第三章 材料與方法
第二節 女貞子果實成份之抽取及分離
將購自藥廠的女貞子果實1公斤以甲醇萃取5次，由甲醇萃取液經減壓濃縮除 去溶劑，得到初抽物(LLM)，依序以氯仿和水進行分配萃取，再利用
α-glucosidase抑制活性測定篩選適當的分配萃取層，選定fraction進行細部分 離。
Isolation and separation of Ligustrum lucidum The fruit of Ligustrum lucidum (1Kg)
extracted with MeOH( x 5 ) filtered
crude ext.
concd.
concd concd
CHCL3 Layer(101.80g) H2OLayer(56.98g) α-glucosidase 抑制率為 46.2% α-glucosidase 抑制率為 4.8%
DPPH 抑制率為 43.1% DPPH 抑制率為 58.8%
其中水層之沉澱物以再結晶法處理後生成一針狀結晶，與文獻比對無誤後確認為 mannitol(27)。
女貞子之萃取與分離流程圖
氯仿層之萃取與分離流程圖
第四章 女貞子化合物之構造研究
女貞子經矽膠管柱層析與薄層層析方法細部分離後，得到 9 個化合物，經 結構鑑定後與文獻比對確認，分別為五環三萜類- oleanolic acid、3-acetyl oleanolic acid、ursolic acid、ursolic acid long-chain fatty acid ester、
lupeol、lupeol long-chain fatty acid ester。以及其它類 β-sitosterol、
mannitol、aliphatic alcohol。
主成分介紹<94>:
三萜類化合物可視為六分子異戊二烯聚合而成，在中草藥中分佈很廣，是萜類化 合物中最多的一類，多以游離狀態或成苷或成酯形式存在於自然界。
其中五環三萜皂苷:有A、B、C、D、E五環，C10、C8、C14、C17有側鏈取代，多 為甲基，有時甲基可氧化為-CH2OH、-CHO、-COOH等，C4為偕二甲基。C3-β-OH，
但也有C3-α-OH。 B、B與C、C與D環均為反式稠合，D與E環為順式；基本母核為22個碳原子。C23 、 C24 和C29 、C30均為甲基分別連接在C4 和C20位。
2．α-香樹脂烷(α-amyrane)型又稱烏蘇烷(ursane)型或熊果烷型。
與β-香樹脂烷型不同之處是E環上C29、C30甲基分別連接在C19、C20位上。
A B
第一節 oleanolic acid(100)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得白色片狀結晶。UV光譜於 220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.1-1)在1456、1686cm-1出現雙鍵、羰基的吸 收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。
由1H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.1-2)顯示，在δ0.75, 0.77, 0.91, 0.92, 0.95, 0.98, 1.13 有 7 根單峰甲基的特徵吸收訊號。顯示本化合物應為齊墩果烷型的 五環三萜衍生物。在δ5.24(1H, br )出現 H-12 的烯類質子之吸收訊號。在 2.80(1H, d, J=9.4 Hz, H-18)之吸收訊號，推測是 H-18 受到Δ12, 13 的雙鍵及 C-28 上的羧基影響而往低磁場移動。此外，在δ3.19(1H, dd, J=4.8,11.2 Hz, H-3) 出現 H-3 的特徵訊號，由其偶合常數值可推測 C-3 的羥基取代應為β型示。
綜合以上資料推測，此結構為oleanolic acid(100)，經與文獻光譜數據比對<95>， 確認此化合物。
HO H
H H
OH
O
23 24 3
25 26
12 18
17 30 29
27
28
oleanolic acid(100)
Fig.1-2 oleanolic acid(100)之1H NMR 光譜
第二節3-acetyl oleanolic acid(102)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末，可溶解於氯仿。UV光譜於220-800nm無明顯吸收，
IR光譜(Fig.2-1)在1463cm-1出現雙鍵的吸收;1704cm-1 、1696 cm-1 出現兩個羰基 的吸收;在3300 cm-1 -2400 cm-1出現寬廣的羧基吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑 加熱呈現一鮮豔紫紅點，加熱後過一段時間，紫紅色的點會轉變成灰藍色，推測 為三萜類化合物。
