女貞子之降血糖活性成分研究

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(1)國立屏東教育大學化學生物系研究所 Graduate Institute of Chemical Biology National Pingtung University of Education. 碩士論文 Master Thesis. 女貞子之降血糖活性成分研究 Investigating Antidiabetic Activity of Constituents from Ligustrum lucidum. 指導教授：李佳穎 (Dr. Chia-Ying Li) 博士研究生：許芳銘（Fang-Ming Hsu）撰. 中華民國一百年一月二十四日.

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(3) 謝誌感謝恩師佳穎教授這兩年多的指導，總是在學生遇到困難時給予最有力的幫助。在學業、實驗上是良師，私底下相處則像益友。給學生的不只是研究、論文的精進，還有做人做事的道理。感謝口試委員詹于誼教授、張雯惠教授在百忙中撥冗斧正論文，使本論文得以更臻完善。 1 承蒙成功大學及結構化學實驗室代測 H-NMR 及珮君學妹協助 IR 之使用;奈米材料實驗室學弟妹協助 UV 之使用，使本論文得以完成。感謝建億學長、研究所同學及實驗室伙伴子淵、銘華、亞鵬、淄宜、彥鈞學弟、家豪學弟、凱鈴學妹、政桂學妹使我這兩年多的研究所生活能充實、歡笑且令人難忘。最後，要感謝我的父母，因您們無怨無悔的付出，我才能無後顧之憂致力於研究。. 1.

(4) 目. 錄. 目錄………………………………………………………………………………… 英文摘要…………………………………………………………………………… 中文摘要…………………………………………………………………………… 第一章緒論……………………………………………………………………… 第一節植物型態……………………………………………………………… 第二節研究背景與目的………………………………………………………. 2 3 4 5 5 6. 第二章女貞屬植物之研究現況…………………………………………………… 9 第一節女貞屬植物之藥理與藥效…………………………………………… 9 第二節女貞屬植物之成分回顧………………………………………………12 第三章材料與方法……………………………………………………………… 54 第一節儀器與材料………………………………………………………… 54 第二節女貞子果實成份之抽取及分離…………………………………… 55 第四章女貞子化合物構造之研究……………………………………………… 57 第一節 oleanolic acid ………………………………………………… 59 第二節 3-acetyl oleanolic acid………………………………………… 61 第三節 ursolic acid……………………………………………………… 63 第四節 ursolic acid long-chain fatty acid ester……………… 65 第五節 lupeol……………………………………………………………… 67 第六節 lupeol long-chain fatty acid ester…………………………… 69 第七節 β-sitosterol…………………………………………………………71 第八節 mannitol……………………………………………………………… 73 第五章女貞子藥理活性研究之萃取及劃分…………………………………… 74 第一節降血糖活性測試…………………………………………………… 74 第二節清除 DPPH 藥理活性測試………………………………………… 75 第六章結論……………………………………………………………………… 77 附錄一植物的萃取與分離…………………………………………………… 78 附錄二光譜數據……………………………………………………………… 79. 參考文獻………………………………………………………………………….… 82. 2.

(5) Abstract Ligustrum lucidum is a common traditional Chinese medicine. In the pre-test study, the extracts of Ligustrum lucidum showed good antidiabetic activity. In this study, the fruits of ligustrum lucidum were extracted by methanol for five times. The. methanol extract was partitioned between water and chloroform. The chloroform layer possessed the higher α-glucosidase inhibiting effect. Nine compounds were obtained by column chromatography from chloroform layer, including six triterpenes: oleanolic acid, 3-acetyl oleanolic acid, ursolic acid, ursolic acid long-chain fatty acid ester, lupeol, lupeol long-chain fatty acid ester; three other: β-sitosterol, mannitol, aliphatic alcohol. Among these, ursolic acid long-chain fatty acid ester and lupeol were isolated for the first time from this plant. Their structures were determined by 1 H-NMR spectroscopic analyses and compared with the literature data. The bioactivities of all the isolates have been under progress.. 3.

(6) 中文摘要女貞子(Ligustrum lucidum )是一味很常見的中藥。而由活性研究顯示女貞子萃取物具有降血糖活性。將女貞子果實以甲醇萃取5次，得到甲醇萃取物。甲醇萃取物再分別以氯仿和水進行分配萃取。其中氯仿層對α-glucosidase有較好的抑制活性。由管柱層析得到9個化合物，包括6個三萜類化合物: oleanolic acid、 3-acetyl oleanolic acid、ursolic acid、ursolic acid long-chain fatty acid ester、lupeol、 lupeol long-chain fatty acid ester及其它3個化合物: β-sitosterol、mannitol、aliphatic alcohol。其中ursolic acid long-chain fatty acid ester及lupeol為首次在本植物中發現。所得到之化合物皆經1H-NMR光譜分析確定其結構。這些成分的生理活性仍尚待探討。. 4.

(7) 第一章第一節. 緒論. 植物型態. 女貞子(Ligustrum lucidus)為木犀科（Oleaceae）植物女貞的乾燥成熟果實。可人工栽培或野生。主要生長於浙江、江蘇、湖南、福建、廣西、四川等地。多數果實呈橢圓形或腎形，長徑4~8 ㎜，短徑2.5~4 ㎜。表面為黑紫色或黑棕色，皺縮不平，基部有果梗痕或具宿萼及短梗。其外果皮薄，中果皮稍厚而鬆軟，內果皮木質，呈黃棕色，表面有數個縱棱。橫切面有子房2室，每室有種子1枚，另一長不發育。種子呈橢圓形，一側扁平或微彎曲。有少數果實具兩個種子，其果實呈寬橢圓形，不彎曲，長徑7~10 ㎜，短徑5~6 ㎜，表面皺縮較少，種子呈橢圓形，兩種子結合面略平。聞起來味道有酸澀感<1>。. 圖女貞子(原生植物)(正品) (資料來源:林天樹. 老師傅鑑定中藥. 台灣金保安貿易有限公司出版). 5.

