一、研究樣品
帕金森氏症與額顳葉型失智症患者 DNA、cDNA 樣品由林口長
庚醫院醫院神經內科吳逸如醫師及陳瓊美醫師所提供。選取的帕金森 氏症標準需包含兩個以上的帕金森氏症典型症狀，並排除具有家族病 史，或任何可能因腦部外傷、腦炎、服用抗精神性藥物等已知會引起 帕金森氏症候群的病例。在經由患者或家屬同意下進行採樣。同時也 蒐集年齡、性別比率相當的正常人血液樣品作為控制組以供對照。
二、LRRK2 與 GRN 基因 cDNA 的增幅及定序
(一) LRRK2 cDNA
設計三對引子對(表二)，分別增幅 LRRK2 ANK/LRR/ROC domain (2663 bp，共 75 個樣品，其中 66 位發病年齡 50≦ 歲)、COR/MAPKKK domain (2322 bp，共 23 個樣品，其中 20 位發病年齡 50≦ 歲)、WD40 domain (1896 bp，共 20 個樣品，其中 17 位發病年齡 50≦ 歲)。取 100
ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引 子對、2 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶 (Takara La Taq)。PCR 以熱循環儀(OmniGene, HYBRID)進行，反應條 件為95 3℃ 分鐘使DNA 雙股裂解，接著以循環式的裂解溫度 98 10℃ 秒、煉合溫度(表二)45 秒、延長溫度 72 4℃ 分鐘作用50 個循環，最 後以72℃作用 15 分鐘。反應完畢後以 1.2%洋菜膠電泳分離、純化(gel extraction kit，Viogene)後，以雷射螢光 DNA 自動定序儀進行定序分 析(源資生物科技股份有限公司)，定序引子列於表二。
(二) GRN cDNA
設計引子對(表三)，增幅 2218-bp GRN cDNA (共 41 個樣品)。增 幅的煉合溫度為63℃，其餘條件(表三)及定序如上述。
三、LRRK2 基因突變的確認及族群分析
(一) R767H、R1441H 的限制酶片段長度多型性(RFLP)分析
取 100 ng 的 DNA 樣品，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大包含 R767H、R1441H 突變點的片段。各突變點所使用的引子對及 PCR 反
應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。取 2 μl PCR 產物，加入針對 R767H、R1441H 所設計的限制內切酶 BspHI、
BstUI (表四)，與反應緩衝溶液均勻混合，於 37℃水浴槽中反應 20
小時。以 1.4%洋菜膠體電泳檢查，判別各樣品之基因型(表四)。R767H 突變共分析了196 正常人樣品及 374 個帕金森氏症患者樣品，R1441H 突變共分析了484 個帕金森氏症患者樣品。
(二) S885N 的突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR)分析
設計突變基因專一增幅的正向引子(F2，表四)，其 3’端與變異點 互補，與反向引子R 配對，來增幅含 S885N 突變的等位基因(增幅片 段308 bp)。另一正向引子 F1 亦與反向引子 R 配對，作為 PCR 反應 的正控制組(增幅片段 540 bp)。引子的序列、增幅片段的長度及 PCR 反應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。共 分析了211 正常人樣品及 401 個帕金森氏症患者樣品。
四、LRRK2 基因 R1398H、G2385R、M2397T 多型性的族群分析
取 100 ng 的 DNA 樣品，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大包含 R1398H、G2385R、M2397T 多型性的片段。各多型性點所使用的引
子對及PCR 反應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電 泳檢查。10 μl 的切割反應中，取 2 μl PCR 產物，針對各多型性點所
設計的限制內切酶 BspHI、AccI、TaaI (表四)，與反應緩衝溶液均勻 混合，於37℃水浴槽中反應 20 小時。以 1.6%洋菜膠體電泳檢查，判 別各樣品之基因型。共分析了260 正常人樣品及 357 個帕金森氏症患 者樣品。
五、統計分析
計算各樣品群多型性基因型數目，利用Chi-square test (χ2)檢測各 多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並檢測多 型性基因型分佈、等位基因頻率，在帕金森氏症族群與正常人族群 間，是否有顯著差異。
另 外 ， 配 合 線 上 軟 體 SNPSpD (http://genepi.qimr.edu.au/general/
daleN/SNPSpD/) (Nyholt, 2004)，分析各個多型性點間的連鎖不平衡 (linkage disequilibrium，簡稱 LD)關係，得到調整後第一型統計誤差 為5%的顯著性閾值，作為判別顯著性的 α 值(本研究的 α 值為 0.017)。
利用 LDMAX 軟體計算 Lewontin's 標準化不平衡係數 D'、Δ2值與 λs
(version 2.1) (Stephens et al., 2001)，來預估多型性的單套型頻率，並 用JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險程度(Odds ratio)。