由1H NMR(300MHz, CDCl3)(Fig.2-2)顯示，在δ0.71, 0.82, 0.83, 0.90, 0.91, 0.96, 1.07 有7根單峰甲基的特徵吸收訊號。顯示本化合物應為齊墩果烷型的五環三萜衍生 物。在δ5.21 (1H, br, H-12)出現H-12的烯類質子之吸收訊號。在δ2.80(m)之吸收訊 號，推測是H-18受到Δ12, 13的雙鍵及C-28上的羧基影響而往低磁場移動。此 外，在δ2.02(3H, s )及δ4.44 (1H, t, J=7.8 Hz, H-3)為C-3位置有乙醯取代基之質子 吸收特徵，H-3受乙醯基影響而往低磁場移動。綜合以上資料推測，此結構為 3-acetyl oleanolic acid(102)，經與文獻光譜數據比對<96>，確認此化合物。
AcO H
H H
OH
O
23 24 3
25 26
12 18
17
30 29
27
28
3-acetyl oleanolic acid(102)
Fig.2-2 3-acetyl oleanolic acid(102)之1H NMR 光譜光譜
第三節 ursolic acid(99)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末，不易全溶解於氯仿。UV光譜於220-800nm無明顯吸 收，IR光譜(Fig.3-1)在1461、1690cm-1出現雙鍵、羰基的吸收。薄層層析以硫酸 為顯色劑加熱呈現一鮮豔紫紅點，加熱後過一段時間，紫紅色的點會轉變成灰藍 的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為 ursolic acid(99)，經 與文獻光譜數據比對<95>，確認此化合物。
ursolic acid(99)
Fig.3-2 ursolic acid(99)之 1H NMR 光譜
第四節 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末。 UV光譜於220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.4-1) 在1462、1702 cm-1出現雙鍵、羰基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅 long-chain fatty acid 的特徵吸收，推測應是 C-3 的長鏈酯基。綜合以上資料 推測，此結構為ursolic acid(99) long-chain fatty acid ester(106)，經與文獻光譜數
據比對<89>，確認此化合物。本化合物為首次由女貞子分離得到。
ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)
Fig.4-2 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)之1H NMR 光譜
第五節 lupeol(107)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得白色針狀結晶。UV光譜於 220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.5-1)在1456、3355 cm-1出現雙鍵、羥基的吸 收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。
由1H NMR(300MHz, CDCl3)(Fig.5-2)顯示，在δ0.76, 0.78, 0.82, 0.94, 0.96, 1.02有6根單峰甲基及δ1.63(3H,s,H-30)為雙鍵旁甲基的特徵吸收訊號，顯示本 化合物應為羽扇豆烷型的五環三萜衍生物。在δ4.56 (1H,s,H-29b)及δ4.60 (1H, s,H-29a)為末端雙鍵之特徵吸收訊號。另在δ2.35(1H,td,J=5.6,11.2Hz,H-19)
受亞甲基及H-18之影響進而分裂成td型式，又受其旁雙鍵影響出現在較低磁場。
此外，在δ3.16(1H, dd,J=5.2, 10.9 Hz, H-3)出現H-3的特徵訊號，由其偶合 常數值可推測C-3的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為
lupeol(107)，經與文獻光譜數據比對<90>，確認此化合物。
25 26
27 29
HO 3
30
18 19
28
23 24
lupeol(107)
Fig.5-2 lupeol(107)之 1H NMR 光譜
第六節 lupeol long-chain fatty acid ester(108)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末。UV光譜於220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.6-1) 在1380、1456、1732cm-1出現雙鍵、酯基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱 呈粉紅色，推測為三萜類化合物。
