切取八週的實生苗之根及葉作為培植體進行癒傷組織誘導。以基礎 培養基搭配不同濃度 2,4-D（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）及不同濃度 TDZ
（0、0.5 和 1 mg/L），或搭配不同濃度 NAA（0、0.1、0.5、1 和 2 mg/L）
及不同濃度 BA（0、0.5 和 1 mg/L），共三十組試驗。每一試驗組中種入 約一公分之根或一片葉，並進行三重複試驗。於黑暗環境下以溫度 22 ± 1℃培養。試驗四週後拍照紀錄生長情形，並於六週後進行繼代，繼代時 只取癒傷組織進行培養，隨後每隔六週進行繼代。
2.6 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗 高氏柴胡癒傷組織 增殖試驗 增殖試驗 增殖試驗
將各組試驗取得之癒傷組織，取約 0.1 克培養於原培養基中進行四週 之增殖試驗。每組各五重複。
增殖率（比值）＝四週後增殖鮮重（克）÷ 初始鮮重（克）
2.7 BA 與 與 與 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響
將穩定生長之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃 度之 NAA（0、0.01、0.1、1 和 10 mg/L）與不同濃度之 BA（0、0.01、
0.1、1 和 10 mg/L），共六組試驗。各試驗組中挑取約 3×3×3 mm3大小之 癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，並每八週 進行繼代。
2.8 TDZ 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響
挑選由單一生長素（2,4-D 或 NAA）從高氏柴胡根培植體或葉培植 體中所誘導之癒傷組織進行形態發生試驗。基礎培養基中搭配不同濃度 之 TDZ（0、0.1、0.5、1 及 5 mg/L），共五組試驗。各試驗組中取約 3×3×3
mm3大小之癒傷組織種入，進行五重複試驗。培養於 16 小時光照下溫度 為 24℃，8 小時黑暗下溫度為 22℃的環境。每隔兩週拍照記錄生長情形，
並每八週進行繼代。
2.9 高氏柴胡 高氏柴胡 高氏柴胡癒傷組織 高氏柴胡 癒傷組織 癒傷組織 癒傷組織細胞 細胞 細胞 細胞懸浮培養 懸浮培養 懸浮培養 懸浮培養
挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結構鬆散的癒傷組織，以不 添加水晶洋菜之原培養基進行液態懸浮培養。每組試驗含 100 ml 之液態 培養基，並挑取約 0.3 克之癒傷組織進行培養，以 120 rpm 轉速在數位式 迴轉振盪器（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔兩週進行繼 代，培養環境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。
另一懸浮培養試驗，同樣挑選 BKL-8R 與 BKL-13R 之穩定生長並結 構鬆散的癒傷組織，以含有全量 MS 鹽類含維他命，添加 30 g/L 蔗糖與 0.2 mg/L 2,4-D 之 D2 培養液進行培養，每組試驗含 20 ml 之液態培養基，
挑取約 0.5 克之癒傷組織進行培養，以 80 rpm 轉速在數位式迴轉振盪器
（TS-520D）中進行培養，每試驗各五重複，每隔三週進行繼代，培養環 境為 16 小時光照與溫度 25 ± 1℃。
挑取與試驗中相同鮮重之 BKL-8R 與 BKL-13R 品系癒傷組織（0.3 或 0.5 克），加以烘乾而求得乾重，並與試驗結束所得之乾重相減而求得 總增殖重量，隨後求得總增殖率。因各品系所進行試驗之時間不同，遂 另將每試驗所得總增殖率，求出平均一個月之增殖量以比較各試驗之增 殖差異進行比較。
總增殖率（比值）＝ 試驗總增殖乾重（克）÷ 初始乾重（克）
月平均增殖率 ＝ 總增殖率 ÷ 試驗月數
2.10 統計方式 統計方式 統計方式 統計方式
試 驗 結 果 利 用 COSTAT 統 計 分 析 軟 體 進 行 鄧 肯 氏 多 變 域 分 析
（Duncan’s Multiple Range Test），比較各處理組之間平均值的差異。取 P 值小於 0.05 之顯著水準下進行比較，以字母區分各組間之差異性，如兩 數據出現相同字母代表兩者無顯著性差異。
第三章 第三章 第三章
第三章 結果 結果 結果 結果
3.1 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗 高氏柴胡種子萌芽試驗
