LRRK2、GRN基因變異與台灣帕金森氏症、額顳葉型失智症的相關性研究
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(2) 目錄 目錄............................................................................................................. I 摘要.......................................................................................................... IV Abstract.....................................................................................................V 圖表次...................................................................................................... VI 壹、緒論.....................................................................................................1 一、帕金森氏症..................................................................................1 (一)臨床病徵 .................................................................................1 (二)神經病理學 ............................................................................2 (三)病因學 ....................................................................................4 二、帕金森氏症的遺傳分析 .............................................................4 三、LRRK2 基因 ................................................................................5 (一) LRRK2 的構造、表現與功能 ..............................................5 (二) LRRK2 基因變異與帕金森氏症 ..........................................6 四、額顳葉型失智症..........................................................................9 (一) GRN 基因的變異 ..................................................................9 (二) Granulin 的功能..................................................................10 貳、研究目的 ..........................................................................................12 參、研究材料與方法 ..............................................................................13 一、研究樣品....................................................................................13 I.
(3) 二、LRRK2 與 GRN 基因 cDNA 的增幅及定序 ...........................13 (一) LRRK2 cDNA......................................................................13 (二) GRN cDNA..........................................................................14 三、LRRK2 基因突變的確認及族群分析......................................14 (一) R767H、R1441H 的限制酶片段長度多型性(RFLP)分析 .....................................................................................................14 (二) S885N 的突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR) 分析.............................................................................................15 四、LRRK2 基因 R1398H、G2385R、M2397T 多型性的族群分 析........................................................................................................15 五、統計分析....................................................................................16 肆、結果...................................................................................................18 一、cDNA 定序檢測帕金森氏症患者 LRRK2 基因變異 .............18 (一) ANK、LRR、ROC domain 定序檢測 ..............................18 (二) COR、MAPKKK domain 定序檢測 .................................20 (三) WD40 domain 定序檢測 ....................................................22 二、cDNA 定序檢測前額顳葉失智症患者 GRN 基因變異 .........23 三、正常人及帕金森氏症患者的 LRRK2 基因多型性分析.........23 (一) 哈溫平衡檢測 ....................................................................24 (二) 聯鎖不平衡檢測 ................................................................24 II.
(4) (三) 多型性基因型及等位基因頻率........................................25 (四) 多型性配對分析 ................................................................26 (五) 多型性單套型分析 ............................................................26 伍、討論...................................................................................................28 一、LRRK2 基因突變 ......................................................................28 (一) R1441H 突變 ......................................................................28 (二) R767H 突變 ........................................................................30 (三) S885N 突變 .........................................................................31 二、LRRK2 基因多型性 ..................................................................31 三、GRN 基因變異 ..........................................................................34 陸、參考文獻 ..........................................................................................35 柒、附錄圖表 ..........................................................................................47. III.
(5) 摘要 帕金森氏症(PD)為僅次於阿茲海默氏症常見的神經退化性疾 病。臨床症狀包括四肢及軀體顫抖、行動緩慢等現象，主要的病理特 徵是多巴胺神經元在基底核與其他腦幹神經核有退化死亡的現象，尤 其以黑質之緻密區與路易氏體(Lewy body)存在的神經元最為嚴重。 LRRK2 基因為目前引起顯性遺傳帕金森氏症病患重要的基因。近年 來研究發現 LRRK2 基因上的 G2385R 與 R1628P 變異為亞洲人種所特 有的危險因子。本研究經定序 PD 患者的 LRRK2 cDNA，找到一個已 報導的 R1441H、兩個未被報導過的 R767H 與 S885N 突變，及 5 個 改變胺基酸、8 個未改變胺基酸的多型性或變異。進一步針對 R1398H、G2385R 與 M2397T 多型性，進行病例-對照組研究，發現 G2385R 多型性異型合子在 PD 患者的頻率要高於正常人(8.4 vs. 4.2%, odds ratio = 2.08, 95% CI: 1.05-4.41, P = 0.044)，且 M2397T 多型性同 基因型會加重 G2385R 異基因型對 PD 的感受性(4.2 vs. 0.4%, odds ratio = 10.63, 95% CI: 2.08-194.26, P = 0.024)。由於近年研究發現 GRN 基因突變與額顳葉型失智症(FTD)相關，本研究亦針對 41 位病人的 GRN 基因做定序分析，發現兩個未被報導的突變 L57M、T487I 及兩 個已被報導的多型性 D128、3’ UTR C>T。本研究結果可提供臨床上 診斷及諮詢的參考。. IV.
(6) Abstract Parkinson’s disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder, is characterized by resting tremor, rigidity, bradykinesia, and postural instability. The symptoms of PD in pathology are neuronal loss in the basal ganglia, especially in the substantia nigra pars compacta, and presence of intracellular Lewy body inclusions in surviving neurons. Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2, encoding dardarin) are the most frequent genetic cause of PD known nowadays. Mutations in different functional regions of LRRK2 have been reported. Studies from China, Singapore, and Japan indicate that the G2385R polymorphism is an ancient and common risk factor for sporadic PD in the Asian population. In this study, we screened LRRK2 mutations in PD patients and identified a reported (R1441H) and two novel (R767H and S885N) mutations, in addition to 5 nonsynonymous and 8 synonymous amino acid substitutions. In the case-control study, the frequency of the heterozygous G2385R genotype was higher in PD compared to controls (8.4 vs. 4.2%, odds ratio = 2.08, 95% CI: 1.05-4.41, P = 0.044). Moreover, M2397T acting synergistically with G2385R to play role in PD susceptibility (4.2 vs. 0.4%, odds ratio = 10.63, 95% CI: 2.08-194.26, P = 0.024). Granulin (GRN) has been identified as one of the gene responsible for frontotemporal dementia (FTD) and mutations in GRN have been reported. Using cDNA sequencing, we found two novel mutations L57M and T487I, additionally to a synonymous D128 and a C>T variation in 3’UTR. The studies may provide a tool for clinical diagnosis and counseling.. V.
(7) 圖表次 圖一、已報導過的 LRRK2 基因突變在蛋白質結構上的相對位置.... 47 圖二、FTD (Frontotemporal Dementia)患者的 GRN 基因突變........... 48 圖三、LRRK2 基因 R767H 突變檢測 ................................................... 49 圖四、LRRK2 基因 S885N 突變檢測.................................................... 50 圖五、LRRK2 基因 L953 與 K1423 多型性定序圖 ............................. 51 圖六、LRRK2 基因 R1398H 多型性檢測 ............................................. 52 圖七、LRRK2 基因 R1441H 突變檢測 ................................................. 53 圖八、LRRK2 基因 R1483 變異與 G1624 多型性定序圖 ................... 54 圖九、LRRK2 基因 K1637 與 S1647T 多型性定序圖 ......................... 55 圖十、LRRK2 基因 G1819 與 E2108 多型性定序圖 ........................... 56 圖十一、LRRK2 基因 G2385R 與 G2385 多型性定序圖及 G2385R 多型 性檢測 ...................................................................................................... 57 圖十二、LRRK2 基因 M2397T 多型性檢測與定序圖......................... 58 圖十三、GRN 基因 L57M、T487I 突變與 D128、3’UTR (C>T)多型性定 序圖 .......................................................................................................... 59 表一、帕金森氏症的遺傳因子.............................................................. 60 表二、增幅 LRRK2 cDNA 的引子對、條件及定序引子 .................... 61 表三、增幅 GRN cDNA 的引子對、條件及定序引子 ........................ 62. VI.