由1H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.6-2)顯示，在δ0.76, 0.80, 0.84, 0.95, 0.97, 1.05 有 6 根單峰甲基及δ1.67(3H,br,H-30)為雙鍵旁甲基的特徵吸收訊號，顯 示本化合物應為羽扇豆烷型的五環三萜衍生物。在δ4.56(1H,s,H-29b)及δ 4.67(1H,s,H-29a)為末端雙鍵之吸收訊號。在δ2.33(1H,td,J=5.9,16.7 Hz, H-19)受亞甲基及 H-18 之影響進而分裂成td型式，又受其旁雙鍵影響而往低磁 場移動。此外，在δ4.44(1H, dd, J=5.7,10.7 Hz H-3)推測為 H-3 之吸收訊號，
H-3 受酯類取代基影響而往低磁場移動。另在 δ1.24(br)及δ2.26(2H, t, J=7.4 Hz)出現 fatty acid 的特徵訊號， 推測 C-3 為 long-chain fatty acid ester 取代。綜合以上資料推測，此結構為lupeol long-chain fatty acid ester(108)，經與 文獻光譜數據比對<90>，確認此化合物。
25 26
27 29
3 CH3(CH2)nCO
O
30
18 19
28
23 24
lupeol long-chain fatty acid ester(108)
Fig.6-2 lupeol long-chain fatty acid ester(108)之1H NMR 光譜
第七節 β-sitosterol(109)之構造研究
以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得無色片狀結晶。UV 光譜 於 220-800nm 無明顯吸收，IR 光譜(Fig.7-1)在 1379、1456、3355cm-1出現雙鍵 及羥基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈紅色點，推測可能是固醇類化合 物。
由1H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.7-2)顯示，在0.67(3H, s, H-18)
0.78 (3H, d , J=7.0 Hz H-27), 0.82(3H, d , J=7.0 HzH-26), 0.89(3H, t, J=7.2 Hz H-29), 0.96(3H, d , J=7.0 Hz H-21), 1.00(3H, s, H-19)有 6 根甲基的特徵吸收訊號，
顯示本化合物應為固醇類。在δ5.34(1H, d, J= 5.2 Hz, H-5)出現 H-5 的烯類質子 之吸收訊號。在δ3.52(1H, m, H-3 )出現 H-3 的特徵訊號，由其偶合常數值可推 測 C-3 的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為β-sitosterol(109)，
經與文獻光譜數據比對<91>，確認此化合物。
3
5 19
18
HO
H H 21
29 26
27
β-sitosterol(109)
Fig.7-2 β-sitosterol(109)之1H NMR 光譜
第八節 mannitol(27)之構造研究
反覆以氯仿及甲醇再結晶得無色針狀結晶。UV 光譜於 220-800nm 無明顯吸收。
由1H NMR(400MHz,D2O)(Fig.8-1)顯示，因其結構對稱性，僅剩4組相互偶合之訊 號，在δ3.72 (2H, dd, J=5.8,11.6 Hz)、δ3.80 (2H, ddd,J=2.5, 5.8, 8.4 Hz)、
δ3.85 (2H, d, J=8.4 Hz)及δ3.92 (2H, dd, J=2.5, 11.6 Hz)推測本化合物 應為(CHOH-CHOH-CH2OH)2之結構。綜合以上資料推測，此結構為mannitol(27)，
經與文獻光譜數據比對<97>，確認此化合物。
。
O H
O H H
O H H
H H O
H H O
O H 1 2
3 4 6 5
mannitol(27)
第五章 女貞子藥理活性研究之萃取及劃分
在本研究將針對由女貞子植物所分離得到的成分，進行α-glucosidase抑制 活性的篩選以及清除DPPH自由基活性活性測試。
第一節 降血糖活性測試 實驗步驟:
a、α-glucosidase：配製α-glucosidase 0.4U/ml b、 PNPG：配製 0.7 mM PNPG 溶液
c、待測樣品 100λ加入α-glucosidase 100λ，溫浴 10min d、加入 PNPG 溶液 100λ，繼續溫浴 20 min
e、測量 400nm 之 OD 值
【各劃分層之活性測試】
利用α-glucosidase抑制活性進行實驗測定。如表所示，有氯仿層(LLC) 及氯仿層的第4個fraction(LLC-4) 、第5個fraction(LLC-5) 、第6個