(8) 第二節. 研究背景與目的. 糖尿病(Diabetes mellitus；DM)，主要是因為人體內的胰島素(insulin) 分泌失衡，造成廣泛性代謝失調(包括碳水化合物、蛋白質、脂肪等三大營養素與電解質的代謝均受到干擾)所導致之高血糖<2>。其症狀包括多喝，多吃，多尿，體重減輕及特別容易覺得疲倦和會有復發性感染的現象；糖尿病可能發生於任何性別、年齡、種族及地區。糖尿病主要的臨床表現為血糖值持續高居不下、尿液經生化檢驗後發現其中含有葡萄糖等。其併發症包括會導致視網膜產生病變、周邊神經病變、腎藏病變、自律神經病變、小血管疾病，如高血壓、中風(腦溢血)、心血管疾病及酮酸尿等病症。因糖尿病與腦血管疾病、心臟病、高血壓常伴隨一同發生，而造成其病情難以控制，可見其嚴重性。糖尿病在大部份的現代化國家都排名在死亡原因的前十名<3>。根據世界衛生組織的統計，目前全球至少有1.71 億人，罹患糖尿病，預估到2030 年，這個數字還會增加一倍，糖尿病每年在全球奪走大約320 萬人性命<4><5>。目前，糖尿病在臨床上的分類，根據1997年美國糖尿病學會(ADA)所公佈可分為四種<6>： 1.第一型「胰島素依賴型」糖尿病(Type Ⅰ：Insulin-dependent diabetic mellitus；IDDM) 指胰臟蘭氏小島(Islet of Langerhans)的β細胞被破壞的一種自體免疫疾病，會導致酮酸血症的糖尿病。此類型的糖尿病特徵就是胰島素分泌缺乏，這類型病人必須注射施打外來的胰島素，來防止酮酸中毒。治療此類型糖尿病的目標在於維持血糖值在正常的範圍內，避免因血糖大幅度的波動而導致長期性的併發症。由於本類型糖尿病多發生於青少年時期，過去曾被稱為青幼年發病型糖尿病，但事實上可能發生於任何年齡。此類型的糖尿病病人血漿中胰島素濃度偏低，為維持體內葡萄糖的正常代謝，臨床上需用胰島素治療。 2.第二型「非胰島素依賴型」糖尿病(Type Ⅱ：Non-insulin dependent diabetic mellitus；NIDDM) 此類型的糖尿病病人大多數都會伴隨胰島素抗阻性(insulin resistance) 的出現；胰島素抗阻性的形成主因，是因為胰臟蘭氏小島的β細胞過度分泌胰島素，造成脂肪組織、骨骼肌及肝臟等周邊組織對於胰島素的敏感性降低；因而減低了組織對葡萄糖的利用率，造成高血糖的現象<7>。此類型的糖尿病較無酮酸中毒的傾向，但在嚴重感染或重大手術等因素下也會出現酮酸中毒的現象。有少部分病人會有胰島素分泌減少或分泌不足的現象，但大多數的病患分泌胰島素的能力尚可。且常見家族型發病，以中、老年人及肥胖者居多，過去曾被稱為「成年型糖尿病」。此類型的糖尿病病程早期並沒有典型的糖尿病症狀，所以不容易察覺，但卻常伴隨著高血脂、高血壓、糖尿病性大血管(如腦中風、心肌梗塞)、糖 6.

(9) 尿病性小血管(如眼網膜、腎臟及神經病變)等慢性併發症<8><9>。此類型的糖尿病大多只需要靠飲食控制及口服降血糖藥物控制血糖，而不用立即注射胰島素。目前，絕大部份糖尿病患均屬於第二型「非胰島素依賴型」糖尿病。 3.其他特定型糖尿病(Specific Types of Diabetes Mellitus) (1).其他細胞基因缺陷致功能不全。 (2).胰島素作用的基因缺陷。 (3).外分泌性胰臟疾病。 (4).內分泌異常。 (5).藥物或化學藥品引起。 (6).感染症。 (7).不常見的免疫性糖尿病。 (8).其他基因異常症候群合併糖尿病。 4.妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus;GDM）指的是婦女懷孕前沒有糖尿病的病史，卻因為懷孕而出現糖尿病症狀；通常在生產後這種糖尿病便會消失。這可能與懷孕期間荷爾蒙發生變化有關，使孕婦胰島素的抗阻性增加，顯得胰島素分泌不足。如果懷孕前即患有糖尿病，則不屬於妊娠糖尿病。目前，Type I、II糖尿病尚屬於不能被治癒的慢性病，雖然從醫用胰島素出現後，糖尿病可以獲得良好的治療和控制，但研究發現，糖尿病病人的症狀裡有許多是只靠著胰島素所無法改善的。為了讓病患能有更多用藥的選擇，及期望能更有效的控制血糖來防止長期糖尿病併發症的發生，糖尿病用藥的研發工作是目前眾所注目的，然而在中醫用藥上已被證實對於糖尿病症確有其療效。傳統中醫在治療糖尿病方面，將糖尿病歸類於「消渴症」的範疇，其意為「消瘦、煩渴」。傳統中醫認為消渴症的治療，以滋陰、清熱、生津為法。近年，在中藥的研究發展上發現，其降血糖作用溫和且效果持久、副作用甚小，中藥在降血糖作用機制整理如下<10>： 1. 能增加胰島素敏感性，降低胰島素的拮抗作用：胰島素拮抗作用是 Type II 糖尿病發病機制的重要環節和特徵，多數此類型患者體內並不缺乏胰島素，而是單位胰島素的生物效應降低，以及胰島素敏感性下降。 2. 能提高胰島素的含量，降低胰臟升糖素：胰臟升糖素與胰島素互為拮抗，是體內主要的正性調節血糖的激素，促進醣類代謝。. 7.

