鹼性磷酸酶活性分析(ALP activity assay)

ALP 因屬於早期出現的生化指標，常被用來檢測藥物對骨生成分化作用的 能力。其測量原理為 ALP 在體外於 pH = 8～10 的環境下，能水解單酯磷酸

（monoester phosphate），故加入單酯磷酸受質 ρ-Nitrophenylphosphate， ALP 會將其轉換為 phosphate 與 ρ-Nitrophenyl，並於 405 nm 有最大吸光值，其吸

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所使用的濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml。將 Bio-Red Protein Assay 以 200μl/well 的量添加到 96 wells plate 中， 7 個濃度標準液和震盪結束後的 各樣品溶液各取 10μl，於 96 wells plate 中的 Bio-Red Protein Assay 充分混合。

在波長 595 nm 下測量其吸光值，利用標準曲線計算出樣品蛋白質含量，即可定 量蛋白質。

（3） ρ-Nitrophenylphosphate（PNPP）溶液與標準液配置

取 2-amino-2-methyl-1-propanol（AMP） 0.5 ml 和 40 mM 的 MgCl2 0.5 ml 與逆滲透（RO）水配置成 10ml，pH=10 的 AMP 溶液。再將 AMP 溶液與 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate 粉末配置成 9 mM 之 PNPP 溶液（此配置過程需在避光環境下）。標準液使用 0.02 N 的 NaOH 溶液與 p-Nitrophenol standard solution 以連續稀釋的方式，配置成 7.8125～250 μM 不 同濃度的 PNPP 標準液（此配置過程需在避光環境下）。

（4） ALP activity assay

以下過程需在避光環境中。在每個樣品中各添加 100μl 的 PNPP 溶液，

同時將不同濃度的 p-Nitrophenyl standard solution，各取 190μl 至乾淨的 well 中，以鋁箔紙包覆，再以迴轉式恆溫振盪器於室溫下震盪 30 分鐘。偵測波長 405 nm 吸光值。利用標準曲線計算出樣品 PNPP 含量，即可計算每小時每 mg

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protein 中所含有的 PNPP 濃度（μM PNPP/hr/mg protein），濃度值越大表示 ALP 活性越高。

五、 OPN、OPG 及 RANKL 的含量測定

此詴驗所使用的培養液（culture medium）是收集自 ALP activity assay 各實 驗組的上清液，並利用市售 ELISA Kit 作分析。依循 protocol 的步驟，將 standard 和培養液樣本分別與 assay diluent 添加到 kit 組內的 microplate，輕微搖晃均勻，

於室溫下反應 2 小時後，以 wash buffer 清洗，移除所有液體後，加入 conjugate buffer 於室溫下反應 2 小時，同樣以 wash buffer 清洗並移除所有液體後，加入 substrate solution 於室溫下反應 30 分鐘（此反應過程需在避光環境下進行），隨後 添加 stop solution 中止其反應後，偵測波長 450 nm 吸光值。利用 standard 計算出

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（1） 細胞培養處理

將 MC3T3-E1 細胞培養在 24 wells plate 中，細胞數為 1×10⁴ cells/well，於 恆溫培養箱中培養六天，每 3 天更換一次新鮮的培養液。六天後，移除 well 中 的培養液，重新置入含有 5% FBS、50μg/ml ascorbic acid 和 10 mM β

-glycerophosphate 的α-MEM 與不同濃度的藥物，於恆溫培養箱中培養 14 天，

每 3 天更換細胞培養液和添加藥物。

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Na-deoxycholate、1 mM EDTA 於 100 ml RO 水的 radioimmunoprecipitation

（RIPA）buffer。接著再將 1 mM NaF 5μl、1mM Na3VO4 5μl、1μg/ml Aprotinnin 1μl、1μg/ml Leupeptin 1μl、1μg/ml Pepstain 1μl、1 mM PMSF 5μl 與 RIPA buffer 互相混合配置成 1ml 的 total protein lysis buffer。

（三） Total protein 的萃取

蛋白質萃取的所有步驟都需在冰上處理。將結束藥物處理的培養皿，抽去

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（2） Cytosol and Nuclear protein 的萃取