(8) 表四、LRRK2 基因突變及多型性 PCR 引子對及 ARMS、RFLP 檢測63 表五、早發性帕金森氏症患者 LRRK2 cDNA 的定序結果 ................ 64 表六、帕金森氏症患者與正常人族群 LRRK2 基因多型性之哈溫平衡檢 測 .............................................................................................................. 65 表七、LRRK2 多型性的 SNPSpD 聯鎖不平衡檢測 ............................ 66 表八、帕金森氏症患者與正常人族群 LRRK2 基因的多型性基因型及等 位基因頻率 .............................................................................................. 67 表九、帕金森氏症患者與正常人族群 LRRK2 基因的多型性配對分析 .................................................................................................................. 68 表十、帕金森氏症患者與正常人族群 LRRK2 基因多型性單套型及 Odds ratio 分析.................................................................................................. 69 表十一、前額顳葉失智症患者 GRN cDNA 的定序結果 .................... 70. VII.
(9) 壹、緒論. 一、帕金森氏症. 帕金森氏症(Parkinson’s disease, PD)的發現，最早源自於英國醫 師 James Parkinson 於 l817 年，對震顫性麻痺(shaking palsy)病人所做 臨床症狀包括四肢及軀體顫抖、僵硬，且行動緩慢等之描述，遂以其 姓氏命名此症。. (一)臨床病徵. 帕 金 森 氏 症 患 者 主 要 的 臨 床 病 徵 包 含 靜 止 性 震 顫 (resting tremor)、僵硬(rigidity)、動作遲緩(bradykinesia)、步態不穩(postural instability)等(Conley and Kirchner, 1999)。病患靜止性震顫頻率為每秒 四到七次，通常會在休息時發生，常是在初期症狀的表徵。肢體僵硬 症狀常由肢體近端開始發展，可能某一邊比較明顯嚴重，動作當中花 費的力氣較平常人大，軀幹旋轉能力變差。有動作遲緩症狀的病患， 其自主動作的執行變慢和維持動作出現困難，動作的速度範圍與振幅 都會降低。而步態不穩是指病患在嘗試站立或轉身時，無法維持平衡 而容易跌倒。其它與運動障礙有關的次要症狀包括手臂減少擺動、小 1.
(10) 碎步、說話聲音小、吞嚥困難、寫字很小、少眨眼等(Marjama-Lyons and Koller, 2001)。. 帕金森氏症的症狀會隨著病程的演進而加重，臨床上常以Hoehn 與Yahr發展出的分類系統來評估患者的嚴重程度，可分為五期，第一 期症狀只出現在單側，功能障礙很小或沒有。第二期症狀出現在雙側 或身體的中線，沒有平衡上的障礙。第三期直立反射受損，病患此時 尚能獨立生活，但運動症狀影響日常生活之程度由輕微到中度均有可 能。第四期疾病已全面發展造成嚴重傷害，病患雖能站立與行走，但 能力下降的現象已相當明顯，第五期則是帕金森氏症的末期，除非有 人協助，病患僅能受限於床舖或輪椅上(Hoehn and Yahr, 1967)。. (二)神經病理學. 帕金森氏症病患主要的病理特徵是多巴胺神經元(dopaminergic neuron)在中腦黑質之緻密區(substantia nigra pars compacta, SNpc)與 其他腦幹神經核有退化死亡的現象，因而造成黑質紋狀體路徑 (nigrostriatal pathway)的多巴胺(dopamine)分泌不足而引起臨床症狀 (Dauer and Przedborski, 2003)。這些多巴胺神經元是基底核(basal ganglia)重要的組成份子，而基底核位於腦部負責人體的微調及協調 2.
(11) 運動。當黑質中多巴胺神經元剛開始死亡時，其他腦區仍能加以彌 補，可是這些特化細胞死亡數目一但超過 50~80%時，腦中其他參與 運動控制區域，包括基底核其他部位、視丘與大腦皮質等，已無法像 往常一樣正常運作，因此運動變得無法控制。近年發現 SNpc 負責協 調黑質紋狀體的路徑，當 SNpc 中多巴胺神經元死亡時，會造成投射 至紋狀體的多巴胺量下降而引起臨床症狀。. 除了 SNpc 處會有多巴胺神經元死亡的病理特徵外，解剖部分偶 發性帕金森氏症病患的腦部檢體中，亦發現有一種嗜伊紅性的細胞質 內蛋白質包涵體(proteinacious cytoplasmic inclusions)，在神經元突起 處呈鈁錘絲狀的構造分佈，稱為 Lewy neuritis，有時則在神經元的細 胞核周圍形成球狀的 Lewy body (Gibb and Lees, 1991)。早期研究顯 示，這些包涵體分佈在帕金森氏症病患 SNpc 處殘存的多巴胺神經元 中，並且廣泛分佈在特定的腦區域神經元，嚴重的病例中甚至會發現 包涵體分佈至大腦新皮質(neocortex)中(Braak et al., 2003)。Lewy body 的主要成分為 α-synuclein，α-synuclein 發生變異會導致 Lewy body 的 產生(Spillantini et al., 1997)，一般認為此變性蛋白於患者體內是因為 不被分解造成腦內堆積，進而引起神經細胞死亡，因而出現帕金森氏 症。. 3.
(12) (三)病因學. 在各種帕金森氏症病因理論中，遺傳與環境產生交互作用下的多 因子理論最為被接受，理論主要提出：帕金森氏症患者由於先天遺傳 了某些基因的缺陷或多型性，而使得他們對於特定環境因子的感受性 較大，易引起黑質多巴胺神經元的退化，最終導致帕金森氏症(Bertram et al., 2005; Schapira, 2006)。此外，曾有研究顯示，黑質細胞數量會 隨著年齡增加而有所減少(Gibb and Lees, 1991)，顯示年齡的增加為帕 金森氏症的危險因子。帕金森氏症的盛行率亦隨著個體年齡的增加有 增加的趨勢(Chen et al., 2001)。多數的帕金森氏症病患屬於偶發型 (sporadic)，確切病因目前並不明確，少數的家族遺傳性帕金森氏症則 與基因突變有關(Farrer, 2006)。. 二、帕金森氏症的遺傳分析. 近年許多證據顯示遺傳因素對於家族性帕金森氏症的易感受性 上扮演重要的角色，但由於家族性帕金森氏症病人約佔所有的患者僅 10%，且這些家族性帕金森氏症患者發病時通常較年輕，疾病進展較 快且臨床上及病理上的特徵都較不典型(Bertram et al., 2005)。直至目 前為止，至少已有數個基因座被發現和家族性帕金森氏症相關，且部 4.
(13) 分的致病基因也已被確認(表一)(Belin and Westerlund, 2008)，包括 4q21-23 的 α-synuclein (PARK1) (Polymeropoulos et al., 1997) 、 6q25.2-27 的 parkin (PARK2) (Kitada et al., 1998)、4p14 的 UCHL1 (PARK5) (Leroy et al., 1998)、1p35-p36 的 PINK1 (PARK6) (Hatano et al., 2004)、1p36 的 DJ-1 (PARK7) (Bonifati et al., 2003)及 12p11.2-q13.1 的 LRRK2 (PARK8) (Zimprich et al., 2004)以及 1p35-p36 的 ATP13A2 (PARK9) (Schultheis et al., 2004)。. 三、LRRK2 基因. (一) LRRK2 的構造、表現與功能. 位於第 12 號染色體 q12 上的 PARK8 於 2002 年被報導(Funayama et al., 2002) 。 Paisan-Ruiz 接 著 選 殖 了 此 基 因 並 命 名 為 Dardarin (Paisan-Ruiz et al., 2004)，意即震顫之意。LRRK2 (PARK8)、α-synuclein (PARK1)、UCHL1 (PARK5)基因突變皆與體染色體顯性遺傳的帕金森 氏症相關(Wood-Kaczmar et al., 2006)。LRRK2 基因是目前引起顯性遺 傳帕金森氏症病患重要的基因。. LRRK2 基因約長 144 kb，可以轉譯出 2527 個胺基酸組成的 285. 5.