(10) 3. 能抑制食物中葡萄糖的吸收：抑制腸道 α-澱粉酶，延緩蔗糖分解及降低血糖作用。 4. 能清除自由基和抗脂質過氧化作用：糖尿病病患體內會產生大量的氧自由基，會導致內皮細胞損傷，而使內皮素(endothelin)分泌增多，造成胰島細胞的特異性傷害。本研究目的是針對傳統中醫改善糖尿病症狀的中草藥來加以研究，利用抑制 α-glucosidase 活性之篩選模式，選取適當的植物進行更深入的成份研究。而由初步活性篩選得知，「女貞子」的甲醇抽出物(LLM)對 α-glucosidase 的抑制率約為 38.1％。去除 tannin 之後其抑制率可達 100.0％。雖然在 2009 年就有學者研究指出女貞子的多醣成份對α-glucosidase 有抑制作用<11>，但可能只是因為其多醣成份被α-glucosidase 分解後，造成能抑制α-glucosidase 的現象，並不能就此確定女貞子中有降血糖活性的就是多醣成份，且由初步活性篩選的結果，甲醇抽出物中的多醣成份應非為主要成份，故仍需進一步研究真正有降血糖活性的成份。本研究以活性為導向進行降血糖的活性導引分離，針對女貞子具有降血糖作用的部份進行研究，探討其所含成份及藥理作用。. 8.

(11) 第二章第一節. 女貞屬植物之研究現況. 女貞屬植物之藥理與藥效. 女貞子，別名女貞、冬青子、鼠梓子。女貞子能滋養肝腎之陰，為一味清補的藥品。主治：陰虛內熱，腰膝軟弱，目昏耳鳴，心悸，便秘，鬚髮早白等症。近代研究顯示女貞子化學成份具有以下藥理活性：一､降血糖: 2009 年張捷平等人發表女貞子多醣成份對α-glucosidase 有抑制作用<11>。二､抗氧化: 1991 年 Balanehru, S.等人發表 ursolic acid(99)有抗氧化作用<12>。 1994年 Godwin, O. I.等人發表luteolin(18)具抗氧化活性<13>。 2001 年 Yim, T. K.等人發表 ursolic acid(99)和 oleanolic acid(100)具抗脂質過氧化之功用<14>。 2003 年 He, Z. D.等人發表 secoiridoid glucosides 能消除自由基作用<15>。 2001年 Wong, I. Y. F.等人發表acteoside(87)和ligupurpuroside A(51)能保護低密度脂蛋白(LDL)不被氧化<16>。 2002年 Chen, Z. Y.等人發表lipedoside A-I(34)、 lipedoside A-II(35)、 lipedoside B-V(38)及lipedoside B-VI(39)能保護低密度脂蛋白(LDL)不被氧化 <17> 。 2002年 Chen, Z. Y.等人發表lipedoside A-I(34)、 lipedoside A-II(35)、 lipedoside B-V(38)及 lipedoside B-VI(39)具抗氧化活性<17>。 2004年 Eliandra, D. S.等人發表kaempferitrin(14)具抗氧化能力<18>。 2008年盛瑋等人發表女貞子多醣成份具抗氧化活性<19>。三､抗癌: 1994 年 Young, H. S.等人發表 ursolic acid(99)有抗突變性<20>。 1994 年 Huang, M. T.等人發表 ursolic acid(99)有抗致癌作用<21>。 9.

(12) 1998 年 Lee, K. H.等人發表 ursolic acid(99)對血癌、肺腺癌細胞有毒殺作用 <22> 。 2002 年 Li, J.等人發表 oleanolic acid(100)能抑制腫瘤細胞的增殖<23>。 2004 年 Ovesna, Z.等人發表 oleanolic acid(100)能抑制腫瘤血管形成<24>。 2007 年金雪瑛等人發表 apigenin(17)能夠抑制人乳腺癌細胞 VEGF 的表現<25>。 2008 年李璘等人發表女貞子多醣成份具抑制實體腫瘤生長的作用<26>。四､減少病原蟲: 2000 年 Traore, K. F.等人發表 ursolic acid(99)能減少病原蟲增殖<27>。五､治療中樞神經系統疾病: 2001 年 Kim, E. K.等人發表 ursolic acid(99)可用於治療老人癡呆症<28>。 2006 年Sung S. H.發表(8Z)-nuezhenide A(90)、 (8E)-nuezhenide(74)、 (8Z)-nuezhenide(75)、 oleonuezhenide(91)、 osmanthuside B(32)及 osmanthuside D(31)具保護人類神經SH-SY5Y細胞活性<29>。六､肝臟保護作用: <30> 2001 年 Martin, A. S.等人發表 ursolic acid(99)對肝損傷有保護作用。 2001年 Yim, T. K.等人發表ursolic acid(99)和oleanolic acid(100)具保肝之功用<14>。七､抗菌和抗病毒: 1999 年 Giuseppe, B.等人發表 oleuropein(63)在體外有抗菌活性<31>。 2001 年 Ma, S. C.等人發表 secoiridoid glucosides 有抗病毒作用<32>。 2002 年 Chattopadhyay, D.等人發表 ursolic acid(99)有抗菌和抗病毒作用<33>。 2004年 Zhu, X.等人發表cinaroside(12)有抗真菌活性<34>。八､免疫調節: 2006 年馮英傑等人發表 ursolic acid(99)具有免疫調節作用<35>。九､其他藥理活性: 1996年 Toshihiro, A.等人發表lupeol(107)、 taraxerol(99)有明顯抗發炎作用<36>。. 10.

(13) 1999 年Park, K. Y.等人發表cosmosiin(11)、 apigenin(17)及luteolin(18)能抑制Interleukin (IL)-5<37>。 2001 年 Lanza, A.等人發表 salidroside(8)在體外有抗發炎能力<38>。 2007 年陸景坤等人發表 apigenin(17)對心肌細胞有保護作用<39>。 2007 年唐寧等人發表 luteolin(18)可明顯抑制發炎反應<40>。 2009 年隋海霞等人發表 apigenin(17)有降低血壓的作用<41>。. 11.

