鳳尾蕨屬假脈之研究可回溯至 Holttum (1954) 於馬來亞植物誌中描述翅柄鳳 尾蕨 (Pteris grevilleana) 之假脈為上下表皮上凸起之短線 (short raised lines)。而 Shieh (1966) 在臺灣、日本、琉球鳳尾蕨屬植物摘要 (synopsis) 中以該特徵作為二 型鳳尾蕨亞節 (Subsect. Cadierii) 之分類特徵，此特徵於臺灣植物誌 (Flora of Taiwan) 一版及二版 (Shieh, 1975, 1994) 以及臺灣維管束植物簡誌 (Kuo, 1991) 中被沿用並略有修改。Wagner (1978) 則以此作為二型鳳尾蕨複合群中判斷雜交親 本之依據，也確認鳳尾蕨屬的假脈是由厚壁的表皮異形細胞所構成，而該類細胞 並不存在於葉肉 (mesophyll) 之中；且提出在 Shieh (1966) 的分類系統中歸類為
「假脈少數」的類群之假脈會集中分布在葉脈附近，並推測該構造的起源可能與 葉脈有所關聯。同時 Wagner 也回顧了其他類群的假脈，並提出以脈狀異形細胞 (venuloid idioblasts) 作為蕨類假脈的總稱。而其中鳳尾蕨屬的假脈為表皮異形細胞 (epidermal idioblasts) 所構成，該細胞在形態上類似於鐵線蕨屬 (Adiantum) 以及書 帶蕨科 (Vittariaceae) 之矽異形細胞 (spicular cells, 字首 spicules 為針狀之意，過 往之研究認為該細胞內含矽酸體，日文漢字為「硅異形細胞」，故本文譯為矽異 形細胞)。Wagner 依據當時的分類系統認為該構造並非同源的構造，不過表皮異 形細胞的想法被 Tryon 等 (1990) 的系統所收錄，而其後被應用在鳳尾蕨科其他 類群假脈的描述上 (Gracano et al., 2001; Mickel and Smith, 2004; Sundue and Pardo, 2005)。
書帶蕨類群矽異形細胞之研究可追溯至 Poirault (1983) 的觀察，而 Williams (1927) 則對書帶蕨科中各類群的該構造做了觀察、整理及繪圖。Williams 將該構 造定義為長形且內含有矽石 (silica) 之表皮細胞，且該特徵可見於書帶蕨科各個類 群之中，被認為是該科的鑑定特徵。不過在 Poirault (1983) 即已發現廣義一條線 蕨 屬 (Monogramma) 中 的 Pleurogramma 節 的 兩 個 物 種 不 具 有 該 構 造 ， 而 Benedict (1911) 則建議將之與 Eumonogramma 分為兩個屬，但該爭議在 Williams (1927) 以及 Ogura (1972) 的文章中僅分別在內文以及文章最末曾經提及此事，而 此後矽異形細胞多被視為該科之科特徵而無更深入之探討。另一方面，Poirault (1983)、Williams (1927)、以及 Bower (1963) 等人皆曾經提及與矽異形細胞相似的 細胞亦可見於鐵線蕨屬中，而 Williams 的個人觀察中認為這兩者非常相近。但
(thick wall epidermal cells)，該細胞是一種不具葉綠素且幾乎沒有細胞腔 (cell Adiantum macrophyllum 一種中而已，該種的矽異形細胞可出現在非葉脈上的表皮 細胞。但在 Komatsu 等 (1996) 的藥學研究中則確認了該類細胞中含有大量的矽 (Holttum, 1974) 與 Hemionitis 屬 (Gracano et al., 2001) 在過去的報導中是不具有 矽異形細胞的。
由以上的研究中可知，鳳尾蕨科的假脈是由特化的表皮細胞所組成，而於過 去的研究中曾經出現許多不同的名詞用以描述不同類群假脈之組成單位，包含了 脈狀異形細胞 (venuloid idioblasts)、表皮異形細胞 (epidermal idioblasts)、厚壁表 皮細胞 (thick wall epidermal cells) 以及矽異形細胞 (spicular cells)；雖然這些名詞 之間的定義上有些許不同，然而於本實驗中確認了上述各類特化的表皮細胞均具
第五節 研究方向與與研究目的
本論文主要分為兩個部份，第一部份試圖釐清鳳尾蕨科內假脈以及矽異形細 胞之間的關係，因此利用常用的解剖學 (anatomy) 及顯微鏡技術 (microscopy) 觀 察鳳尾蕨屬之假脈，並且利用能量色散 X 射線光譜儀 (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer, EDX)、濕式灰化法 (wet oxidation) 以及組織化學染色 (histochemical staining) 確認表皮二氧化矽之分佈與形態。第二部份則希望能知道在鳳尾蕨科內 哪些分類群具有矽異形細胞，並希望藉由各分類群之間的親緣關係，由矽異形細 胞的形態演化推斷其起源與功能，因此，本研究利用桌上型掃瞄式電子顯微鏡 (tabletop SEM) 配合背向散射電子影像 (backscattered electron image, BEI) 廣泛檢 視鳳尾蕨科各分類群葉面二氧化矽堆積形式以及矽異形細胞之分布，並將之與各 分類群的一般表皮細胞與脈上表皮細胞形態進行比較。