(14) kDa 蛋白質。LRRK2 蛋白屬於 ROCO 蛋白家族，具有 6 個重要的功 能區塊(domains)，包括 ANK (Ankyrin repeat)、LRR (Leucine-rich repeat)、ROC (Ras of complex protein)、COR (C terminal of ROC)、 MAPKKK (mitogen activated protein kinase kinase kinase)以及 WD40 等(圖一)。這 6 個不同的區塊分別掌管多種功能，包括與受質的結合、 蛋白質的磷酸化、蛋白質與蛋白質之間的交互作用等(Giasson and Van Deerlin, 2008)。前人研究指出，LRRK2 蛋白在哺乳類動物腦部的多 巴胺受質區域有高度表現(Biskup et al., 2006; Melrose et al., 2006; Higashi et al., 2007a, 2007b)。目前已知 LRRK2 蛋白具有絲胺酸/蘇胺 酸 蛋 白 激 酶 (serine/threonine kinase) 的 功 能 ， 活 化 時 形 成 二 聚 體 (dimer)，並且可進行自我磷酸化(autophosphorylation) (West et al., 2005; Greggio et al., 2008)。. (二) LRRK2 基因變異與帕金森氏症. 自 2004 年以來，LRRK2 基因變異在不同人種已陸續被發表。根 據統計，具有顯性遺傳帕金森氏症家族史的病患中，有 13%被發現有 LRRK2 基因變異，而在偶發型帕金森氏症病患中則為 5% (Berg et al., 2005; Mata et al., 2006; Taylor et al., 2006)。位於 LRRK2 基因外顯子 41 上的 G2019S 為白種人常見的突變，在有帕金森氏症家族史的病患中 6.
(15) 有 2~8%被發現有此突變(Di Fonzo et al., 2005)，在阿拉伯裔美國人及 阿肯納西猶太人中，G2019S 出現的頻率可高達 22-40%以上(Lesage et al., 2006; Ozelius et al., 2006)。但在亞洲人種包括新加坡以及台灣族群 的研究中，卻沒有發現此點的變異(Tan et al., 2005)，顯示 LRRK2 基 因變異在不同人種的帕金森氏症病患中有很大差異。. 目前 4 個 LRRK2 變異點已被報導與亞洲族群相關聯，分別是 P755L (Wu et al., 2006)、R1441H、R1628P、G2385R (Mata et al., 2005)。P755L 變異是在中國漢民族所發現，在 598 個帕金森氏症病 患當中有 12 個人帶有此變異，顯示 P755L 在偶發型帕金森氏症病患 中出現頻率為 2% (Wu et al., 2006)。在此之後其他研究者嘗試在高加 索人種身上尋找此變異，不過尚未有任何發現(Deng et al., 2007)。 P775L 變異雖然目前只在亞洲族群找到，不過在 Tan 所做的病例對照 研究(case-control study)中，帕金森氏症病患與正常人的 P775L 變異並 無達到顯著差異(Tan et al., 2008)，所以 P775L 變異是否為亞洲人種的 危險因子(risk factor)仍有待後續研究。. Mata 等人在 2005 年，於台灣帕金森氏症家族中找到了 LRRK2 基因上的 R1441H 變異(Mata et al., 2005)，此變異點與在美國及西班 牙帕金森氏症家族所發現的 R1441C (Zimprich et al., 2004)、R1441G 7.
(16) (Paisan-Ruiz et al., 2004)為改變同一個胺基酸。R1441C/G/H 變異位於 ROC domain 上，而 ROC domain 與 LRRK2 蛋白的 GTPase 和 Kinase 活性有關，且前人研究證實 R1441C/G 變異會降低 LRRK2 蛋白 GTPase 與 Kinase 活性(Li et al., 2007b)。而 R1441H 變異在全球出現 頻率較少，但除了台灣帕金森氏症家族之外，希臘、美國澳洲及也有 發現幾位患者帶有此變異(Spanaki et al., 2006; Zabetian et al., 2005; Huang et al., 2007)。. 位於 LRRK2 基因外顯子 48 的 G2385R 多型性變異自 2005 年被 報導後(Mata et al., 2005)，許多此變異的病例對照研究陸續被報導。 Di Fonzo 等人發現台灣族群中 G2385R 變異出現在帕金森氏症病患的 頻率較正常人高，但在高加索人種無法找到此變異(Di Fonzo et al., 2006b)。Tan 等人在 2007 年的研究同樣有相似的結論，並指出具有 G2385R 變異的 LRRK2 蛋白會存在於細胞質產生堆積(Tan et al., 2007)。近年來許多研究在中國、台灣、日本與新加坡的族群中，更 加確認了 G2385R 變異為亞洲人種帕金森氏症的危險因子(Funayama et al., 2007; Li et al., 2007a; Tan et al., 2007; An et al., 2008)，而這樣的 差異目前並未在亞洲以外的人種中被報導(Di Fonzo et al., 2006a)。. R1628P 變異為今年才發現之華人帕金森氏症特有的危險因子， 8.
(17) 研究以 1079 個血統為華人漢族的巴金森症病人及 907 名正常人為樣 本，包含了台灣及新加坡族群，顯示在 LRRK2 基因上 R1628P 多型 性變異的人得病的機率會較正常人增加兩倍，帶有 R1628P 變異的帕 金森氏症患者在臨床上多為晚發性，平均年齡為 60 歲，但目前此變 異並未在日本及印度族群中發現(Ross et al., 2008)。. 四、額顳葉型失智症. (一) GRN 基因的變異. Foster 於 1997 年首先闡述第 17 號染色體與額顳葉型失智症 (Frontotemporal dementia，簡稱 FTD)相連鎖，在許多 FTD 家族發現 其遺傳基因與 MAPT (microtubule-associated protein tau)基因突變有關 (Foster et al., 1997)。tau 為一種位於軸突的蛋白質，功能與微小管相 關(Mandelkow et al., 1995)，在阿茲海默氏症與其他神經退化性疾病的 神經纖維纏繞(neurofibrillary tangle)中，亦可發現 tau 蛋白的存在 (Goedert et al., 1996)。. Baker 在 2006 年的研究中定序 80 名 FTD 病患，結果發現位於染. 9.
(18) 色體 17q21 的位置，距離 MAPT 基因約 1.7 Mb 處的 granulin (GRN) 基因，產生插入、刪除及發生在轉譯的起始、終止位置的 GRN 基因 突變(Baker et al., 2006)。之後陸續有報導指出 GRN 基因缺失造成 null alleles，包括 IVS0 +5G>C、c.3G>A 等(Cruts et al., 2006)。. (二) Granulin 的功能. Granulin 的前軀物 Progranulin 亦稱 prostate cancer (PC) cell-derived growth factor、proepithelin，由 593 個胺基酸組成，分子量約為 68.5 kDa，結構包含 7.5 個 granulin domain，每個 granulin domain 由 12 個 cysteinyl motif 組成(Bhandari et al., 1992; Eriksen and Mackenzie, 2008)。過去研究顯示 granulin 蛋白存在於大腦皮質、海馬迴錐體神 經元(hippocampal pyramidal neurons)以及小腦的柏金氏細胞(Purkinje cell) (Daniel et al., 2000; Mackenzie et al., 2006)。在發育上，granulin 蛋白在前腦、視網膜神經節細胞、嗅葉以及脊椎皆有顯著的表現 (Daniel et al., 2003)。. Granulin 蛋白具有抗發炎反應功能，有助於傷口的瘉合。有外傷 老鼠的組織中 granulin mRNA 的表現量增多，使嗜中性球、巨噬細胞 等因子增加向受傷組織移動並且修補傷口。在傷口初步癒合形成後， 10.