(14) 第二節. 女貞屬植物之成分回顧. 根據女貞屬文獻記載，其成份包含生物鹼類（Alkaloids）、苯類（Benzenoids）、黃酮類（Flavonoids）、糖類(Saugars)、環烯醚萜類（Iridoids）、裂環烯醚萜類(Secoiridoids)、三萜類(Triterpenes)及其它(Others)等。茲將上述分類之化合物結構整理列出於下：. Alkaloids: N OCH3 O 5-ethyl-nicotinic acid methyl ester(1)<42> N OCH3 O 5-ethyl-4-methyl-nicotinic acid methyl ester(2)<43>. N. N. O O. OCH3. jasminin(3)<44> O. OCH3. N H3CO. N O. 4-methyl-5,5'-[(1-methyltrimethylen)di](methylnicotinate)(4)<45>. 12.

(15) O. OCH3. N H3CO. N O. 4,4'-bis-methyl-5,5'-[(1-methyltrimethylen)di](methylnicotinate)(5)<45>. N OCH3 O. O O. HO p-hydroxy-β-phenethyl 5-ethyl-3-methoxycarbonyl-4-pyridinylacetate(6)<46>. HO. OH. HO O. OH O N O O. O. LA9(7)<45>. 13. OCH3.

(16) Benzenoids: OH OH O HO. O HO. OH. salidroside(8)<47> OH HO tyrosol(9)<48>. HO. OH OH. 2-(3',4'-dihydroxyphenyl)ethanol(10)<49>. Flavonoids: OH OH O O. HO HO. O. OH OH. O <50>. apigenin 7-O-glucoside(11). 14.

(17) OH OH. O HO. O. HO. O. OH. OH OH. O. cinaroside(12)<51>. OH HO. O. O HO. O. O OH HO. OH. apigenin 5-O-glucoside(13)<52>. OH HO. O O. HO. O OH. OH. O OH. O. OH O OH. kaempferitrin(14)<53>. 15.

(18) OH O HO. O HO. O. HO. OH. OH. O OH. O. O. OH. HO kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside(15)<54>. OH. HO. O. HO. OH. O OH. O. OH. O HO. astragalin(16)<55> OH HO. O. OH. O. apigenin(17)<56>. 16.

(19) OH OH HO. O. OH. O. luteolin(18)<57>. OH. HO. OO. O. OO OH HO OH. HO. OH. OH. O. apigenin-7-O-rutinoside(19)<58> OH O. O. O HO. HO. OH HO. OH OH. O OH. O. O. quercetin 3,7-dirhamnoside(20)<58>. 17. OH.

(20) OH O HO. O. O. OH OH. OH OH O. OH. O. OH O. OH. OH <58> quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside(21) OH HO. O O OH. O. OH. O. OH OH afzelin(22)<69> O OH. O O HO. O. O. OH HO. O HO. O. OH. O. OH OH acetic acid (2R,3S,4S,5R)-3,4,5-trihydroxy-6-[5-hydroxy-2(4-hydroxy-phenyl)-4-oxo-3-((3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy6-methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-4H-chromen-7-yloxy]tetrahydro-pyran-2-ylmethylester(23)<58>. 18.

(21) HO. O. HO. OH. O OH. O. O. HO. O. O OH. OH. O. OH. O. OH OH ligustroflavone(24)<58>. Saugars:. OH O HO. O HO. O. OH. cinnamoyl-β-D-glucose(25)<60>. 19.

(22) HO HO. O HO. O. OH O. HO. OH O OH. O HO. O OH. acteoside-1(26)<61>. OH H. OH. H. OH. HO. H. HO. H OH. mannitol(27)<62> OH HO. OH. HO. OH OH. myoinoitol(28)<63>. 20.

(23) O OH. O O HO. HO. O OH. O O OH HO. OH. osmanthuside B6(29)<64> O O OO. HO. OH. HO HO. OH. O O OH HO HO OH acteoside-2(30)<65>. OH. HO O O. O HO O. O OH. O OH. HO. OH. osmanthuside D(31)<66>. 21.

(24) OH. HO. O. O O. O HO. OH. O. O. OH HO. OH. osmanthuside B(32)<67>. OH OH HO. O O O. O. O HO. O. OH. H HO. OH. osmanthuside (33)<68>. HO OH O. HO. O O. O. O HO. O. OH. H HO. OH. lipedoside A-I(34)<68>. 22. OH.

(25) HO. O. HO. O O HO. O. O HO. O. OH. H HO. OH. lipedoside A-II(35)<68> OH. O O O HO. O. O HO. O. OH. H HO. OH. lipedoside B-II(36)<68>. 23. OH.

(26) HO. O O O HO. O. O HO. O. OH. H HO. OH. lipedoside B-III(37)<68>. OH. OH O O O. OH. O. O. OH. HO. O. OH. H HO. OH. lipedoside B-V(38)<68>. OH HO. O O O O. OH O. HO. OH. H HO. OH. O. OH. lipedoside B-VI(39)<68><70>. 24.

(27) OH. HO O O HO. O. O O. OH OH. O. OH OH (E)-3-(4-hydroxy-phenyl)-acrylic(2R,3R,4R,5R,6R)-5-hydroxy6-((2E,5E)-7-hydroxy-3,7-dimethyl-octa-2,5-dienyloxy)-2hydroxymethyl-4-((2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5- trihydroxy-6methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-tetrahydro-pyran-3-yl ester(40)<69>. HO O O HO. O. O O. O OH. O. OH OH ligurobustoside C(41)<69>. 25.

(28) HO O O. O. O O. HO. H OH OH. O. OH OH (E)-3-(4-hydroxy-phenyl)-acrylic acid(2R,3R,4R,5R,6S)6-((S)-1,5-dimethyl-1-vinyl-hex-4-enyloxy)-5-hydroxy-2hydroxymethyl-4-((2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-tetrahydro-pyran-3-yl ester(42)<69>. OH O HO O HO. O OH. O OH. OH (2S,3R,4R,5R,6S)-2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-2-((E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyloxy)-3,5-dihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydropyran-4-yloxy]-6-methyl-tetrahydro-pyran-3,4,5-triol(43)<69>. 26.