貳、材料與方法
複葉之物種則選取基部羽片 (pinna) 中段之組織或者小羽片 (pinnules)，分別進行 直接觀察 (亦用於桌上型 SEM 觀察)、FPGA 固定 (用於埋蠟切片)、Karnovsky’s 固定液固定 (用於 SEM 或者埋膠切片) 以及透明法 (clearing technique) 處理。
(二) 實驗方法
(1) 光學顯微鏡直接觀察：
採回之新鮮材料或者烘乾後的標本利用解剖顯微鏡 (Stereomicroscope) 或者 複式光學顯微鏡 (Compound optical microscope) 直接進行觀察。
(2) 表皮印模法 (epidermis impression)：
利用 Hilu and Randoll (1984) 所發表的表皮印模法，以指甲油塗抹於葉片表面 取得印模後以光學顯微鏡進行觀察。
(3) 透明法 (clearing method)
70% 酒精中存放。
(4) 埋蠟切片 (paraffin section)
將所取得的材料分割為面積約 5 x 5 mm2 的小塊，置於 FPGA 固定液 (formalin: propionic acid: glycerol: 95% EtOH: distilled water = 1:1:3:7:8) 固定、抽氣 至材料下沉並置於 4°C 冰箱中儲存。需要觀察時則利用酒精－第三丁醇序列 (ethanol – tert-Butyl alcohol series) 於室溫下脫水一天，並置於純第三丁醇中隔夜；
於60°C 烘箱中滲蠟 (paraffin infiltration) 一天後埋蠟 (embedding)，並將蠟塊保存 於 4°C 冰箱中。切片時利用 AO 820 轉動式切片機 (rotary microtome) 進行切 片，橫切面 (cross section) 以一片 10 μm 之厚度切片，平行側脈 (paraveinal) 的 縱切面則一片 20 μm。同一批的切片部份以 Stay-on (Surgipath) 黏著於載玻片 上，並且利用二甲苯 (Xylene) 脫臘以進行 Fast Green – Safranin O 雙重染色 (double stain) 或者組織化學染色 (histochemical staining)；部分的切片則保存於暗 櫃中備用。
本實驗中利用濕式灰化法 (wet oxidation) 萃取蕨類葉片中的矽酸體，實驗方 法主要是綜合 Wang and Liu (1993)、Parr 等 (2001) 及 Piperno (2006) 等三者的實
有矽酸體後，可利用 10 μm 之篩網配合超音波震盪濾除多數之小雜質；而利用 250 μm 之濾網則可取得乾淨且完整之長條形矽酸體。
(6) 組織化學染色 (histochemical staining)
為確認濕式灰化法所取得沉澱物之成分，將沉澱物滴在載玻片上風乾後分別 以 SAC (Silver-Ammine Chromate)、CVL (Crystal Violet Lactone) 以及 MR (Methyl Red) 染色，這三種染劑為對矽醇基 (silanol group, SiOH) 具有專一性的染劑 (Dayanandan et al., 1983)。其中 SAC 為配製於 3% NH4OH 內之 Ag2CrO4 飽和溶 液，每次使用前再重新過濾；CVL 為配在苯 (Benzene) 中的 0.1% crystal violet lactone，但在之後的實驗中則改配在毒性較低的二甲苯 (xylene) 中，其專一性 (specificity) 以及靈敏度 (sensitivity) 則分別以 Adiantum macrophyllum 經透明法 處理之葉片以及萃取出之矽酸體作測試，其結果與配在苯中相仿；MR 則為配在 苯 (Benzene) 中的飽和 methyl red。
(7) 光學顯微鏡技術 (optical microscopy)
需要以光學顯微鏡觀察的材料，利用 Leica 的 LEITZ DMRB 光學顯微鏡及 其裝備的暗視野 (dark field)、相位差 (phase contrast)、偏光 (polarization) 及半偏 光 (semi-polarization) 等功能進行觀察，並且以 Nikon 的 COOLPIX 4500 或者 D3 數位相機進行拍照。而相位差干涉映襯法 (Differential Interferential Contrast, DIC) 則於 Nikon OPTIPHOT-2 顯微鏡下進行觀察，並以 Nikon 的 COOLPIX 4500 數位相機進行拍照。