（一） 細胞培養處理

同 total protein 的處理方式。

（二） Cytosol and Nuclear protein lysis buffer 配置 1. Cytosol protein lysis buffer：

10 mM NaH2PO4 10μl

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1 μg/ml Aprotinin 1μl 1 % NP-40 100μl 與 RO 水互相混合成 1 ml。

2. Nuclear protein lysis buffer：

10 mM NaH2PO4 10μl

（三） Cytosol and Nuclear protein 的萃取

蛋白質萃取的所有步驟都需在冰上處理。已結束處理的培養皿，抽去培養 液，以 PBS 清洗兩次，加入適量的 cytosol protein lysis buffer 使其均勻分布於培 養皿表面。使用橡膞刮刀刮下細胞，連同 lysis buffer 吸至離心管，反應 40 分鐘，

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以超音波打碎機（0.5 cycles，60% amplitude）作用 1 分鐘。以 9500 rpm，4℃，

10 分鐘的條件離心，上清液即為 cytosol protein 的萃取液，收集並儲存於 -80℃

冰箱備用。離心管剩餘的 pellet 在加入適量的 nuclear protein lysis buffer 反應 40 分鐘，同時以超音波打碎機（0.5 cycles，60% amplitude）作用 1 分鐘。以 13000 rpm，4℃，10 分鐘的條件離心，上清液即為 nuclear protein 的萃取液，收集並儲 存於 -80℃ 冰箱備用。

八、 電泳法以及西方墨點法

（1） 十二基硫酸鈉電泳法（sodium dodecyl sulfate polyarcylamide gel electrophoresis﹐SDS-PAGE）

在電泳進行時，蛋白質會由負極向正極移動，分子量大的蛋白質移動較慢，

較靠近負極；分子量小的蛋白質移動較快，較靠近正極，所以依照分子量的大小 可得知其相對位置。

（一） Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X)配置

Tris Base 29 g、Glycine 144 g 與 SDS 10 g 一同溶解於 RO 水至 1 L。

（二） 電泳法實驗流程

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本實驗選擇 10% resolving gel、5% stacking gel 分離蛋白質。將細胞蛋白質 以 Bio-Red Protein Assay 分析後，取 40μg 之總蛋白量進行電泳步驟，加入適量 的 Laemmli sample Buffer 混合均勻，於 100℃下加熱 5 分鐘後，spin down 且置 於冰上冷卻，將其分別注入（loading）於製作完成之膞片孔中，並在膞片之其中 一孔加入 5μl 之蛋白質分子量標記物（protein molecular markers），做為標識，

於充滿電泳緩衝液〔tris-glycine SDS running buffer (1X)〕中進行電泳分離。於室 溫下，先以電壓 50 V，待 marker 展開後，再調整電壓到 100 V 進行電泳。

（2） 西方墨點法

（一） Tris-Glycine SDS Transfer Buffer (25X) 和 TBS buffer (5X)配置 Tris Base 18.2 g 與 Glycine 90 g 一同溶解於 RO 水至 500 ml，即為 Transfer Buffer (25X)。實驗中使用的是 Transfer Buffer (1X)，配置方法為 40 ml 25X Transfer Buffer、200 ml methanol 與 RO 水 760 ml 一同混合均勻。TBS buffer (5X) 的配置方法為 NaCl 40 g、KCl 1 g、Tris Base 15 g 一同溶解於 RO 水 至 500 ml。

（二） 西方墨點法實驗流程

需先將 NC membrane 與兩張海綿以 transfer buffer 浸潤 15 分鐘以上，操

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作時，再將 2 張 3M 濾紙於 buffer 中浸濕。重疊的順序從負極到正極依序為 海綿﹐濾紙﹐SDS-PAGE gel﹐NC membrane﹐濾紙﹐海綿，並使用玻棒移除氣泡，

再放入轉印槽中，並使用 transfer buffer (1X) 做為轉移緩衝溶液。將轉印槽置於 4℃ 冰櫃中，以 200 mA 轉印 2 小時。轉印完成後，切割所需範圍，以 5% non-fat milk/0.1% TBS-T（TBS in 0.1% Tween 20） blocking buffer 作用 1 小時，去除 blocking buffer，加入所要觀察的蛋白質一級抗體（抗體配法依照各自的 protocol 所配置），於室溫下作用 2 小時，以 0.1% TBS-T buffer 重複清洗 10 分鐘 3 次，