(29) OH. O. O O HO O. HO. O OH. O OH. OH ligurobustoside E(44)<69> OH. O. O. OH O. HO O HO. O OH. O OH. OH (E)-3-(4-hydroxy-phenyl)-acrylic acid(2R,3R,4S,5R,6R)3,5-dihydroxy-6-((E)-6-hydroxy-3,7-dimethyl-octa-2,6-dienyloxy)4-((2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran2-yloxy)-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl ester(45)<69>. 27.

(30) OH OH OH O O. O O. HO. OH. O OH. O OH. OH (E)-3-(4-hydroxy-phenyl)-acrylic acid(2R,3R,4R,5R,6R)-6-((E)6,7-dihydroxy-3,7-dimethyl-oct-2- enyloxy)-5-hydroxy-2hydroxymethyl-4-((2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyltetrahydro-pyran-2-yloxy)-tetrahydro-pyran-3-yl ester(46)<69> OH HO OH O O. O O. HO. O OH. O OH. OH (E)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid(2R,3R,4R,5R,6R)-6((E)-3,7-dimethyl-octa-2,6-dienyloxy)-5-hydroxy-2-hydroxymethyl4-((2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran2-yloxy)-tetrahydro-pyran-3-yl ester(47)<69>. 28.

(31) OH. OH O O. O. O OH. O. O. HO. OH. O. O. HO. OH OH. C37H54O16(48)<69> OH OH OH O O O O. O O. OH. O. HO. O HO. OH. HO. OH. cis-ligupurpuroside B(49)<67>. 29.

(32) OH. HO O HO. O O O. O O. OH. O. HO. O HO. OH. HO. OH. trans-ligupurpuroside B(50)<67>. OH OH HO. HO O. HO. O O O. O O. OH. O. HO. O HO. OH. HO. OH. ligupurpuroside A(51)<67>. 30.

(33) O O O. HO. O. HO. OH. OH. O. O. HO. OH. OH OH lipedoside A-II(52)<70> OH. HO. HO O. HO. O HO. HO O. O. O O. HO. OH. OH. ligurobustoside M(53)<64> OH. OH OH O. O O. O. O HO. O HO. OH. OH ligurobustoside I(54)<64>. 31.

(34) OH. OH O. O O. O. O. O HO. O HO. OH. OH ligurobustoside O(55)<64> OH OH. OH. OH HO O. O HO. O. O. O. O HO. O. O HO. OH. OH. ligurobustoside N(56)<64>. 32.

(35) Iridoids:. O. OH. H HO. O. OH. H O. HO. O. OH OH. 7-epi-loganic acid(57)<71>. O. OH. H O O. O. HO. H O. HO. O. OH OH. 8-epi-kingisidic acid(58)<71>. 33.

(36) OCH3. O H3CO. O. O. HO. OH. O. OH O. OH OH. 10-benzoyloxyoleoside dimethyl ester(59)<72>. Secoiridoids:. OH O HO. O HO O. HO. O HO. H OH anatolioside(60)<68>. 34.

(37) OH O HO O. O. HO. OH. O H OH. HO. lipedoside B-1(61)<68>. O. OH. HO O. O. OH O. O. HO. OH OH. secologanoside(62)<72> HO O. O. HO. O. O O. HO. OCH3. OH OH. O. OH oleuropein(63)<73>. 35.

(38) H HO. OCH3. O. O. OH O HO. O OCH3 O. OH. oleosid-7-methylester(64)<74>. OH O HO. O. O. O OH HO. O. O. OH. O OCH3. HO. OH. O. OH. nuezhenide(65)<53> OH OH O H3CO. O OO O O HO. O. O O OH. HO. OH. O. O O OCH3. OH HO. OH. O. secoiridoid glucoside GL3(66)<53>. 36. OH. O OH.

(39) HO. OH. O. OH. O. O O. O. OH. O OCH3 HO ligstroside(67)<53> OH HO O. OH O. O. O HO. O O. OH. HO OH OH isosyringalide 3'-α-L-rhamnopyranoside(68)<70>. HO. O O. OCH3. O. OH. O. OH O. OH OH. jaspolyside(69)<75>. 37.

(40) O. OCH3. O HO. O. O. HO. OH. O. OH O. OH OH. 10-hydroxyligstroside (70)<76>. O. OCH3. O O. HO. O. O OH. H O. HO. O OH. OH ligustaloside B(71)<87>. 38.

(41) HO HO. O. O. OCH3. O H. O. O. OH OH. O O. OH. HO 10-hydroxyoleuropein(72)<87> HO O. HO. OCH3. O. O. O. OH OH. O O. OH OH. ligustaloside A(73)<77>. 39.

(42) O O. O. HO. H3CO O O HO. HO HO. O. OH O. O. OH HO. (8E)-nuezhenide(74)<78> HO O HO. H3CO. O. O. O. HO OH. O. O O. OH O. HO (8Z)-nuezhenide(75)<79> O. O O. OH. OCH3. HO O. OH. O. OH O. OH OH. lucidumoside A(76)<80>. 40. OH. OH.

(43) O O O. HO. OCH3. O O. HO O. O. HO HO. OH. ligustaloside B(77)<81> HO O O. HO. OCH3. O. O O. HO O. O. HO HO. OH. ligustaloside A(78)<81>. O. O O. OCH3. HO O. OH. OH. O. OH O. OH OH. lucidumoside B(79)<68>. 41.

(44) OH HO. O O. O. O. OCH3. O HO. O. OH. O. OH O. OH. OH OH. isonuezhenide(80). <75>. OH. HO. O O. O. HO. OCH3. O O O. OH. O. OH O. OH. OH. OH OH neonuezhenide(81)<75>. HO. O O. OH. O O. OH OH. O. OH OH. oleoside dimethyl ester(82)<80>. 42.

