SF-C 刺激造骨細胞分化過程中對 MAPKs signaling pathway 的影響

BMPs 同時也會活化不同於 SMAD pathway 的 MAPKs protein kinases

（Nohe et al, 2004）。已知 SF-C 會經由 BMPs/SMAD signaling pathway 來啟動訊 息傳遞，接著就測詴對 MAPKs 的影響。利用 SB203580（p38 抑制劑 ）、PD98059 了會經由 BMPs/SMAD signaling pathway 的部分調控外，還會透過磷酸化 p38 MAPK，進而調控分化作用的進行。

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第六節 SF-C 刺激造骨細胞分化過程中對 PI3K/Akt signaling pathway 的影響

利用 wortmannin（PI3K 抑制劑）來測詴 SF-C 在分化過程中對 PI3K/Akt 的影響。實驗方法與 ALP activity assay 相同，在加入藥物 SF-C 前，將 wortmannin 以不同濃度（濃度 0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml）預先處理一個 小時，隨後加入 SF-C 10μg/ml，共同培養三天，測詴 ALP 活性。其實驗駔別有：

control 組、抑制劑處理組、藥物處理組、抑制劑加藥物處理組。根據實驗結果發 現隨著 wortmannin 的濃度增加，SF-C 誘發的 ALP 活性會有明顯的抑制(圖十一 A)。Western blot 分析結果顯示 Akt 在 SF-C 濃度 5μg/ml、10μg/ml 和 15μg/ml 刺激下，均有明顯活化的效果(圖十一 B)。這顯示 SF-C 的刺激除了會經由

BMP/SMAD signaling pathway，並誘發 p38 MAPK 的磷酸化外，另外還會需要 PI3K/Akt 的調控進而達到分化作用的進行。

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圖一、冇骨消萃取之流程圖。冇骨消經乙醇加熱萃取後，以氯仿分為可溶層（SF-C）

與不可溶層（SF-M），再以刺激造骨細胞株（MC3T3-E1）ALP 活性為導向，挑 選活性最好的分劃物，持續往下分離（SF-C → SF-C-6 → SF-C-6-6），目前尚 未取得純化合物。

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圖二、SF-C 和 SF-M 對 MC3T3-E1 的影響。培養 MC3T3-E1（1.5×10⁴ cells/well）

於 96 wells plate 中，加入 SF-C 或 SF-M 與之共同培養 72 小時後，(A)偵測 ALP 活 性，及(B)測詴細胞存活率。橫軸表示處理不同藥物濃度，c 為 control 組；縱軸 以 c 組為 1，藥物實驗組與之計算其比值。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p

＜0.05 ；** , p ＜0.01，表示與 control 組比較的結果。

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圖三、SF-C 之分劃物對 MC3T3-E1 之預詴驗。純化分離 SF-C 得到 8 個分劃物，

培養 MC3T3-E1（1.5×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，將 SF-C 與 SF-C 之分劃 物與之共同培養 72 小時後，偵測 ALP 活性，發現僅有 C-5、C-6、C-7 具有增加 ALP 的活性能力。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p＜0.05 ；** , p ＜0.01 ；

*** , p ＜0.001，表示與 control 組比較的結果。

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圖四、SF-C-5、SF-C-6、SF-C-7 對 MC3T3-E1 的影響。培養 MC3T3-E1（1.5×

10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，將 SF-C、SF-C-5、SF-C-6、SF-C-7 與之共同 培養 72 小時後。發現 SF-C-6 活化 ALP 活性的能力幾乎相當於 SF-C 的刺激能力 (A)偵測 ALP 活性，及(B)測詴細胞存活率。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p＜0.05 ；** , p ＜0.01，表示與 control 組比較的結果。

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圖五、SF-C-6 之次分劃物對 MC3T3-E1 的影響。純化分離 SF-C-6 得到 6 個次分 劃物，培養 MC3T3-E1（1.5×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，將 SF-C 與 SF-C-6 之次分劃物與之共同培養 72 小時後，(A)偵測 ALP 活性，及(B)測詴細胞存活率。

發現 C-6-4、C-6-5、C-6-6 都具有明顯的活性能力，不過卻有細胞毒性的抑制作 用。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p＜0.05 ；** , p ＜0.01 ；*** , p ＜0.001，

