗一。a.懸浮培養第二週，癒傷組織呈褐化現象（bar = 25.0 mm）。b.懸浮培養第七週，褐化之癒傷組織周圍開始生成黃色癒傷組織（bar＝10.0 mm）。c,d.懸浮培養第十一週，癒傷組織明顯增生（bar = 28.0 mm, c ; 13.0 mm, d）。. 51.

(60) a. b. c. d. 圖 3.19 高氏柴胡 BKL-8R 品系癒傷組織懸浮培養試驗一。a,b.懸浮培養第二天。c,d.懸浮培養第六週，癒傷組織明顯增生（bar = 21.5 mm, a and c ; 10.0 mm, b and d）。. 52.

(61) a. b. c. d. 圖 3.20 高氏柴胡癒傷組織懸浮培養試驗二。a.BKL-8R 品系癒傷組織，懸浮培養第一天。b.BKL-8R 品系癒傷組織，懸浮培養第四週有部分癒傷組織呈褐化且有生成細散狀之黃色癒傷組織。c.BKL-13R 品系癒傷組織，懸浮培養第一天。d.BKL-13R 品系癒傷組織，懸浮培養第四週部分癒傷組織呈黃綠色且有生成細散狀之黃色癒傷組織（bar = 10 mm, a and c ; 11.5 mm, b and d）。. 53.

(62) 表 3.9 高氏柴胡懸浮培養細胞之增殖率 Medium volume. Shaker speed. Proliferation rate. (ml). (rpm). (%). BKL-13R. 100. 120. 25.706. BKL-8R. 100. 120. 11.7. BKL-13R. 20. 80. 10.35. b. BKL-8R. 20. 80. 5.018. b. Callus lines a. b. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值差異分析（P＜0.05)。各數據間 a,b 字母出現相同者表無顯著差異。. 54.

(63) a. b. c. d. e. 圖 3.21 高氏柴胡癒傷組織及懸浮培養細胞(光學顯微鏡拍攝)。a.對照組， BKL-8R 品系癒傷組織之細胞（bar＝50 µm）。b,c.BKL-8R 品系之癒傷組織，懸浮培養之單一細胞散出（bar＝50 µm）。d,e.BKL-13R 品系之癒傷組織，懸浮培養之單一細胞散出（bar＝50 µm）。. 55.

(64) 第四章討論在天然環境中柴胡自身發芽的條件較嚴苛，導致發芽率低，種子萌芽喜好低溫且生長於日夜溫差大之環境，而高氏柴胡原本野生數量就少，加上市場需求以及人為摘採的影響，導致植株取得更加不易（劉, 2004），因此利用植物組織培養方式建立高氏柴胡再生體系是重要之課題。根據前人對於高氏柴胡的研究中顯示（表 1.1），大多是藉由芽體再生的方式進行高氏柴胡繁殖，尚無直接由癒傷組織進行形態發生之報導，故本試驗擬建立高氏柴胡癒傷組織誘導系統，再進一步地利用不同濃度之植物生長調節劑進行試管內形態發生之誘導，以得到更完整的高氏柴胡試管內誘導體系。另外，本試驗使用高氏柴胡種子所萌發之實生苗的根葉做為基礎培植體，進行癒傷組織誘導的過程中，發現從多細胞之植物器官進行誘導可得到許多不同形態的癒傷組織，而先前研究中對於高氏柴胡癒傷組織方面的分類並不詳細，藉此本試驗將所得到之各種不同形態的癒傷組織進行形態與其再生能力分析，以建立高氏柴胡試管內繁殖研究之基本資料。先前研究顯示，不同的消毒劑使用比較下，以次氯酸鈉消毒能力較佳，能有效控制感染且對培植體無任何不良影響（Badoni and Chauhan, 2010）。另外，研究指出次氯酸納與氯化汞兩消毒劑的比較使用下，次氯酸鈉更能刺激種子萌芽（Morla et al., 2011）。本試驗利用不同濃度之次氯酸納與不同的消毒時間下進行高氏柴胡種子消毒，結果顯示在長時間或高濃度次氯酸鈉的消毒情況條件下，皆不利於高氏柴胡種子萌芽，而短時間與低濃度次氯酸鈉使用下發芽情形較佳，其中以 1.25%次氯酸鈉消毒 20 分鐘的萌芽率最佳（60%）。 56.