(45) O O. O. OCH3. HO O. OH. O. OH O. OH OH. ligustroside(83)<80> H3CO. O. O O. OCH3. H3CO O O. OH OH. O. OH OH. lucidumoside D(84)<80>. 43.

(46) H3CO. O O. O. OCH3. H3CO O. OH. O. OH O. OH OH. oleuropein(85)<80>. O. O O. O. H3CO. OCH3. H3CO O. OH. O. OH O. OH OH. lucidumoside C(86)<80>. OH HO OH HO. OH. O O O. O. O HO. O HO. OH. OH. acteoside(87)<80>. 44.

(47) HO. OH. O. O O. O. OCH3. O OH O HO. OH. O. OH O. OH OH. isonuezhenide(88)<80> HO HO O. OH O. O. O O. OCH3. O OH OH. OH. O. OH O. OH OH. neonuezhenide(89)<80>. 45.

(48) OH HO. OH. O. HO. O OCH3. O O O. O. OH OH. O O. OH. HO (8Z)-nuezhenide A(90)<66>. O. OCH3. O O HO. O. O. HO O. OH. O O. O. O. OH. OH OH. HO. O. O O OH. HO OH. O OH. OCH3. oleonuezhenide(91)<66>. 46.

(49) OH HO. HO O. OH. H3CO. O. O. O. O. O O. 2-(4-hydroxyphenyl)ethyl 6-O-{[(2R,3R,4R)-3-formyl-3,4-dihydro-5-(methoxycarbonyl)-2methyl-2H-pyran-4-yl]acetyl}-β-D-glucopyranoside(92)<75> OH O. HO. O. O O O. O OH. HO OH. HO O. OH. H3CO. O. O. O. O. H3CO. O O. 2-[4-({[(2R,3E,4R)-3-ethylidene-2-(β-D-glucopyranosyloxy)-3,4dihydro-5-(methoxycarbonyl)-2H-pyran-4-yl]acetyl}oxy)phenyl]ethyl 6-O-{[(2R,3R,4R)-3-formyl-3,4-dihydro-5-(methoxycarbonyl)-2methyl-2H-pyran-4-yl]acetyl}-β-D-glucopyranoside(93)<75>. OCH3. O O. O. HO. O O. O OH. O. OH HO O O. OH O. OH methyl (2R,3E,4R)-4-[2-(4-{2-[(6-O-acetyl-β-Dglucopyranosyl) oxy]ethyl}phenoxy)-2-oxoethyl]-3-ethylidene-2-(β-Dglucopyranosyloxy)3,4-dihydro-2H-pyran-5-carboxylate(94)<85>. 47. OH.

(50) OCH3 HO O. HO. OO. OCH3. O. HO O HO. O H. HO. OH OH. (2''R)-10-hydroxy-2''-methoxyoleuropein(95)<82> OCH3 HO O. HO. OO. OCH3. O. HO O HO. O H. HO. OH OH. (2''S)-10-hydroxy-2''-methoxyoleuropein(96)<82>. 48.

(51) Triterpenes:. H O. HO. H. O. HO. H. OH OH. β-sitosterol-β-D-glucosid(97)<83>. H. H HO. H. taraxerol(98)<84>. H OH H HO. O. H. ursolic acid(99)<85>. 49.

(52) H OH O. H HO. H. oleanolic acid(100)<86>. H H HO stigmasterol(101)<83>. O O. OH O acetyl oleanolic acid (102)<83>. 50.

(53) H OH. H. O HO. H oleanolsaeure(103)<87>. OH O. H O. H CH3(CH2)14O. OH O. OH. H. (4aS,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-Hexadecanoyloxy-2,2,6a,6b,9,9,12aheptamethyl-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-octadecahydro-2Hpicene-4a-carboxylic acid(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-trihydroxy-tetrahydro-pyran-2-ylester(104)<88>. O(CH2)14CH3. O. H CH3(CH2)14O. H. C83H146O10(105)<88>. 51. OH. O. H. O. O(CH2)14CH3.

(54) H OH O CH3(CH2)nCO. O. H H. ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)<89>. HO. lupeol(107)<90>. O CH3(CH2)nCO. lupeol long-chain fatty acid ester(108)<90>. Others:. H H HO. β-sitosterol(109)<91>. 52.

(55) CH3(CH2)24CH2OH n-hexacosanol(110)<92>. O HO. OH OH. 10,16-dihydroxy-hexadecanoic acid(111)<93>. 53.

(56) 第三章材料與方法第一節儀器與材料 1. 紫外線光譜儀：使用Hitachi UV-3210 型紫外線光譜儀測定，均以甲醇作溶劑，石英槽管徑長度為1 公分，sh 表示肩帶峰(shoulder)。 2. 紅外線光譜儀：使用Shimazu FTIR-8501 型紅外線光譜儀測定。 3. 核磁共振光譜儀：使用Bruker AC-200 型，Varian unity plus 400 型核磁共振光譜儀，測定氫光譜與碳光譜，並以值表示化學位移，單位為ppm。s 表示單峰(singlet)；d 表示雙重峰(doublet)；t 表示三重峰(triplet)；q 表示四重峰(quartet)；br. 表示寬峰(broad)；dd 表示兩組雙重峰(double doublet)；dt 表示兩組三重峰 (double triplet)；m表示多重峰(multiplet)。 4. 薄層層析片：薄層層析片為使用Merck，Silica gel 60 F254 (Art 5715)。 5. 管柱填充劑：使用之矽膠為Silica gel (70-230 mesh, ASTM, Merck)。 6.Kojic acid購自Sigma chemical co.。 7.DPPH購自Sigma aldricm co.。 8.L-ascorbic acid購自MERCK.。 9.Mushroom Tyrosinase購自Sigma chemical co.。. 54.