加入適用一級抗體之二級抗體，於室溫下作用 1.5 小時後，以 0.1% TBS-T buffer 重複清洗 15 分鐘 3 次，最後於暗房中以 Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate 作用 5 分鐘，以 X-ray film 感光顯影後，即放入自動洗片機洗片。

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第三節 統計分析

實驗數據皆以帄均值 ± 標準誤差（mean ± SE）作表示。實驗數據利用 SigmaPlot 10.0 統計軟體以 Student’s t-test 來比較組別間的差異，當統計結果 P

＜0.05 時，則認為兩組間的差異具有統計學上的意義。

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第三章 結果

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同時將 SF-C 和 SF-M 在不同濃度（1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20 μg/ml）下對 MC3T3-E1 進行 ALP activity assay；並且以 MTT assay 偵測細胞存 活率，釐清 SF-C 和 SF-M 對 MC3T3-E1 細胞株是否有細胞毒殺作用。實驗結果 發現 SF-C 和 SF-M 在無顯著毒性的清況下（圖二 B），SF-C 在 10μg/ml 具有增 加 2 倍 ALP 活性的能力，SF-M 則無任何作用（圖二 A）。根據此結果，以 SF-C 為分離對象，得到 8 個分劃物（fraction），分別命名為：SF-C-1、SF-C-2、SF-C-3、

SF-C-4、SF-C-5、SF-C-6、SF-C-7、SF-C-8。

將此 8 個分劃物在不同濃度下（5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml）

測詴 ALP activity（圖三）。預詴驗結果發現僅有 SF-C-5、SF-C-6、SF-C-7 有增加 ALP 活性的能力。於是針對此 3 個分劃物進行細部劑量反應分析，同時與 SF-C 在不同濃度下（1μg/ml、2.5μg/ml 、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml）

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測詴 ALP activity 及 cell viability。實驗結果發現 SF-C 在無顯著毒性的情況下，

濃度 10μg/ml 依然具有 2 倍 ALP 活性的能力。SF-C-5 在濃度 2.5μg/ml 時，有 1.5 倍 ALP 活性的能力；SF-C-6 在濃度 10μg/ml 時，亦有 2 倍 ALP 活性的能力，

同時也是作用最好的分劃物；SF-C-7 隨著藥物濃度的提升，增加 ALP 活性的能 力也會跟著提升（圖四 A）。但此 3 個分劃物在藥物濃度 15μg/ml 和 20μg/ml 作用下，對 MC3T3-E1 有顯著的毒性影響（圖四 B）。根據此結果，以 SF-C-6 為 分離對象，得到 6 個次分劃物（subfraction），分別命名為：SF-C-6-1、SF-C-6-2、

SF-C-6-3、SF-C-6-4、SF-C-6-5、SF-C-6-6。

將此 6 個次分劃物在不同濃度下（5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml）

測詴 ALP activity 及 cell viability。實驗結果發現 SF-C 依舊在無顯著毒性的情況 下，濃度 10μg/ml 依然具有 2 倍 ALP 活性的能力。而在 6 個次分劃物中僅發現 SF-C-6-4、SF-C-6-5、SF-C-6-6 具有增加 ALP 活性的能力（圖五 A），又以 SF-C-6-6 作用能力最好，幾近於 SF-C 的效力，不過此 3 個次分劃物卻對 MC3T3-E1 有顯

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第二節 SF-C 與 SF-C-6 誘發 OPN、OPG 及 RANKL 生成 之影響

骨生成過程中，除了早期的 ALP 可以當作指標外，尚有調控蝕骨細胞分 化的 OPG 和 RANKL（Boyle et al, 2003），以及與骨質礦化有關的 OPN（Kuo et al, 2005）。收集 ALP activity assay 實驗的上清液，係經由藥物與細胞共同培養三天 後的培養液。挑選 SF-C 與 SF-C-6 濃度 2.5μg/ml 、5μg/ml、10μg/ml 當做實