(19) granulin 數量便會立刻顯著減少(He et al., 2003)。發炎反應時細胞外蛋 白質酵素如 elastase 能將 progranulin 蛋白質分解為數個促發炎反應的 granulin。當免疫刺激發生、微小膠細胞被活化時，產生 IL-1 活化星 狀 膠 細 胞 (Giulian and Lachman, 1985) ， 星 狀 膠 細 胞 進 一 步 分 泌 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) 活 化 granulocyte-macrophage (Thery and Mallat, 1993)，並促進 secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)的表現(Zhu et al., 2002)，SLPI 會與 granulocyte-macrophage 所分泌的 progranulin 結合，以防止 progranulin 被 elastase 分解為 granulin，藉以調控 granulin 在發炎反應所扮演的角 色(He and Bateman, 2003)。. 近年研究顯示 GRN 基因變異與中樞神經系統疾病有相關聯，尤 其是過程有活化的微小膠細胞參與時，這些疾病包含：運動神經受損 疾病、溶小體儲積症以及阿茲海默氏症(Johnston et al., 2001; Ohmi et al., 2003; Baker et al., 2006)，甚至在阿茲海默氏症病理上的 amyloid plaques 與 dystrophic neurites，亦有發現 progranulin 的存在(Baker et al., 2006)。. 11.
(20) 貳、研究目的. 本研究將探討 LRRK2 以及 GRN 基因變異，是否與帕金森氏症及 額顳葉型失智症的感受性相關。根據過去西方國家的統計，在具有顯 性遺傳帕金森氏症家族史的病人中有 13%被發現有 LRRK2 基因的突 變。在白種人的研究中已經發現，LRRK2 基因擁有多型性 G2019S， 但是在亞洲人種卻是 P755L、R1441H、R1628P、G2385R 這些變異 或是多型性較為常見，即 LRRK2 基因變異因人種的不同有著很大的 差異。近年來 LRRK2 基因 G2385R 與 R1628P 變異分別已被證實為亞 洲人種以及華人漢族帕金森氏症特有的危險因子，所以 LRRK2 基因 可以說是目前引起顯性遺傳帕金森氏症病患重要的基因。我們首先將 部份帕金森氏症患者的 LRRK2 基因定序，期望能找出已發表或是未 發表的基因變異或是多型性，並進一步在正常人及帕金森氏症族群中 分析這些變異，期望找出 LRRK2 基因變異與帕金森氏症的關聯。另 外近年來顯示 GRN 基因變異在額顳葉型失智症扮演的角色逐漸重 要，由於目前未有針對台灣額顳葉型失智症族群的 GRN 基因變異研 究，所以亦將針對台灣地區的患者族群進行分子檢測，期能提供臨床 診斷諮詢的參考。. 12.
(21) 參、研究材料與方法. 一、研究樣品. 帕金森氏症與額顳葉型失智症患者 DNA、cDNA 樣品由林口長 庚醫院醫院神經內科吳逸如醫師及陳瓊美醫師所提供。選取的帕金森 氏症標準需包含兩個以上的帕金森氏症典型症狀，並排除具有家族病 史，或任何可能因腦部外傷、腦炎、服用抗精神性藥物等已知會引起 帕金森氏症候群的病例。在經由患者或家屬同意下進行採樣。同時也 蒐集年齡、性別比率相當的正常人血液樣品作為控制組以供對照。. 二、LRRK2 與 GRN 基因 cDNA 的增幅及定序. (一) LRRK2 cDNA. 設計三對引子對(表二)，分別增幅 LRRK2 ANK/LRR/ROC domain (2663 bp，共 75 個樣品，其中 66 位發病年齡≦50 歲)、COR/MAPKKK domain (2322 bp，共 23 個樣品，其中 20 位發病年齡≦50 歲)、WD40 domain (1896 bp，共 20 個樣品，其中 17 位發病年齡≦50 歲)。取 100. 13.
(22) ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引 子對、2 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶 (Takara La Taq)。PCR 以熱循環儀(OmniGene, HYBRID)進行，反應條 件為 95℃ 3 分鐘使 DNA 雙股裂解，接著以循環式的裂解溫度 98℃ 10 秒、煉合溫度(表二)45 秒、延長溫度 72℃ 4 分鐘作用 50 個循環，最 後以 72℃作用 15 分鐘。反應完畢後以 1.2%洋菜膠電泳分離、純化(gel extraction kit，Viogene)後，以雷射螢光 DNA 自動定序儀進行定序分 析(源資生物科技股份有限公司)，定序引子列於表二。. (二) GRN cDNA. 設計引子對(表三)，增幅 2218-bp GRN cDNA (共 41 個樣品)。增 幅的煉合溫度為 63℃，其餘條件(表三)及定序如上述。. 三、LRRK2 基因突變的確認及族群分析. (一) R767H、R1441H 的限制酶片段長度多型性(RFLP)分析. 取 100 ng 的 DNA 樣品，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大包含 R767H、R1441H 突變點的片段。各突變點所使用的引子對及 PCR 反. 14.
(23) 應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。取 2 μl PCR 產物，加入針對 R767H、R1441H 所設計的限制內切酶 BspHI、 BstUI (表四)，與反應緩衝溶液均勻混合，於 37℃水浴槽中反應 20 小時。以 1.4%洋菜膠體電泳檢查，判別各樣品之基因型(表四)。R767H 突變共分析了 196 正常人樣品及 374 個帕金森氏症患者樣品，R1441H 突變共分析了 484 個帕金森氏症患者樣品。. (二) S885N 的突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR)分析. 設計突變基因專一增幅的正向引子(F2，表四)，其 3’端與變異點 互補，與反向引子 R 配對，來增幅含 S885N 突變的等位基因(增幅片 段 308 bp)。另一正向引子 F1 亦與反向引子 R 配對，作為 PCR 反應 的正控制組(增幅片段 540 bp)。引子的序列、增幅片段的長度及 PCR 反應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。共 分析了 211 正常人樣品及 401 個帕金森氏症患者樣品。. 四、LRRK2 基因 R1398H、G2385R、M2397T 多型性的族群分析. 取 100 ng 的 DNA 樣品，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大包含 R1398H、G2385R、M2397T 多型性的片段。各多型性點所使用的引. 15.
(24) 子對及 PCR 反應的條件詳列於表四，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電 泳檢查。10 μl 的切割反應中，取 2 μl PCR 產物，針對各多型性點所 設計的限制內切酶 BspHI、AccI、TaaI (表四)，與反應緩衝溶液均勻 混合，於 37℃水浴槽中反應 20 小時。以 1.6%洋菜膠體電泳檢查，判 別各樣品之基因型。共分析了 260 正常人樣品及 357 個帕金森氏症患 者樣品。. 五、統計分析. 計算各樣品群多型性基因型數目，利用 Chi-square test (χ2)檢測各 多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並檢測多 型性基因型分佈、等位基因頻率，在帕金森氏症族群與正常人族群 間，是否有顯著差異。. 另 外 ， 配 合 線 上 軟 體 SNPSpD (http://genepi.qimr.edu.au/general/ daleN/SNPSpD/) (Nyholt, 2004)，分析各個多型性點間的連鎖不平衡 (linkage disequilibrium，簡稱 LD)關係，得到調整後第一型統計誤差 為 5%的顯著性閾值，作為判別顯著性的 α 值(本研究的 α 值為 0.017)。 利用 LDMAX 軟體計算 Lewontin's 標準化不平衡係數 D'、Δ2 值與 λs 值，用以判斷各 SNP 間的連鎖強弱關係。最後輔以 PHASE 軟體 16.
(25) (version 2.1) (Stephens et al., 2001)，來預估多型性的單套型頻率，並 用 JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險程度(Odds ratio)。. 17.