(8) 掃瞄式電子顯微鏡技術 (Scanning electron microscopy, SEM)
本實驗中利用 SEM 偵測三種不一樣的訊號：二次電子 (secondary electron)、
背向散射電子 (backscattered electron) 以及特徵 X 射線 (characteristic X ray)。其
定 液 ( 配 製 在 0.05 M ， pH 6.8 之 磷 酸 緩 衝 液 (phosphate buffer) 中 的 1%
formaldehyde，2% glutaraldehyde 及 1% caffeine 混合液) (Karnovsky et al., 1965;
Makgomol and Sheffield, 2001) 中固定及抽氣。材料經隔夜之固定後，利用酒精序 列脫水至 70% 酒精，再改以丙酮 (acetone) 脫水至純丙酮，並以 Hitachi HCP-2 利用液態二氧化碳 (liquid carbon dioxide) 進行臨界點乾燥 (critical point drying, CPD)。乾燥後之材料以碳膠帶 (carbon tape) 黏附於碳台上 (carbon stage)，並以 EMI 之 K950X 進行鍍碳，鍍碳後之材料以 Hitachi 之 S-2400 掃描式電子顯微鏡 進行觀察或者FEI 的場發射掃描式電子顯微鏡 (Field-Emission SEM, FE-SEM)。再 選取同時具有矽異形細胞以及普通表皮細胞之位置拍攝二次電子影像作為對照 後，改以KEVEX LEVEL4 能量色散 X 光光譜儀 (Energy Dispersive X-ray, EDX) 為 接收器接收特徵 X 射線進行元素分析，並以僅擷取元素矽 (Silicon) Kα 能階 (energy level) 之方式進行拍照 (Si mapping)。EDX 元素分析的結果，則以單點單 位時間內所擷取到各種元素信號的相對數量表示。兩點之間的元素成分比較在 S-2400 是以矽 (Si)、磷 (P)、鈉 (Na)、鈣 (Ca) 的相對比例進行分析，在 FE-SEM 則是直接利用電腦程式進行計算並繪製成圖表。
第三節、鳳尾蕨科內矽異形細胞之調查
(一) 實驗材料與取樣方法
本節之實驗材料以台灣產之鳳尾蕨科植物為主。鳳尾蕨科為一泛世界分布的 科，且具有相當高的生態棲位 (ecological niches) 多樣性。而台灣地處亞熱帶地 區，位於多個植物地理區之交界，並且具有相當高之生態棲位多樣性，提供鳳尾 蕨科內無論是水生 (aquatic)、陸生 (terrestrial)、附生 (epiphytic)、岩生 (rupestral) 甚至生長於石灰岩 (limestone) 環境的種類居住，因此在台灣鳳尾蕨科的屬以及種 veins or free veinlets) 上之表皮細胞與一般表皮細胞之形態及是否有明顯分化。而 每觀察葉片必須同時包含上表皮與下表皮狀態之觀察。
散射電子訊號之強度會因所觀察材料平均原子量 (average atom mass) 大小而有強 弱之別 (Bazzola and Russell, 1992)，因此適用於偵測矽酸體是否堆積於特定細胞中 或者特定位置上 (Figure 2)。該方法在禾本科表皮矽酸體 (silica body) 觀察中曾被 建議使用 (Brandenburg et al., 1985)，並發現該法可獲得高對比 (high contrast) 且 邊緣銳利 (sharp) 之矽酸體影像；(3) 真空度較低 (low vacuum)，方便新鮮生物材 料之觀察，因此可免去大部分化學固定 (chemical fixation)、脫水 (dehydration)、
乾燥 (drying)、鍍膜 (coating) 之過程，縮短樣品製備之流程且減少表面特徵之損 失。不過由於新鮮植物材料在 SEM 觀察時容易累積電荷 (charging)，因此在本實 驗中另外引入了本校理學院電子顯微鏡室湯志遠先生開發之後冷卻技術 (post cooling method) (Tong et al., 2009) 配合觀察。該方法利用預冷式電子顯微鏡樣品台 (Pre-cryogenic electron microscope specimen holder; Tong, patent pending) 冷卻樣本 以達到冷凍固定之效果 (Figure 3)。
少數表皮角質蠟層 (epicuticular wax) 太厚，如部份書帶蕨類群 (Vittarioids) 之物種，在觀察前會以氯仿 (chloroform) 或二甲苯 (xylene) 進行短暫處理；葉遠 軸面具有蠟質之物種，如部份粉背蕨屬 (Aleuritopteris) 植物則經正常酒精序列後 中普遍適合於觀察鳳尾蕨科表皮矽異形細胞 (spicular cell) 分佈以及單一異形細 胞整體形態之倍率。