觀察高氏柴胡種子之萌芽，大多於兩週後即開始發根，八週後生長 為含四葉以上之小苗（圖 3.1）。萌芽試驗結果顯示，長時間（40 分鐘）
消毒之條件下，除了低濃度 1.25%之次氯酸鈉處理有萌芽（萌芽率 18.18%），其餘濃度處理下皆無萌芽。此外，在 20 及 30 分鐘之消毒條件 處理下，各濃度試驗皆有部分萌芽現象，其中以濃度 1.25%之次氯酸鈉 處理 20 分鐘的萌芽率最高（60%）（表 3.1）。
3.2 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導 高氏柴胡癒傷組織之誘導
試驗四週後初步觀察結果顯示，2,4-D 搭配 TDZ 的試驗組在葉培植 體處理組中，控制組及單一使用 2,4-D 的情況下無任何誘導反應發生，
且葉片開始呈現褐化，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產 生，隨後形成癒傷組織（圖 3.2 a）。經過兩次繼代後，葉培植體處理組之 控制組及單獨使用 2,4-D 情形下確認無法誘導出癒傷組織，而單獨使用 0.5 及 1 mg/L TDZ 試驗組所誘導出的透明晶狀物則無法持續生長為癒傷 組織。其餘試驗組中，包含濃度 0.1、0.5、1 及 2 mg/L 2,4-D 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L TDZ 共八組試驗可得到持續生長之癒傷組織（圖 3.2 b）。根培 植體處理組中，試驗四週後初步觀察結果顯示，除控制組外共十四組試 驗組中，根培植體周圍皆可見透明晶狀物產生，並於兩次繼代後其透明 晶狀物可持續生長成為癒傷組織（圖 3.3）。癒傷組織誘導率結果顯示，
葉培植體於控制組及單獨使用 2,4-D 誘導之下無任何癒傷組織形成，而 搭配 TDZ 用後則能成功誘導癒傷組織形成。然而，單獨使用 TDZ 誘導
之下其誘導比率較低。根培植體方面則是除了控制組外皆能成功誘導癒 傷組織形成（表 3.2）。
NAA 搭配 BA 的試驗組中，四週後初步誘導觀察顯示，葉培植體處 理之控制組及單一使用濃度 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 的情況下無任何誘導 反應發生，其餘試驗組則可在葉緣處發現有透明晶狀物的產生，隨後形 成癒傷組織（圖 3.4 a）。但單獨使用 BA 之試驗組在一開始所產生的癒傷 組織甚少，且繼代結果顯示單獨使用 BA 的試驗組所誘導之癒傷組織無 法持續生長。經過兩次繼代後，葉培植體處理組在濃度 2 mg/L NAA 試驗 組及 0.1、0.5、1 及 2 mg/L NAA 搭配濃度 0.5 及 1 mg/L BA 試驗組中可 得到共九組持續生長之癒傷組織（圖 3.4 b）。根培植體處理組中，試驗四 週後初步觀察顯示，除了控制組外各試驗組皆有透明晶狀物產生（圖 3.5 a）。兩次繼代後，單獨使用 1 mg/L BA 之試驗組所得到之癒傷組織無法 持續生長外，其餘試驗組共十三組皆可持續生長（圖 3.5 b）。癒傷組織誘 導率結果顯示，葉培植體於控制組及單獨使用 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 誘導之下無任何癒傷組織形成，其餘試驗組皆能成功誘導出癒傷組織，
其中以 2 mg/L NAA 及單獨使用 BA 誘導之下其誘導比率較低。根培植體 同樣除了控制組外皆能成功誘導癒傷組織形成（表 3.3）。
癒傷組織誘導試驗顯示，癒傷組織於持續繼代過程中，以 NAA 搭配 BA 試驗組所誘導之癒傷組織即有根生成現象（圖 3.5 箭頭標示處），而 2,4-D 搭配 TDZ 試驗組中則無此現象。
3.3 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗 高氏柴胡癒傷組織增殖試驗
癒傷組織誘導試驗過程中，因培植體為多細胞之成熟器官（根、葉），
導致誘導出各癒傷組織形態有所差異且生長速度也不盡相同，故將進行 增殖試驗以區分各癒傷組織之生長速度快慢。增殖試驗結果顯示，以 2,4-D 與 TDZ 所誘導的癒傷組織而言，根培植體中以 0.5 mg/L 2,4-D + 1 mg/L TDZ 所誘導之癒傷組織增殖比率最高（8.458 倍），其癒傷組織顏色 為黃色、觸感偏硬且結構緊密，次高者為由根培植體中以 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 誘導之淡黃色、觸感偏硬且結構緊密的癒傷組織（5.84 倍）