(26) 肆、結果. 一、cDNA 定序檢測帕金森氏症患者 LRRK2 基因變異. (一) ANK、LRR、ROC domain 定序檢測. 針對 75 位帕金森氏症患者的 ANK、LRR、ROC domain 區域進 行 PCR 增幅，其所對應的 cDNA 位置為表現子 18~31，PCR 增幅後 片段大小為 2663 bp，產物經純化後進行定序分析，結果顯示於表五， 共發現 R767H G>A (novel)、S885N G>A (novel)、R1398H G>A (rs7133914)、R1441H G>A (ss48398558)等改變胺基酸的變異，及 L953 T>C (rs7966550)、K1423 G>A (rs11175964)、R1483 C>A (novel)等未 改變胺基酸的變異。. R767H G>A 突變：表現子 19 的 R767H (CGT>CAT)突變的定序 顯示於圖三 A。此突變會新增限制酶 BspHI (TCATGA)切位，包含 R767H 突變等位基因的 PCR 產物會由 573 bp 的片段被切割成 419 bp 和 154 bp 兩片段(表四)。帕金森氏症患者 H873 為 R767H 的異型合 子，其 PCR 產物經 BspHI 切割後同時出現 573、419、154 bp 三片段 (圖三 B，lane P)。此外，本研究檢測 374 位帕金森氏症患者與 196 18.
(27) 位正常人的表現子 19 片段，除 H873 外，並未於其他樣品發現此突 變。. S885N G>A 突變：表現子 20 的 S885N (AGT>AAT)突變的定序 顯示於圖四 A。此突變未新增任何限制酶切位，故設計突變基因專一 增幅聚合酶連鎖反應，來做突變的確認及族群分析。突變基因專一增 幅的產物為 308 bp，PCR 反應正控制組的產物為 540 bp (表四)。帕金 森氏症患者 H35 為 S885N 的異型合子，其 PCR 產物同時出現 540、 308 bp 片段(圖四 B，lane P)。此外，本研究檢測 401 位帕金森氏症患 者與 211 位正常人的表現子 20 片段，除 H35 外，並未於其他樣品發 現此突變。. L953 T>C 與 K1423 G>A 多型性：表現子 22 的 L953 (TTA>CTA) 多型性的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖五 A，表現子 30 的 K1423 (AAG>AAA)多型性的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖 五 B。此二個未改變胺基酸的多型性並未進一步做族群檢測。. R1398H G>A 多型性：表現子 30 的 R1398H (CGT>CAT)多型性 的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖六 A。此多型性會新增限制 酶 BspHI (TCATGA)切位，包含 R1398H 多型性的 cDNA 片段經切割 19.
(28) 後，會由 1852 bp 的片段被切割成 1368 bp 和 484 bp 兩片段，表現子 30 的 PCR 產物則會由 509 bp 的片段被切割成 299 bp 和 210 bp 兩片 段(圖六 B)。此 R1398H G>A 多型性的族群分析，共檢測了 357 位帕 金森氏症患者與 260 位正常人，結果詳述於後。. R1441H G>A 突變：表現子 31 的 R1441H (CGC>CAC)突變的定 序顯示於圖七 A。此突變會使限制酶 BstUI (CGCG)切位消失，包含 R1441H 突變等位基因因切位喪失，含突變之 cDNA 片段經切割後， 2309 bp 和 354 bp 兩片段轉變為 2663 bp 的片段，表現子 30 的 PCR 產物則會由 483 bp 和 232 bp 兩片段轉變為 715 bp 的片段(圖七 B)。 帕金森氏症患者 H666 為 R1441H 的異型合子(圖七 B，lane P)。此外， 本研究檢測 484 位帕金森氏症患者的表現子 31 片段，除 H666 外， 並未於其他樣品發現此突變。. R1483 C>A 變異：患者 H265 表現子 31 的 R1483 (CGA>AGA) 變 異的異型合子定序結果顯示於圖八 A。此變異雖為新潁，但因未改變 胺基酸，故並未進一步做族群檢測。. (二) COR、MAPKKK domain 定序檢測. 20.
(29) 針對 23 位帕金森氏症患者的 COR、MAPKKK domain 區域進行 PCR 增幅，其所對應的 cDNA 位置為表現子 32~44，PCR 增幅後片 段大小為 2322 bp，產物經純化後進行定序分析，結果顯示於表五， 共發現 R1628P G>C (ss48398561)、S1647T T>A (rs11564148)等改變胺 基酸的變異，及 G1624 C>A (rs1427263)、K1637 A>G (rs11176013)、 G1819 T>C (rs10878371)、E2108 G>A (rs10878405)等未改變胺基酸的 變異。. G1624 C>A 、 R1628P G>C 多 型 性 ： 表 現 子 34 的 R1624 (GGC>GGA)多型性的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖八 B， 表現子 34 的 R1628P (CGT>CCT)多型性的異型合子定序結果顯示於 圖八 C。此二個多型性並未進一步做族群檢測。. K1637 A>G 與 S1647T T>A 多型性：表現子 34 的 K1637 (AAA>AAG)多型性的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖九 A， 表現子 34 的 S1647T (TCA>ACA)多型性的異型合子、同型合子定序 結果顯示於圖九 B。此二個多型性點並未進一步做族群檢測。. G1819 T>C 與 E2108 G>A 多 型 性 ： 表 現 子 37 的 G1819 (GGT>GGC)多型性的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖十 A， 21.
(30) 表現子 43 的 E2108 (GAG>GAA)多型性的異型合子、同型合子定序 結果顯示於圖十 B。此二個未改變胺基酸的多型性並未進一步做族群 檢測。. (三) WD40 domain 定序檢測. 針對 20 位帕金森氏症患者的 WD40 domain 區域進行 PCR 增幅， 其所對應的 cDNA 位置為表現子 44~51，PCR 增幅後片段大小為 1896 bp，產物經純化後進行定序分析，結果顯示於表五，共發現 G2385R G>A (ss48398568)、M2397T T>C (rs3761863)等改變胺基酸的變異， 及 G2385 A>G (ss48398567)未改變胺基酸的變異。. G2385R G>A 多型性：表現子 48 的 G2385R (GGA>AGA)多型性 的異型合子定序結果顯示於圖十一 A。此多型性會新增限制酶 AccI (GTAGAC)切位，包含 G2385R 多型性的表現子 48 片段經切割後， 會由 265 bp 的片段被切割成 186 bp 和 79 bp 兩片段(圖十一 B)。此 G2385R G>A 多型性的族群分析，共檢測了 357 位帕金森氏症患者與 260 位正常人，結果詳述於後。. G2385 A>G 變異：表現子 48 的 G2385 (GGA> GGG)變異的同型 22.
(31) 合子定序結果顯示於圖十一 C。此未改變胺基酸的變異並未進一步做 族群檢測。. M2397T T>C 多型性：表現子 49 的 M2397T (ATG>ACG)多型性 的異型合子、同型合子定序結果顯示於圖十二 A。此多型性會新增限 制酶 TaaI (ACNGT)切位，包含 M2397T 多型性的表現子 49 片段經切 割後，會由 754 bp 的片段被切割成 553 bp 和 201 bp 兩片段(圖十二 B)。此 M2397T T>C 多型性的族群分析，共檢測了 357 位帕金森氏症 患者與 260 位正常人，結果詳述於後。. 二、cDNA 定序檢測前額顳葉失智症患者 GRN 基因變異. 針對 41 位前額顳葉失智症患者的 GRN cDNA 進行 PCR 增幅， PCR 增幅後片段大小為 2218 bp，產物經純化後進行定序分析，結果 顯示於表十一。共發現 L57M (CTG>ATG)、T487I (ACC>ATC) (圖十 三 A)等未報導過的改變胺基酸的突變，及 D128 (GAT>GAC) (rs25646) (圖十三 B)、3’ UTR C>T (rs5848) (圖十三 C)等未改變胺基酸的多型 性。上述變異點皆未進一步做族群檢測。. 三、正常人及帕金森氏症患者的 LRRK2 基因多型性分析. 23.