(57) 第二節女貞子果實成份之抽取及分離將購自藥廠的女貞子果實1公斤以甲醇萃取5次，由甲醇萃取液經減壓濃縮除去溶劑，得到初抽物(LLM)，依序以氯仿和水進行分配萃取，再利用 α-glucosidase抑制活性測定篩選適當的分配萃取層，選定fraction進行細部分離。 Isolation and separation of Ligustrum lucidum The fruit of Ligustrum lucidum (1Kg). extracted with MeOH( x 5 ) filtered crude ext. concd.. concd CHCL3 Layer(101.80g) α-glucosidase 抑制率為 46.2% DPPH 抑制率為 43.1%. concd H2OLayer(56.98g) α-glucosidase 抑制率為 4.8% DPPH 抑制率為 58.8%. 其中水層之沉澱物以再結晶法處理後生成一針狀結晶，與文獻比對無誤後確認為. mannitol(27) 。. 女貞子之萃取與分離流程圖. 55.

(58) 氯仿層之萃取與分離流程圖. 56.

(59) 第四章女貞子化合物之構造研究女貞子經矽膠管柱層析與薄層層析方法細部分離後，得到 9 個化合物，經結構鑑定後與文獻比對確認，分別為五環三萜類- oleanolic acid、3-acetyl oleanolic acid、ursolic acid、ursolic acid long-chain fatty acid ester、 lupeol、lupeol long-chain fatty acid ester。以及其它類 β-sitosterol、 mannitol、aliphatic alcohol。主成分介紹<94>: 三萜類化合物可視為六分子異戊二烯聚合而成，在中草藥中分佈很廣，是萜類化合物中最多的一類，多以游離狀態或成苷或成酯形式存在於自然界。其中五環三萜皂苷:有A、B、C、D、E五環，C10、C8、C14、C17有側鏈取代，多為甲基，有時甲基可氧化為-CH2OH、-CHO、-COOH等，C4為偕二甲基。C3-β-OH，但也有C3-α-OH。. 20. 19 12. 11 1 2 3. 10. A 4. B 5. 8 7. 18E. 13. C. 9. D 14. 21 22. 17 16. 15. 6. 圖五環三萜類化合物骨架再根據E環可將五環三萜皂苷分為以下幾類: 1．β-香樹脂烷(β-amyrane)型又稱齊墩果烷(oleanane)型。其結構特點是A與 B、B與C、C與D環均為反式稠合，D與E環為順式；基本母核為22個碳原子。C23 、 C24 和C29 、C30均為甲基分別連接在C4 和C20位。. 30 19. 2. 20 21 18E 22. 12 13 11 17 25 26 D 9 1 14. A 10B 3 4 5 6 24 23. 29. 8 15 27 7. 28. 16. 57.

(60) 2．α-香樹脂烷(α-amyrane)型又稱烏蘇烷(ursane)型或熊果烷型。與β-香樹脂烷型不同之處是E環上C29、C30甲基分別連接在C19、C20位上。. 30 29. 12 13 11 17 25 26 1 9 14D 2. 10 A B 3 4 5 6 24 23. 21. 19 20 18E. 8 15 27 7. 22. 16. 28. 3．羽扇豆烷(lupane)型，特點是E環為五元環，在C19位上有α-構型的異丙烯基或異丙烷取代。. 29 20 30 21 11 25 1 9. 12 26. 13. 19E 18 D17. 22 28. 16 14 10 8 15 A B 27 3 4 5 7 6 24 23. 2. 58.

(61) 第一節 oleanolic acid(100)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得白色片狀結晶。UV光譜於 220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.1-1)在1456、1686cm-1出現雙鍵、羰基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。由 H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.1-2)顯示，在δ0.75, 0.77, 0.91, 0.92, 0.95, 0.98, 1.13 有 7 根單峰甲基的特徵吸收訊號。顯示本化合物應為齊墩果烷型的五環三萜衍生物。在δ5.24(1H, br )出現 H-12 的烯類質子之吸收訊號。在 2.80(1H, d, J=9.4 Hz, H-18)之吸收訊號，推測是 H-18 受到Δ12, 13 的雙鍵及 C-28 上的羧基影響而往低磁場移動。此外，在δ3.19(1H, dd, J=4.8,11.2 Hz, H-3) 出現 H-3 的特徵訊號，由其偶合常數值可推測 C-3 的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為oleanolic acid(100)，經與文獻光譜數據比對<95>，確認此化合物。 1. 30. 25 3 HO. H. 12 H. 18. 26. 17. 29. OH 28 O. 27. H 23 24. oleanolic acid(100). Fig.1-1 oleanolic acid(100)之 IR 光譜. 59.

(62) Fig.1-2 oleanolic acid(100)之 1H NMR 光譜. 60.

(63) 第二節 3-acetyl oleanolic acid(102)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末，可溶解於氯仿。UV光譜於220-800nm無明顯吸收， IR光譜(Fig.2-1)在1463cm-1出現雙鍵的吸收;1704cm-1 、1696 cm-1 出現兩個羰基的吸收;在 3300 cm-1 -2400 cm-1出現寬廣的羧基吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈現一鮮豔紫紅點，加熱後過一段時間，紫紅色的點會轉變成灰藍色，推測為三萜類化合物。由 H NMR(300MHz, CDCl3)(Fig.2-2)顯示，在δ0.71, 0.82, 0.83, 0.90, 0.91, 0.96, 1.07 有7根單峰甲基的特徵吸收訊號。顯示本化合物應為齊墩果烷型的五環三萜衍生物。在δ5.21 (1H, br, H-12)出現H-12的烯類質子之吸收訊號。在δ2.80(m)之吸收訊號，推測是H-18受到Δ12, 13的雙鍵及C-28上的羧基影響而往低磁場移動。此外，在δ2.02(3H, s )及δ4.44 (1H, t, J=7.8 Hz, H-3)為C-3位置有乙醯取代基之質子吸收特徵，H-3受乙醯基影響而往低磁場移動。綜合以上資料推測，此結構為 1. 3-acetyl oleanolic acid(102)，經與文獻光譜數據比對<96>，確認此化合物。 30 12 25. AcO. 26 H. 3. H. 29. 18 17. OH 28 O. 27. H 23 24. 3-acetyl oleanolic acid(102). Fig.2-1 3-acetyl oleanolic acid(102)之 IR 光譜. 61.