(65) 2006年陳研究學者單獨使用0.5－4 mg/L 2,4-D的情況下均能在葉片切口處成功誘導出癒傷組織，其中以4 mg/L 2,4-D誘導癒傷組織的效果最佳（75%）（陳, 2006）。本試驗於誘導癒傷組織試驗中，葉培植體在單獨使用2,4-D、TDZ、NAA或BA的情況下很難誘導出癒傷組織。兩相比較下，可能葉片有切口更能刺激癒傷組織生成，而因本試驗使用一公分完整葉片，故可能降低了刺激癒傷組織生成的機率。相較於葉培植體，根培植體在不同濃度之植物生長調節劑添加下皆可誘導出癒傷組織，如圖3.3及3.5的結果除控制組外皆成功誘導出癒傷組織，顯示由根作為培植體，更能吸收培養基內所添加之植物生長調節劑並刺激癒傷組織生成。另外，同屬於繖形科之當歸（Angelica sinensis (Oliv) Diels）於1989年的研究顯示，其利用生長素搭配細胞分裂素進行癒傷組織誘導的結果比單用生長素的情形佳（Zhang and Cheng, 1989）；本試驗誘導癒傷組織結果顯示，相較於單獨使用生長素或細胞分裂素，同樣由生長素搭配細胞分裂素之試驗更容易誘導高氏柴胡之根、葉培植體生成癒傷組織，且癒傷組織持續生長情形較穩定，推測生長素與細胞分裂素的搭配使用有利於高氏柴胡癒傷組織誘導。影響癒傷組織生成與持續生長的因素很多，植物內生性所生成的植物性賀爾蒙即是影響原因之一。另外，培養基中所添加的植物生長調節劑與醣類、蛋白腖與洋菜濃度皆會影響癒傷組織形成之能力（陳, 2006）。陳研究學者於2006年研究顯示，3%蔗糖與0.9%洋菜（Difco Bacto-agar）的添加對於高氏柴胡癒傷組織的生長最為合適，而本試驗所使用的是3% 水晶洋菜（gelrite），許多研究指出水晶洋菜對於植物體再生與芽體增生（Goldfarb et al., 1991； Henderson, 1987； Van Ark et al., 1991； Welander 57.

(66) and Maheswaran, 1992）、體胚生成（De Wald et al., 1989；Yeh and Chyuan, 1992）與癒傷組織生長（Huang and Chi, 1988；Ichi et al., 1986）等方面的使用結果較一般洋菜效果佳。在誘導癒傷組織過程中，所使用的葉、根培植體為植物之成熟器官，其為多細胞體，導致誘導出的癒傷組織形態也有各種不同形態。觀察結果之下，依生成速度快慢可大致分為四大類，分別為觸感偏硬或鬆散之黃色癒傷組織、形態蓬鬆之淡黃白色或半透明狀的癒傷組織、小團塊狀或顆粒狀之紅褐色癒傷組織與軟爛、水浸狀之灰白色癒傷組織。1992年 Songstad 從玉米中誘導出兩種具有再生能力之癒傷組織，其中第一型具胚性癒傷組織，其結構緊密且所形成的體胚形態較為複雜，而第二型癒傷組織為結構鬆散，較適合作為懸浮細胞培養之選擇（Songstad et al., 1992）。2002年學者將稻米的癒傷組織進行分類，第一類為白色、霜狀且結構緊密之癒傷組織，其再生能力為最佳，而第二類黃色且有組織性之癒傷組織，其再生能力良好（Visarada et al., 2002）。因此，藉由文獻的整理，搭配各癒傷組織增殖率之結果，本試驗選擇生長快速且結構緊密或鬆散之黃色癒傷組織進行形態發生試驗。於形態發生試驗過程中，發根與芽體形成為主要觀察目的。2002年 Fraternale等學者利用灌木柴胡（B. fruticosum）進行微體繁殖研究，以莖節作為培植體，在全量MS培養基中添加1.5 mg/L BA與1 mg/L BA的情況下，其芽體增生效果最佳，而在無添加植物生長調節劑與濃度0.1、1及10 mg/L NAA誘導下，各組別皆會形成根且根形成率無顯著差異（Fraternale et al., 2002）。本試驗利用癒傷組織作為培植體進行形態發生誘導，在任何濃度之植物生長調節劑的搭配使用下，仍無芽體的生成，對其芽體生 58.