(32) 本多型性分析的帕金森氏症患者共有 357 位，其中女性佔 44.5%，患者年齡分佈在 24~ 94 歲，平均年齡為 67.8 歲，平均發病年 齡為 62.6 歲。另外控制組共分析了 260 位正常人，其中 48.8%為女性， 年齡分佈在 29 ~ 90 歲，平均年齡為 56.5 歲。. (一) 哈溫平衡檢測. 帕金森氏症患者與正常人族群的 LRRK2 基因 R1398H、G2385R、 M2397T 多型性分析結果詳見於表六。依等位基因頻率及樣品總數(觀 察值)，算出期望之基因數(預期值)，經 chi-square 分析後，各多型性 遺傳情形皆處於哈溫平衡(P = 0.215~0.980)。. (二) 聯鎖不平衡檢測. 利 用 SNPSpD 線 上 軟 體 的 聯 鎖 不 平 衡 相 關 矩 陣 (Linkage disequilibrium correlation matrix)，計算 R1398H、G2385R、M2397T 等多型性位點之特徵值。若所分析的多型性位點皆聯鎖，則第一特徵 值會與多型性位點的數目相同(Cheverud, 2001)。表七中對角線上之數 值即為特徵值，三個特徵值皆介於 0.72~1.34 間，且第一特徵值 1.34 小於多型性位點數目 3，顯示此三個多型性位點並非完全聯鎖。進一 24.
(33) 步配合 LDMAX 軟體分析各多型性位點間的聯鎖不平衡程度，得到 參數 D'與 Δ2 值，D'越接近 1 表示於遺傳的傳遞下此兩個多型性位點 越不易重組，Δ2 值若趨近 1 則代表兩個多型性位點的聯鎖不平衡關係 越強烈。同時以此二值檢測此三個多型性點的連鎖關係，發現 G2385R 和 M2397T 間 D' = 1.00，表示此兩個多型性點不易發生重組。依據 SNPSpD 聯鎖不平衡檢測結果，校正後的 P 值須小於 0.017，差異才 達到顯著性。. (三) 多型性基因型及等位基因頻率. 帕金森氏症患者與正常人族群的 R1398H、G2385R、M2397T 多 型性基因型及等位基因頻率顯示於表八。以 chi-square 檢定後， R1398H、G2385R、M2397T 多型性位點的基因型分佈與等位基因頻 率皆大於 0.017，即差異未達到顯著性。但在帕金森氏症族群和正常 人族群間，G2385R 的基因型與等位基因 P 值分別為 0.040、0.043， 即患者合正常人族群間，G2385R 的基因型(8.4% vs. 4.2%)與等位基因 (4.2% vs. 2.1%)頻率有差異的趨勢。進一步的罹患風險分析顯示，帶 有 G2385R GA 基因型或 A 等位基因者，有較高的疾病罹患風險(Odds ratio = 2.08, 95% CI: 1.05-4.41, P = 0.044 或 2.03, 95% CI: 1.04-4.27, P = 0.048)。 25.
(34) (四) 多型性配對分析. 帕金森氏症患者與正常人族群的多型性配對分析顯示於表九。各 多型性的兩兩配對分析在統計上皆未達顯著差異(P = 0.056~0.356)。 帕金森氏症族群和控制組間單獨比較具有 G2385R 的 GA 異型合子與 M2397T 的 CC 同型合子組合時，在帕金森氏症患者與正常人族群間 差異是顯著的(4.2% vs. 0.4%；P = 0.004，自由度 = 1)。進一步的罹 患風險分析亦顯示，同時為 G2385R 的異型合子與 M2397T 同型合子 者，有較高的疾病罹患風險(Odds ratio=10.63, 95% CI: 2.08-194.26, P = 0.024)。. (五) 多型性單套型分析. 利用 PHASE 軟體分析三個多型性位點間形成的各種單套型於帕 金森氏症患者與正常人族群的分佈情形，結果顯示於表十。單套型中 0 表示常見的等位基因、1 表示多型性的等位基因，於兩個族群中， 最常見的單套型為 000，約佔 49.9~50.6%。其次常見的單套型是 001， 約佔 35.4~38.3%。其餘 5 種單套型 010、011、100、101、111 頻率在 10%以下。帕金森氏症族群中，單套型 011 (即 R1398、R2385、T2397). 26.
(35) 出現頻率較正常人族群高(4.0% vs. 1.9%)，有差異的趨勢(P = 0.044， 自由度 = 1)，但疾病罹患風險並未顯著增高(Odds ratio = 2.01, 95% CI: 0.99-4.41, P = 0.065)。. 27.
(36) 伍、討論. 一、LRRK2 基因突變. LRRK2 和 α-synuclein、UCHL1 基因突變與體染色體顯性遺傳的 帕金森氏症相關(Wood-Kaczmar et al., 2006)。根據過去西方國家的統 計，具有顯性遺傳帕金森氏症家族史的病患中，有 13%被發現有 LRRK2 基因變異，而在偶發型帕金森氏症病患中則為 5% (Berg et al., 2005; Mata et al., 2006; Taylor et al., 2006)。近年來 LRRK2 基因 G2385R 與 R1628P 變異亦分別已被證實為亞洲人種以及華人漢族帕金森氏症 特有的危險因子(Farrer et al., 2007; Ross et al., 2008)。由於 LRRK2 可 以說是目前引起顯性遺傳帕金森氏症病患重要的基因，故本實驗針對 林口長庚醫院醫院提供之帕金森氏症患者 cDNA 進行 LRRK2 基因定 序的工作，定序分析結果顯示如表五。. (一) R1441H 突變 帕金森氏症患者 H666 為表現子 31 的 R1441H 異型合子突變。在 擴大檢測 484 位帕金森氏症患者患者的基因體 DNA 上的 R1441H 突 變後發現，除了 H666 患者外，並無其他患者擁有此突變，即 R1441H 突變出現頻率約佔所有患者約 0.2% (1/485)。綜合希臘族群的 0.4% 28.
(37) (1/266) (Spanaki et al., 2006)及澳洲族群的 0.2% (2/830) (Huang et al., 2007)，R1441H 突變在全球帕金森氏症族群中出現頻率偏低，不是常 見的危險因子。. Arg1441 位於 ROC domain 上，而 ROC domain 與 LRRK2 蛋白的 GTPase 和 Kinase 活性有關。Lin 等人使用 R1441H 變異的帕金森氏 症患者淋巴細胞株，在加入 proteosome 抑制劑 MG-132 後，發現細胞 產生程式性死亡(apoptosis)的數目要比控制組顯著高，顯示帶有 R1441H 突變的 LRRK2 蛋白存在細胞中，可能造成細胞毒害(Lin et al., 2008)。另外在西方族群出現頻率較高的 R1441C/G 突變，亦會降低 LRRK2 蛋白 GTPase 與 Kinase 活性(Li et al., 2007b)。上述結果顯示 Arg1441 於 LRRK2 蛋白功能扮演重要的角色。. Arg1441 在脊椎動物物種間高度保留(Mata et al., 2006)。蛋白質結 構預測的研究發現，Arg1441 離 GTP 結合位較遠，且並非在蛋白的表 面上(Mata et al., 2006)。LRRK2 蛋白質結晶構造分析顯示，當 LRRK2 蛋白形成二聚體時，Arg1441 與 Phe1401、Phe1406、Trp1434 這四個胺基酸 會形成一個疏水性拉鍊(hydrophobic zipper)，緊密結合 2 個單聚體， 而 Arg1441 位於此拉鍊構造的核心，與 Phe1401、Trp1434 形成氫鍵鍵結並 穩定拉鏈結構。故 Arg1441 變成甘胺酸(Glycine)、半胱氨酸(Cysteine) 29.