在本實驗中所觀察的多數鳳尾蕨科植物表皮若有明顯亮帶，且明顯與本章第
部 分 物 種 葉 表 會 出 現 未 曾 觀 察 過 之 亮 帶 形 式 ， 此 時 會 利 用 該 材 料 先 固 定 於 Karnovsky’s 固定液之材料或者直接取下正在觀察之材料經正常 SEM 處理之流 程進行 EDX 元素分析；或者當剩餘新鮮材料或標本數量足夠時，會以溼式灰化 法 (wet oxidation) 溶解葉片組織，並利用 CVL 染色法確認是否有矽酸體產生 (詳見本章第二節)。部份材料非矽異形細胞之葉表皮細胞形態不易使用掃描式電子 顯微鏡確認，在無法快速測試出合適的條件下則以預先備份之透明法材料輔助判 斷。
本研究之研究結果在軟體Mesquite Version 2.6. (Maddison and Maddison, 2009) 中，套用Schuettpelz et al. (2007) 利用六十七種鳳尾蕨科植物之 rbcL、atpB 以及 atpA 三段質體基因所建構之親緣關係樹，利用最大減約法則重建特徵演化歷史，
將各分類特徵則視為無次序性 (unordered) 的。
Table 5. Number of species sampled in each taxa in this study
Clade / Genus (Genera) / Species sampled (Genera) / Species in the worldaTaiwan (Genera) / Species sampled (Genera) / Species in Taiwanb
Cryptogrammoids (CR clade) 珠蕨支 2 / 5 3 / 23 2 / 5 2 / 6
Aleuritopteris Fée 粉背蕨屬
Cheilanthes Swartz 碎米蕨屬 6
Cheilanthes viridis (Forssk.) Prantl -
9 Mildella Trevisan 擬旱蕨屬
8 150
a Sensu Kramer’s (1990b) classification system. b Mainly Sensu Huang’s (2003) classification system. c The species number is the sum of Gymnopteris and Paragymnopteris (genus Paraceterach in Kramer’s (1990b) system, but excluding the species Parahemionitis arifolia). d The species number is comprised of genus Hemionitis and species Parahemionitis arifolia. e The species number is the sum of Monogramma and Vaginularia
Figure 2. Schema of theoretical bases of detecting spicular cells with backscattered electron image (BEI). (A) Backscattered electrons (BSE) are high-energy electrons which were reflected from specimen through elastic scattering interactions with specimen atoms. Specimen with higher average atim number (Z number) reflects more electrons than specimen with low Z number. The detector receives more BSE signals when observing a higher Z number material, as a result, shows a brighter backscattered electron image (BEI). (B) BEI of leaf epidermis of P.
grevilleana. The brighter region (pointed by white arrow) is an interveinal spicular cell, which was confirmed to have mass silica deposit in this study.
叁、結果
叁、結果