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第三節 SF-C 和 SF-C-6 對 MC3T3-E1 形成礦物質化結節 的影響

為了要評估藥物對造骨細胞的礦化作用是否具有影響，將細胞分別與 SF-C 和 SF-C-6（濃度 0.1μg/ml、0.5μg/ml 、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）共同培 養 14 天，並使用 ARS 染色法染出造骨細胞所堆積的礦物質沉澱。圖七 A 為 SF-C

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第四節 SF-C 刺激造骨細胞分化過程中對 BMPs/SMAD signaling pathway 的影響

BMPs 在骨形成和骨細胞分化過程中扮演了重要的角色，並且 BMPs 的 刺激作用會引起下游轉錄因子 SMAD protein 的活化以及控制核內基因的轉錄作 用（Tang et al, 2007）。因此利用 noggin（BMP 受體抑制劑 ）來測詴 SF-C 在分 化過程中對 BMPs/SMAD 的影響。實驗方法與 ALP activity assay 相同，差別在於 加入藥物 SF-C 前，以不同濃度的 noggin（濃度 0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、

1μg/ml）預先處理一個小時，隨後加入 SF-C 10μg/ml，共同培養三天，測詴 ALP 活性。其實驗駔別有：control 組、抑制劑處理組、藥物處理組、抑制劑加藥物處 理組。從實驗結果顯示，SF-C 10μg/ml 刺激 MC3T3-E1 產生的 ALP activity，會 隨著 noggin 的濃度增加而有減少的趨勢(圖八 A)。Western blot 分析結果顯示，

BMPs 的下游轉錄因子 SMAD protein 活化情形會隨著 SF-C 刺激的濃度增加（濃 度 1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml）而增加(圖八 B)。這顯示著 SF-C 會 透過 BMPs/SMAD signaling pathway 的部分調控而達到促進造骨細胞骨生成作 用。

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第五節 SF-C 刺激造骨細胞分化過程中對 MAPKs signaling pathway 的影響

BMPs 同時也會活化不同於 SMAD pathway 的 MAPKs protein kinases

（Nohe et al, 2004）。已知 SF-C 會經由 BMPs/SMAD signaling pathway 來啟動訊 息傳遞，接著就測詴對 MAPKs 的影響。利用 SB203580（p38 抑制劑 ）、PD98059 了會經由 BMPs/SMAD signaling pathway 的部分調控外，還會透過磷酸化 p38 MAPK，進而調控分化作用的進行。

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第六節 SF-C 刺激造骨細胞分化過程中對 PI3K/Akt signaling pathway 的影響

利用 wortmannin（PI3K 抑制劑）來測詴 SF-C 在分化過程中對 PI3K/Akt 的影響。實驗方法與 ALP activity assay 相同，在加入藥物 SF-C 前，將 wortmannin 以不同濃度（濃度 0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml）預先處理一個 小時，隨後加入 SF-C 10μg/ml，共同培養三天，測詴 ALP 活性。其實驗駔別有：

control 組、抑制劑處理組、藥物處理組、抑制劑加藥物處理組。根據實驗結果發 現隨著 wortmannin 的濃度增加，SF-C 誘發的 ALP 活性會有明顯的抑制(圖十一 A)。Western blot 分析結果顯示 Akt 在 SF-C 濃度 5μg/ml、10μg/ml 和 15μg/ml 刺激下，均有明顯活化的效果(圖十一 B)。這顯示 SF-C 的刺激除了會經由

BMP/SMAD signaling pathway，並誘發 p38 MAPK 的磷酸化外，另外還會需要 PI3K/Akt 的調控進而達到分化作用的進行。

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圖一、冇骨消萃取之流程圖。冇骨消經乙醇加熱萃取後，以氯仿分為可溶層（SF-C）

與不可溶層（SF-M），再以刺激造骨細胞株（MC3T3-E1）ALP 活性為導向，挑 選活性最好的分劃物，持續往下分離（SF-C → SF-C-6 → SF-C-6-6），目前尚

與不可溶層（SF-M），再以刺激造骨細胞株（MC3T3-E1）ALP 活性為導向，挑 選活性最好的分劃物，持續往下分離（SF-C → SF-C-6 → SF-C-6-6），目前尚