(38) 或是組胺酸(Histidine)，可能無法與 Phe1401、Trp1434 形成氫鍵，導致 LRRK2 蛋白二聚體不穩定(Deng et al., 2008)。GST Pull-Down 實驗亦 顯示，帶有 R1441C 突變的 LRRK2 蛋白形成二聚體的能力較差(Weiss, 2008)。. (二) R767H 突變. R767H 突變為此次研究新發現，未被報導過。R767H 突變在檢 測的 374 位帕金森氏症患者與 196 位正常人中，僅見於 cDNA 定序所 發現的患者(H873)。. R767H 突變位於 ANK domain 上，ANK domain 參與蛋白質與蛋 白質之間的交互作用，且與 LRKK2 蛋白結構有關。從胺基酸的觀點 來看，極性胺基酸的側鏈對於蛋白質結構穩定性非常重要。透過不同 帶電側鏈間形成離子鍵，可以穩定蛋白質結構。如果蛋白質結構內部 有未配對的帶電側鏈，則會大大減弱結構的穩定性。帶電殘基有很強 的親水性，通常位於蛋白質表面。雖然精胺酸 Arg 與組胺酸 His 同為 帶正電的極性胺基酸，由於精胺酸所帶之電荷較組胺酸強，推測 R767H 突變可能減弱 LRRK2 蛋白結構的穩定性。此外，被報導的人 體 其 他 蛋 白 ANK domain 上 的 突 變 與 疾 病 相 關 的 例 子 還 包 括 30.
(39) cell-cycle inhibitor p16 (Russo et al., 1998; Ruas et al., 1999)及 Notch3 (Joutel et al., 1996)等。上述結果說明 ANK domain 對於蛋白質結構的 重要性，故推測 R767H 突變會影響 LRRK2 蛋白結構。. (三) S885N 突變. S885N 突變亦為此次研究新發現，未被報導過。S885N 突變在檢 測的 401 位帕金森氏症患者與 211 位正常人中，僅見於 cDNA 定序所 發現的患者(H35)。S885N 突變位於 ANK 與 LRR 兩個 domain 間，此 其突變對 LRRK2 蛋白功能的影響，有待進一步的驗證。. 二、LRRK2 基因多型性. LRRK2 基因是目前引起顯性遺傳帕金森氏症病患重要的基因。 近年來已有許多研究報導指出，LRRK2 基因上的多型性點在不同族 群當中已成為帕金森氏症的危險因子。本實驗針對其中三個改變胺基 酸的多型性點 R1398H、G2385R、M2397T 進行了病例對照研究。. R1398H、G2385R、M2397T 多型性在帕金森氏症患者與正常人 族群的基因型及等位基因頻率分析中，G2385R 整體的基因型在帕金. 31.
(40) 森氏症族群和正常人間有差異的趨勢(8.4% vs. 4.2%, odds ratio = 2.08, 95% CI: 1.05-4.41, P=0.044) (表八)。針對 G2385R 多型性等位基因頻 率分析，其中 G2385R 的 A 對偶基因頻率在帕金森氏症族群中亦較正 常族群高(4.2% vs. 2.1%, odds ratio = 2.03, 95% CI: 1.04-4.27, P=0.048) (表八)。2007 年 Farrer 的研究發現，G2385R 變異在台灣族群中帕金 森氏症患者頻率約為 8%，高於正常人族群頻率 4% (Odds ratio = 2.24) (Farrer et al., 2007)。另外在台灣及新加坡族群中，G2385R 變異在帕 金森氏症患者的頻率顯著高於正常人族群(7.3% vs. 3.6% , odds ratio = 2.1，95% CI: 1.1-3.9, P = 0.014) (Tan et al., 2007)。故本實驗結果(表 八)與前人的研究結果相似。進一步對三個多型點進行配對分析，具 有 G2385R 的 GA 異型合子與 M2397T 的 CC 同型合子組合時，則此 配對差異達顯著性(4.2% vs. 0.4%，P = 0.004)，罹患帕金森氏症的風 險亦增高(Odds ratio=10.63, 95% CI: 2.08-194.26, P = 0.024) (表九)。推 測 M2397T CC 同型合子可能增加 G2385R GA 異型合子的罹病風險。. G2385R 變異位於 WD40 domain 上，WD40 domain 亦參與蛋白 質的交互作用。當疏水性的 Gly2385 被親水性的精胺酸 Arg 取代，使 得 WD40 domain 的淨正電荷增加，取代的精胺酸可能導致 LRRK2 蛋白失去與其他蛋白的交互作用，或是產生新的交互作用(Mata et al.,. 32.
(41) 2006)。在 G2385R 變異的功能研究上，G2385R 變異的 LRRK2 蛋白 會在細胞質堆積，導致細胞對氧化壓力耐受性減弱，細胞產生程式性 死亡(Tan et al., 2007)。G2385R 變異的帕金森氏症患者的淋巴細胞 株，在加入 MG-132 後，細胞死亡的數目亦比控制組顯著的高(Lin et al., 2008)。上述研究結果顯示 Gly2385 於 LRRK2 蛋白功能上亦扮演重要 的角色。. 多型性點 R1398H 與 M2397T 分別位於 ROC domain 及 WD40 domain 上。此二個多型性點變異，在美國族群的帕金森氏症患者及 正常人分析中並無明顯差異(Paisan-Ruiz et al., 2005)。此結果與本實 驗結果(表八)相似。雖然如此，LRRK2 蛋白結晶構造顯示 R1398 與 T1343 能調控 Ras 活性，進而影響 GTPase 的功能，實驗亦證明 LRRK2 蛋白若同時存在 R1398Q 與 T1343G 變異，會使得自我磷酸化程度降 低，GTPase 的活性亦下降(Deng et al., 2008)。. 除了以上三個改變胺基酸的變異點外，本研究尚發現 8 個靜默多 型性/變異，包括 7 個已被報導過(L953、K1423、G1624、K1637、 G1819G、E2108、G2385)及一個未被報導過(R1483)。雖然這些變異 點並未改變胺基酸，但對 LRRK2 基因表現的影響(如 mRNA 穩定性、 裁接、轉譯等)，還有待進一步去探討。 33.
(42) 三、GRN 基因變異. 根據報導的文獻，在額顳葉型失智症的族群中，約有 5~10%的病 人可以找到 GRN 基因變異，此頻率與另外一個致病基因 MAPT 變異 相當(Gass et al., 2006; Le Ber et al., 2007)。但亦有文獻指出 GRN 基因 變異頻率較低(Bruni et al., 2007)。本研究針對 41 位額顳葉型失智症患 者進行 cDNA 定序，結果在同一個病人(H1848)發現兩個報導過的變 異點：L57M 以及 T487I。這兩個變異是否在同一條染色體上及對 GRN 基因功能的影響，皆有待進一步的探討。. 此外，我們亦發現兩已被報導(Gass et al., 2006)的多型性點：表 現子 4 的 D128 C>T 及 3’UTR 的 C>T。由於此 2 個變異一為靜默突 變、一位於 3’端的非翻譯區，因此推測對於 GRN 功能影響不大，但 仍不排除這些變異點可能影響 GRN mRNA 的穩定性、裁接、或轉譯 等。. 34.
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(55) 柒、附錄圖表. 圖一、已報導過的 LRRK2 基因突變在蛋白質結構上的相對位置。基 因上方紅色標記者為已確定會造成疾病的突變，橘色標記者為無法完 全確定但是可能造成疾病的突變，藍色標記者為發現於 PD 病人的變 異，但是否會造成疾病仍沒有證據。LRRK2 蛋白質主要的 domain 包 括 ANK (ankyrin-like) 、 LRR (leucine-rich repeat) 、 ROC (Ras of complex)、COR (C-terminal of ROC)、Kinase、WD40 等。(圖片出自 Giasson and Van Deerlin , 2008). 47.
(56) 圖二、FTD (Frontotemporal lobar degeneration)患者的 GRN 基因突變。 上圖為 GRN 基因 mRNA 上所報導過的突變，各突變的數字編號係依 據最長的 GRN mRNA (GenBank accession number NM_002087.2)。下 圖蛋白質上的英文字母為 granulin 重複。(圖片出自 Eriksen and Mackenzie, 2008). 48.