表示與 control 組比較的結果。

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圖六、SF-C 和 SF-C-6 誘發骨生成分化指標之測詴。收集 ALP activity assay 實驗 的上清液，使用 ELISA kit 作為分析。圖(A)藥物刺激後 OPN 之濃度，圖(B)藥物 刺激後 OPG 之濃度變化量，及圖(C)RANKL 在 OD 450 nm 的分析。結果以帄均 值±標準誤差值表示。* , p＜0.05 ；** , p ＜0.01 ，表示與 control 組比較的結果。

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圖七、SF-C 和 SF-C-6 刺激 MC3T3-E1 形成礦物質化結節的影響。培養 MC3T3-E1

（1×10⁴ cells/well）於 24wells plate 6 天後，分別加入 SF-C 和 SF-C-6 不同濃度與 之共同培養 14 天，每 3 天更換細胞培養液和重新添加藥物濃度。圖(A)右側為 SF-C 與細胞共同培養後的染色圖，左側為定量的結果；圖(B)右側為 SF-C-6 與細胞共 同培養後的染色圖，左側為定量的結果。結果以帄均值±標準誤差值表示。** , p ＜ 0.01，表示與 control 組比較的結果。

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圖八、SF-C 對 BMPs/SMAD signaling pathway 的影響。圖(A)培養 MC3T3-E1

（1.5×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，利用 noggin 預先處理細胞 1 小時後，

再加入 SF-C 10μg/ml 培養 3 天。結果顯示隨著 noggin 濃度增加對 SF-C 的抑制 作用也越來越明顯。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p ＜0.05，表示與 control 組比較的結果。^＃ , p ＜0.05，表示與藥物 SF-C 組比較的結果。圖(B)培養

MC3T3-E1（1×10⁶ cells/well）於 3.5cm dish 中，加入不同濃度 SF-C，以 western bolt 測詴 SF-C 對 SMAD 的藥物濃度變化。

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圖九、SF-C 對 p38 MAPK 的影響。圖(A)培養 MC3T3-E1（1.5×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，利用 SB203580 預先處理細胞 1 小時後，再加入 SF-C 10μg/ml 培養 3 天。結果顯示隨著 SB203580 濃度增加對 SF-C 的抑制作用也越來越明顯。

結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p ＜0.05；** , p ＜0.01，表示與 control 組 比較的結果。^＃ , p ＜0.05；^＃＃ , p ＜0.01，表示與藥物 SF-C 組比較的結果。圖(B) 培養 MC3T3-E1（1×10⁶ cells/well）於 3.5cm dish 中，加入不同濃度 SF-C，以 western bolt 測詴 SF-C 對 p38 的藥物濃度變化。

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圖十、SF-C 對 ERK MAPK 和 JNK MAPK 的影響。培養 MC3T3-E1（1.5×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，利用 PD98059 (圖 A)和 SP600125 (圖 B)預先處理 細胞 1 小時後，再加入 SF-C 10μg/ml 培養 3 天。結果顯示 ERK 抑制劑, PD98059 和 JNK 抑制劑, SP600125 皆無法抑制 SF-C 誘發的 ALP 活性。結果以帄均值±標 準誤差值表示。* , p ＜0.05；** , p ＜0.01，表示與 control 組比較的結果。^＃ , p ＜ 0.05；^＃＃ , p ＜0.01，表示與藥物 SF-C 組比較的結果。

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圖十一、SF-C 對 PI3K/Akt signaling pathway 的影響。圖(A)培養 MC3T3-E1（1.5

×10⁴ cells/well）於 96 wells plate 中，利用 wortmannin 預先處理細胞 1 小時後，再 加入 SF-C 10μg/ml 培養 3 天。結果顯示隨著 wortmannin 濃度增加對 SF-C 的抑 制作用也越來越明顯。結果以帄均值±標準誤差值表示。* , p ＜0.05；** , p ＜0.01，

表示與 control 組比較的結果。^＃ , p ＜0.05，表示與藥物 SF-C 組比較的結果。圖 (B)培養 MC3T3-E1（1×10⁶ cells/well）於 3.5cm dish 中，加入不同濃度 SF-C，以 western bolt 測詴 SF-C 對 Akt 的藥物濃度變化。

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