(67) 成誘導條件仍須調整。而在控制組與添加0.01、0.1及1 mg/L BA 搭配1、 10 mg/L NAA試驗組中有發根現象，且各品系發根率不一，其中以 BKLC-12R品系癒傷組織發根情形最多（不同誘導試驗組下共17個處理有發根）。高濃度BA（10 mg/L）搭配低濃度NAA（0.1、0.01 mg/L）處理誘導下，所有品系在所有試驗組中皆無發根情形。由不同濃度BA與NAA 所誘導之形態發生試驗中，僅觀察到轉綠與部分發之現象。另外單獨利用細胞分裂素TDZ進行形態發生誘導，其中BKLC-7R於兩週後即有發根現象，但各品系癒傷組織目前仍無芽體生成現象。最後，利用不添加水晶洋菜的懸浮培養基進行癒傷組織細胞懸浮培養，除了讓癒傷組織生長能更快速外，希望能藉此得到單一的細胞體，以利更仔細的觀測細胞進行形態發生之過程，未來也能針對單一細胞進行更多的研究，例如基因轉殖或多倍體誘導等。陳研究學者在 2006 年研究顯示，將高氏柴胡癒傷組織切碎培養於添加 0.2 mg/L 2,4-D 之 D2 培養基，以 80 rpm 轉速條件培養下細胞增殖速度較快，而細胞接種密度較高時，其所得鮮重與乾重也較高（陳, 2006）。本試驗之懸浮培養試驗分成兩組，試驗一將 BKL-8R 與 13R 兩品系癒傷組織挑取約 0.3 克於 100 毫升之培養液中進行懸浮培養，其培養基為不添加水晶洋菜之原繼代培養基，以 120 rpm 轉速進行培養。試驗二即參考 2006 年陳學者之研究結果，將 BKL-8R 與 13R 兩品系癒傷組織挑取約 0.5 克，使用 20 毫升之 D2 培養基，以 80 rpm 轉速進行細胞懸浮培養。結果顯示，無論在試驗一或試驗二的培養條件下，BKL-13R 的生長速度都比 BKL-8R 來的快速。因此，未來進行高氏柴胡細胞懸浮培養或基因轉殖等細胞層面之研究，即可選擇生長速度較佳且再生能力良好之 BKL-13R 品系癒傷組織進行試驗。 59.

(68) 第五章參考文獻孔建民、何一正、郭嘉信、陳省三、楊其曄、羅朝村、關政平。（2009）《新編生物技術概論》第六章-植物生物技術。華格那企業。臺中市。甘偉松。（1991）《藥用植物學》。國立中國醫藥研究所。臺北縣。田安然。（2003)《神農本草經義理探要》。知音出版社。臺北市。古源翎、石謙仁、何仲平、周學駿、林怡辰、林素玲、林愉瑄、柯逢年、梁世村、郭俊宏、郭瑩玉、陳仁威、陳月珠、陳芬、陳亮樺、黃曉菊、趙明煜、劉正格、鄭模池。（2006）《常用中草藥圖說精彙》（第二冊）。財團法人醫藥工業技術發展中心。臺北縣。林俊清、顏銘宏。（1999）高氏柴胡的資源開發與藥效評估。藥用植物之開發與利用研討會論文集。農試所編印。臺中。徐國鈞、王強、余伯陽、潘明繼。（1997）《抗腫瘤中草藥彩色圖譜》。福建科學技術出版社。福建省。凌一揆。（2004）《中藥學》。知音出版社。臺北市。許家言、劉新裕、蔡新聲。（1993）三島柴胡台農一號之組織培養。中華農業研究。42：245－252。陳威臣、葉茂生、蔡新聲。（2004）臺灣原生藥用植物─高氏柴胡腋芽培養之大量繁殖研究。中華農業研究。53：27－38。陳威臣。（2006）高氏柴胡組織培養大量繁殖體系建立及柴胡皂苷含量分析。國立中興大學農藝學研究所博士論文。黃秋蘭、郭能成。（1995）三島柴胡育種指標性狀之篩選與利用。臺灣地區藥用植物資源之開發與利用學術研討會專刊（杜金池、盧煌勝、劉新裕編）。pp. 69－84。臺灣省農業試驗所。臺中。 60.

(69) 黃上邦。（1997）《現代本草學》。莊松榮製藥廠有限公司。高雄市。邱德文、吳家榮、夏同珩。（2001）《本草綱目彩色藥圖》（上卷）。薪傳出版社。臺北市。傅世垣。（2003）《中醫大百科全書》。遠流出版事業股份有限公司。臺北市。蔡新聲。（1999）藥用植物之組織培養技術。藥用植物之開發與利用研討會論文集（林俊義、盧煌勝、劉新裕、陳忠川、張成國編）。pp.113 －124。台灣省農業試驗所。臺中。鄭武燦。（2000）《台灣植物圖鑑》（下冊）。茂昌圖書有限公司。臺北市。蔡新聲、李鎮宇、蕭翌柱、郭昭麟。（2003）臺灣珍稀藥用植物利用組織培養之繁殖技術。《中草藥產業技術與研發》（中草藥產業技術教學資訊中心主編）。pp. 278－294。教育部顧問室。劉新裕。（2004）柴胡之多樣化開發。農業試驗所技術服務。第 58 期。 pp. 10－12。劉新裕。（2006）柴胡之 GMP 栽培模式與品質評價。中醫藥年報。第 24 期第 5 冊 pp. 395－414。謝文全。（2004）《本草學》。文興出版事業有限公司。臺中市。顏正華。（1998）《中藥學》（上）。pp.103－106。知音出版社。臺北市。 Ark, H. F., Zaal, M.A.C.M., Creemers-Molenaar, J. and Valk, P. (1991) Improvement of the tissue culture response of seed-derived callus cultures of Poa pratensis L.: Effect of gelling agent and abscisic acid. Plant Cell Tissue Organ Cult. 27, 275－280. Bang, J.W., In, D.S., Chung, S.H. and Liu, J.R. (1999) Plant regeneration 61.