(57) 圖三、LRRK2 基因 R767H 突變檢測。(A) R767H (CGT>CAT)突變異 型合子的定序圖。(B) PD 病患(lane P)及正常人(lane N)的表現子 19 片 段(573 bp)，經 BspHI (TCATGA)切割後的 1.6%洋菜膠體電泳照片。 含有 R767H 突變之等位基因會由 573 bp 的片段被切割成 419 bp 和 154 bp 兩片段。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的結果， 作為片段大小標記。. 49.
(58) 圖四、LRRK2 基因 S885N 突變檢測。(A) S885N (AGT>AAT)突變異 型合子的定序圖。(B) S885N 突變的 ARMS 檢測。PCR 增幅的包含 S885N 突變的表現子 21 片段為 540 bp，S885N 突變等位基因專一引 子增幅的片段為 308 bp，PD 病患(lane P)及正常人(lane N)的 DNA 樣 品經增幅後的 1.6%洋菜膠體電泳照片。Lane M 為 pGEM-4 質體以限 制酶 HinfI 切割的結果，作為片段大小標記。. 50.
(59) 圖五、LRRK2 基因 L953 (TTA>CTA) (A)與 K1423 (AAG>AAA) (B)多 型性的異型合子(左)與同型合子(右)定序圖。. 51.
(60) 圖六、LRRK2 基因 R1398H 多型性檢測。(A) R1398H (CGT>CAT)多 型性的異型合子(左)與同型合子(右)定序圖。(B) GG、GA、AA 各基 因型的 cDNA (左)或 gDNA (右)樣品經增幅後的 BspHI (TCATGA)切 割、1.6%洋菜膠體電泳照片。cDNA 片段經切割後，含多型性之等位 基因會由 1852 bp 的片段被切割成 1368 bp 和 484 bp 兩片段；gDNA 片段經切割後，含多型性之等位基因會由 509 bp 的片段被切割成 299 bp 和 210 bp 兩片段。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的 結果，作為片段大小標記。. 52.
(61) 圖七、LRRK2 基因 R1441H 突變檢測。(A) R1441H (CGC>CAC)異型 合子突變的定序圖。(B) PD 病患(lane P)及正常人(lane N)的 cDNA (左) 或 gDNA (右)樣品經增幅後的 BstUI (CGCG)切割、1.0% (左)或 1.4% (右)洋菜膠體電泳照片。含突變之等位基因因切位喪失，cDNA 片段 經切割後，2309 bp 和 354 bp 兩片段轉變為 2663 bp 的片段(左)；gDNA 片段經切割後，483 bp 和 232 bp 兩片段轉變為 715 bp 的片段(右)。 Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的結果，作為片段大小標 記。. 53.
(62) 圖八、LRRK2 基因 R1483 (CGA>AGA)異型合子變異(A)、G1624 (GGC>GGA)多型性的異型合子(B 左)與同型合子(B 右)、R1628P (CGT>CCT)異型合子多型性(C)定序圖。. 54.
(63) 圖九、LRRK2 基因 K1637 (AAA>AAG) (A)與 S1647T (TCA>ACA) (B) 多型性的異型合子(左)與同型合子(右)定序圖。. 55.
(64) 圖十、LRRK2 基因 G1819 (GGT>GGC) (A)與 E2108 (GAG>GAA) (B) 多型性的異型合子(左)與同型合子(右)定序圖。. 56.
(65) 圖十一、LRRK2 基因 G2385R (GGA>AGA)異型合子多型性(A)、G2385 (GGA>GGG)同型合子多型性(C)的定序圖。(B) GG、GA 各基因型的 DNA 樣品經增幅後的 AccI (GTAGAC)切割、2.0%洋菜膠體電泳照 片。DNA 片段(389 bp)經切割後，含多型性之等位基因會由 265 bp 的片段被切割成 186 bp 和 79 bp 兩片段。Lane M 為 pGEM-4 質體以 限制酶 HinfI 切割的結果，作為片段大小標記。. 57.
(66) 圖十二、LRRK2 基因 M2397T (ATG>ACG)異型合子(A 左)、同型合 子(A 右)多型性的定序圖。(B) TT、TC、CC 各基因型的 DNA 樣品經 增幅後的 TaaI (ACNGT)切割、1.0%洋菜膠體電泳照片。DNA 片段經 切割後，含多型性之等位基因會由 754 bp 的片段被切割成 553 bp 和 201 bp 兩片段。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的結果， 作為片段大小標記。. 58.
(67) 圖十三、GRN 基因 L57M (CTG>ATG)與 T487I (ACC>ATC)突變(A)、 D128 (GAT>GAC)多型性的異型合子(B 左)與同型合子(B 右)、3’UTR (C>T) (rs5848)多型性的異型合子(C 左)與同型合子(C 右)定序圖。. 59.
(68) 表一、帕金森氏症的遺傳因子 PARK loci. Chromosome. Gene. Form of PD. Mutations. Origin. PARK1 PARK4. 4q21. SNCA. AD. A30P, E46K, A53T Duplication and triplication. Greece and Italy Iowa. PARK2. 6q25.2-q27. Parkin. AR J. Japan. PARK3. 2p13. Unknown. AD. Various mutations, exonic deletions, duplication and triplication -. PARK5. 4p14. UCHL1. I93M and S18Y. Germany. PARK6. 1p35-p36. PINK1. AD and idiopathic AR. G309D, exonic deletions. Italy. PARK7. 1p36. DJ-1. AR and EO. Homozygous exon deletions, L166P. Europe. PARK8. 12p12. LRRK2. 1p36. ATP13A2. R1441C/G/H, Y1699C, G2019S, I2020T, G2385R Loss-of-function mutations. Japan. PARK9 PARK10. 1p32. Unknown. AD and idiopathic Kufor-Rakeb syndrome and EO PD Idiopathic. -. Iceland. PARK11. 2q36-q37. Unknown. -. North America. PARK12. X. Unknown. AD and idiopathic Familial. -. North America. PARK13. 2p13. HTRA2. Idiopathic. A141S, G399S. Germany. Europe. Japan, Italy and Brazil. 註：AD, autosomal dominant, AR, autosomal recessive, J, juvenile, EO, early onset. (表出自 Belin and Westerlund, 2008). 60.
(69) 表二、增幅 LRRK2 cDNA 的引子對、條件及定序引子. 引子對. 增幅片段 大小(bp). 煉合溫度 (℃). MgCl2 (mM). F: TTGACTTAGTAATATTCCATCAAATGTCTTCC R: TCTCACTAGTTGTAATAATCGTTTCCGGTC. 2663. 56. 2.0. 基因片段 ANK、LRR、ROC domain. RW: TGATAGGGATGAAATGTGGTTCTTACTAAGG FW: TTAGAAGGAAATAAAATATCAGGGATATGCTC. Sequencing. COR、MAPKKK domain. F: GAGAAGCAACGCAAAGCCTGCATGAGTA R: CCCATCTTCGGTATTGATGACCAGGAGAGTAC. 2322. FW: TCCAAAACACCCTAAGGGCA RW: TCTCAACCATAGCCCATGGG. 66. 2.0. Sequencing. WD40 domain. F: ACGTAATTGTTGAATGCATGGTTGCTACAC R:TTCAGGGTATCCACATTCAAACATAGAGTTG. 1896. FW: GTGTGGGATAAGAAAACTGA. 65 Sequencing. 61. 2.0.
(70) 表三、增幅 GRN cDNA 的引子對、條件及定序引子 基因片段. 引子對. 增幅片段 大小(bp). 煉合溫度 (℃). MgCl2 (mM). 2218. 63. 2.0. 全長 cDNA F: TGATAAGTAGCCAATGGGAGCGGGTAGC R: AACTTTATTGAAACGCACACGCGCACAC FW: TCCAGCTCGGTCATGTGTC. Sequencing. 62.
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