fraction(LLC-6) 、第7個fraction(LLC-7)和第8個fraction(LLC-8)有良好的活 性。利用此結果，再進一步作細部分離，取得有效化合物。
第二節 清除DPPH藥理活性測試 實驗步驟:
a、配製 1mM DPPH 甲醇溶液
b、取 100λ之待測樣品，加入 100λDPPH 溶液，室溫下避光靜置 5 分鐘 c、使用光度計檢測 517nm 之吸光值
d、計算清除率
【各劃分層之活性測試】
利用清除DPPH進行實驗測定。如表所示，有氯仿層(LLC)及氯仿層的第10 個fraction(LLC-10)、第11個fraction(LLC-11)、第14個fraction(LLC-14)、和 水層(LLW)有良好的活性。利用此結果，再進一步作細部分離，取得有效化合物。
ITEM α-glucosidase DPPH Positive control 25.0% (Acarbose) 30.0%(Vit C)
LLC 46.2% 43.1 %
LLW 4.8% 58.8 %
LLC-1 13.6% -
LLC-2 9.1% -
LLC-3 23.5% -
LLC-4 29.5% -
LLC-5 34.9% -
LLC-6 98.4% -
LLC-7 94.4% -
LLC-8 53.6% -
LLC-9 19.0% -
LLC-10 - 10.2%
LLC-11 - 7.7%
LLC-12 17.6% -
LLC-13 16.7% -
LLC-14 13.0% 43.8%
LLC-15 10.0%
表 各劃分層藥理活性測試數據
第六章 結論
女貞子氯仿層萃取物經矽膠管柱層析與TLC片檢測合併後，得到15個劃分 層。將這15個劃分層，分別進行α-glucosidase抑制活性篩選、清除DPPH自由 基活性測試。測試結果:第4、5、6、7、8劃分層有良好的α-glucosidase抑制活 性;第10、11、14劃分層有不錯的DPPH自由基清除活性。
再將對α-glucosidase抑制活性較好的第3、4、5、6、7、8劃分層先做細 部的純化分離。共得到9個化合物，經結構鑑定後與文獻比對確認，分別為五環 三萜類- oleanolic acid(100)、3-acetyl oleanolic acid(102)、ursolic acid(99)、ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)、lupeol(107)、
lupeol long-chain fatty acid ester(108)。及其它類-β-sitosterol(109)、
mannitol(27)及aliphatic alcohol(110)。
附錄一 植物的萃取與分離
將購自藥廠的女貞子果實1公斤以甲醇萃取5次，由甲醇萃取液經減壓濃縮 除去溶劑後，得到初抽物(LLM)199.36克，再依序以氯仿和水進行分配萃取，得 到氯仿層萃取物(CHCL3 Layer)101.8克及水層萃取物(H2O Layer) 56.98 克。其 中於水層萃取物發現有沉澱物反覆以再結晶法處理後生成一針狀結晶，與文獻比 對無誤後確認為mannitol(27)(0.51g)。
再利用α-glucosidase抑制活性測定篩選適當的分配萃取層，選定氯仿層 萃取物(α-glucosidase抑制率為46.2%; DPPH抑制率為43.1%)進行細部分離。以 矽膠管柱層析分離，氯仿與甲醇(CM=29：1）為沖提液，再加入甲醇漸增極性沖 得到一白色粉末為lupeol long-chain fatty acid ester(108)(0.39g)。
第4 個劃分層，以矽膠管柱層析分離，氯仿為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，
再經以TLC 片檢測合併後得到 7 個劃分層。其中 4-2 劃分層經再結晶法得到一 白色粉末為 lupeol(107)(13.89g)，為首次於女貞屬中發現之化合物。4-3 劃分 層，以矽膠管柱層析分離，正己烷與乙酸乙酯(NE=4:1)為沖提液，再加入乙酸乙
酯漸增極性沖提，經收集濃縮得到各劃分層，再經以TLC 片檢測合併後得到 5
個劃分層。其中4-3-1 劃分層經再結晶法得到一白色粉末為 aliphatic alcohol(110)(0.69g)。4-5-1 劃分層經再結晶法得到一白色粉末為 3-acetyl oleanolic acid(102)(0.30g)。
第5 個劃分層，以矽膠管柱層析分離，氯仿為沖提液，經收集濃縮得到各劃
分層，再經以TLC 片檢測合併後得到 6 個劃分層。其中 5-2 劃分層經再結晶法 得到一透明片狀結晶為β-sitosterol(109)(0.58g)。5-5 分層經再結晶法得到一白色 粉末為ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)(0.38g)。
第6 個劃分層，先以多次再結晶法、反覆抽氣過濾，得到一淡黃色粉末。
第6 個劃分層，先以多次再結晶法、反覆抽氣過濾，得到一淡黃色粉末。