(70) from embryogenic cells-derived protoplasts of Bupleurum falcatum Plant Cell Tissue Organ Cult. 55, 151－154. Badoni, A. and Chauhan, J.S. (2010) In vitro sterilization protocol for micropropagation of Solanum tuberosum cv. ‘Kufri Himalini’. Academia Arena. 2, 24－27. Bermejo Benito, P., Abad Martinez, M.J., Silvan Sen, A.M., Sanz Gomez, A., Fernandez Matellano, L., Sanchez Contreras, S. and Diaz Lanza, A.M. (1998) In vivo and in vitro antiinflammatory activity of saikosaponins. Life Sci. 63, 1147－1156. Chang, W.C. and Hsing, Y.L. (1979) Suspension culture of root callus of Panax ginseng C. A. Mayer. Nat. Sci. 7, 147－155. Chang, W.C. and Hsing, Y.L. (1980) In vitro flowering of embryoids derived from mature root callus of ginseng (Panax ginseng). Nature 284, 341－342. Chen, J.C., Chang, N.W., Chung, J.G. and Chen, K.C. (2003) Abstract saikosaponin-A induces apoptotic mechanism in human breast DA-MB-231 and MCF-7 cancer cells. Am. J. Chin. Med. 31, 363－377. Chen, U.C., Hsia, C.N., Yeh, M.S., Agrawal, D.C. and Tsay, H.S. (2006) In vitro micropropagation and ex vitro acclimation of Bupleurum kaoi – an endangered medicinal plant native to Taiwan. In Vitro Cell Dev. Biol.－ Plant. 42, 128－133. Chen, Y.L., Lin, S.Z., Chang, J.Y., Cheng, Y.L., Tsai, N.M., Chen, S.P., Chang, W.L. and Harn, H.J. (2006) In vitro and in vivo studies of a novel potential anticancer agent of isochaihulactone on human lung cancer 62.

(71) A549 cells. Biochem. Pharmacol. 72, 308－319. Cheng, Y.L., Chang, W.L., Lee, S.C., Liu, Y.G., Lin, H.C., Chen, C.J., Yen, C.Y., Yu, D.S., Lin, S.Z. and Harn, H.J. (2003) Acetone extract of Bupleurum scorzonerifolium inhibits proliferation of A549 human lung cancer cells via inducing apoptosis and suppressing telomerase activity. Life Sci. 73, 2383－2394. Cheng, Y.L., Lee, S.C., Lin, S.Z., Chang, W.L., Chen, Y.L., Tsai, N.M., Liu, Y.C., Tzao, C., Yu, D.S. and Harn, H.J. (2005) Anti-proliferative activity of Bupleurum scrozonerifolium in A549 human lung cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Lett. 222, 183－193. Cheng, P.W., Ng, L.T., Chiang, L.C. and Lin, C.C. (2006) Antiviral effects of saikosaponins on human coronavirus 229E in vitro. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 612－616. Chiang, L.C., Ng, L.T., Liu, L.T., Shieh, D.E. and Lin, C.C. (2003) Cytotoxicity and anti-hepatitis B virus activities of saikosaponins from Bupleurum species. Planta Med. 69, 705－709. Chung, J.D., Chun, C.K. and Suh, J.H. (1983) Asymbiotic germination of seeds of Bletilla striata. II. Effect of sucrose and agar concentration and pH value on seedling growth. J. Kor. Soc. Hortic. Sci. 24, 243－248. Dang, S.S., Wang, B.F., Cheng, Y.A., Song, P., Liu, Z.G. and Li, Z.F. (2006) Free full text inhibitory effects of saikosaponin-d on CCl4-induced hepatic fibrogenesis in rats. World J. Gastroenterol. 13, 557－563. DeWald, S.G., Litz, R.E. and Moore, G.A. (1989) Optimizing somatic embryo 63.