以及 0.5 mg/L 2,4-D 所誘導之淡黃偏透白、觸感柔軟蓬鬆且結構緊密的 癒傷組織（4.74 倍）（表 3.4）。NAA 與 BA 所誘導的癒傷組織中，由根 培植體中所誘導出的淡黃偏透白之觸感較鬆散的癒傷組織增殖速度較 快，其中又以 1 mg/L NAA 所誘導出的根癒傷組織增殖比例最高（5.16 倍），以 2 mg/L NAA 所誘導之癒傷組織次之（3.3 倍）（表 3.5）。
增殖試驗結果顯示出癒傷組織形態與增殖能力彼此間有一定之相關 性，以外觀及生長速率可大致將癒傷組織分成四類。首先以觸感偏硬或 鬆散之黃色癒傷組織生長，其生長速率為最快速（例如：0.5 mg/L 2,4-D + 1 mg/L TDZ-8.458 倍、2 mg/L 2,4-D + 0.5 TDZ-5.84 倍、0.5 mg/L NAA + 1 mg/L BA-2.44 倍等）；形態蓬鬆之淡黃白色或半透明狀的癒傷組織之生長 速率次之（例如：1 mg/L NAA-5.16 倍、0.5 mg/L 2,4-D-4.74 倍、2 mg/L NAA-3.75 倍等）；結構為小團塊狀或顆粒狀之紅褐色癒傷組織生長速率 稍慢；形態軟爛、水浸狀之灰白色癒傷組織之生長速率最為緩慢甚至無 增生之現象（例如：2 mg/L 2,4-D 此組因癒傷組織量甚少故無法進行增殖 試驗）（圖 3.6）。
3.4 BA 與 與 與 NAA 對癒傷組織形態發生之影響 與 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響 對癒傷組織形態發生之影響
先前研究顯示，結構緊密或鬆散之黃色、霜白色癒傷組織之再生能 力較好（Khanna et al., 2006；Songstad et al., 1992；Visarada et al., 2002）。
因此，本試驗將依照增殖試驗結果，挑選出生長情形佳且呈黃色或淡黃 色之結構緊密的癒傷組織，進行形態發生試驗。共挑取 2,4-D 與 TDZ 所 誘導之五品系癒傷組織（BKL-7L、BKL-8R、BKL-10R、BKL-13L 及 BKL-13R，癒傷組織品系名稱之試驗組別參照表 3.6）以及 NAA 與 BA 所誘導之三品系癒傷組織（BKLC-7R、BKLC-12R、BKLC-13L，癒傷組 織品系名稱之試驗組別參照表 3.6）。
形態發生試驗兩週後觀察顯示，所有試驗組在移置 16 小時光照下處 理後癒傷組織因照光開始行光合作用，由原本的淡黃色或黃色開始轉變 為綠色，且大多癒傷組織轉換至形態發生培養基後，仍有持續增生之情 形，部分癒傷組織會由團塊狀逐漸轉變成為小球狀。而這些小球狀組織 大多進一步形成根器官。所有八品系癒傷組織進行形態發生試驗過程 中，當培養至第八週會癒傷組織開始有轉白之現象，而待繼代更換新培 養基後即會再次漸漸綠化，推測繼代時間應以六至八週為佳。
BKL-7L 品系以 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA、10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度較快且 生長情形較佳，而控制組、0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組生長較慢。十二週後癒傷組織雖有明顯褐化情形，
但部分仍有持續生長與變化（圖 3.7）。
BKL-8R 品系以 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織生長速度為
快，又以後兩者生長情形為佳，10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 試驗組之癒 傷組織生長速度次之，而控制組及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 試驗組 之癒傷組織生長速度生長較慢，此情形與 BKL-7L 品系癒傷組織不同。
控制組於第八週觀察有發根之情形，除了控制組及 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 試驗組之癒傷組織有較多褐化現象外，其餘試驗組皆僅轉綠而 無發根現象（圖 3.8）。
BKL-10R 品系相對於前兩品系而言其控制組生長狀況良好，無褐化 情形，且於第六週開始有根生成現象。0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1
BKL-10R 品系相對於前兩品系而言其控制組生長狀況良好，無褐化 情形，且於第六週開始有根生成現象。0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1