(64) Fig.2-2 3-acetyl oleanolic acid(102)之 1H NMR 光譜光譜. 62.

(65) 第三節 ursolic acid(99)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末，不易全溶解於氯仿。UV光譜於220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.3-1)在1461、1690cm-1出現雙鍵、羰基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈現一鮮豔紫紅點，加熱後過一段時間，紫紅色的點會轉變成灰藍色，推測可能為三萜類化合物。由 H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.3-2)顯示，在δ0.71,0.74, 0.78(3H,d , J=4.1 Hz, H29),0.79, 0.85(3H, d , J=4.4 Hz, H-30),0.93,0.99 有 5 根單峰甲基及 2 根雙峰甲基的特徵吸收訊號，顯示本化合物應為熊果烷型的五環三萜衍生物。δ5.25(1H, br, H-12) 出現 H-12 的烯類質子之吸收訊號。在δ2.17(1H, d, J=10.9 Hz, H-18) 推測是 H-18 受到Δ12, 13 的雙鍵及 C-28 上的羧基影響而往低磁場移動。在δ 3.21(1H, brd, J=10.7 Hz, H-3)，出現 H-3 的特徵訊號，由其偶合常數值可推測 C-3 的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為 ursolic acid(99)，經與文獻光譜數據比對<95>，確認此化合物。 1. 29 30 12 25. H. 26. 18. OH. 17. 28. O. H. 3. HO. 27. H. 23 24. ursolic acid(99). Fig.3-1 ursolic acid(99)之 IR 光譜 63.

(66) Fig.3-2 ursolic acid(99)之 1H NMR 光譜. 64.

(67) 第四節 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末。 UV光譜於220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.4-1) 在1462、1702 cm-1出現雙鍵、羰基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。由 H NMR(300MHz, CDCl3)(Fig.4-2)顯示，在δ0.73,0.78, 0.85(3H,d , J=3.4 Hz, H29), 0.94(3H, d , J=5.7 Hz, H-30),1.02, 1.05, 1.13 有 5 根單峰甲基及 2 根雙峰甲基的特徵吸收訊號，顯示本化合物應為熊果烷型的五環三萜衍生物。在δ 5.34(1H, br, H-12)出現 H-12 的烯類質子之吸收訊號。在 δ2.31(1H, t, J=7.4 Hz, H-18)，推測是 H-18 受到Δ12, 13 的雙鍵及 C-28 上的羧基影響而往低磁場移動。此外，δ4.47(1H, t, J=7.2 Hz, H-3)為 H-3 之質子訊號，推測是 H-3 受酯類取代基影響而往低磁場移動。另在δ1.25(br)及在 δ2.49(2H, t, J=10.7 Hz)，出現 long-chain fatty acid 的特徵吸收，推測應是 C-3 的長鏈酯基。綜合以上資料 1. 推測，此結構為 ursolic acid(99) long-chain fatty acid ester(106)，經與文獻光譜數據比對<89>，確認此化合物。本化合物為首次由女貞子分離得到。 29 30. 25 O CH3(CH2)nCO. H. 3. 12 H. 18. 26. 17. OH 28 O. 27. H 23 24. ursolic acid long-chain fatty acid ester(106). Fig.4-1 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)之 IR 光譜 65.

(68) Fig.4-2 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)之 1H NMR 光譜. 66.

(69) 第五節 lupeol(107)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得白色針狀結晶。UV光譜於 220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.5-1)在1456、3355 cm-1出現雙鍵、羥基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。由 H NMR(300MHz, CDCl3)(Fig.5-2)顯示，在δ0.76, 0.78, 0.82, 0.94, 0.96, 1.02有6根單峰甲基及δ1.63(3H,s,H-30)為雙鍵旁甲基的特徵吸收訊號，顯示本化合物應為羽扇豆烷型的五環三萜衍生物。在δ4.56 (1H,s,H-29b)及δ4.60 (1H, s,H-29a)為末端雙鍵之特徵吸收訊號。另在δ2.35(1H,td,J=5.6,11.2 Hz, H-19) 受亞甲基及H-18之影響進而分裂成td型式，又受其旁雙鍵影響出現在較低磁場。此外，在δ3.16(1H, dd,J=5.2, 10.9 Hz, H-3)出現H-3的特徵訊號，由其偶合常數值可推測C-3的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為 lupeol(107)，經與文獻光譜數據比對<90>，確認此化合物。 1. 29 19. 30. 18 26. 25. HO. 3 23. 28 27. 24. lupeol(107). Fig.5-1 lupeol(107)之IR光譜. 67.

(70) Fig.5-2 lupeol(107)之 1H NMR 光譜. 68.

(71) 第六節 lupeol long-chain fatty acid ester(108)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末。UV光譜於220-800nm無明顯吸收，IR光譜(Fig.6-1) 在1380、1456、1732cm-1出現雙鍵、酯基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈粉紅色，推測為三萜類化合物。由 H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.6-2)顯示，在δ0.76, 0.80, 0.84, 0.95, 0.97, 1.05 有 6 根單峰甲基及δ1.67(3H,br,H-30)為雙鍵旁甲基的特徵吸收訊號，顯示本化合物應為羽扇豆烷型的五環三萜衍生物。在δ4.56(1H,s,H-29b)及δ 4.67(1H,s,H-29a)為末端雙鍵之吸收訊號。在δ2.33(1H,td,J=5.9,16.7 Hz, H-19)受亞甲基及 H-18 之影響進而分裂成 td 型式，又受其旁雙鍵影響而往低磁場移動。此外，在δ4.44(1H, dd, J=5.7,10.7 Hz H-3)推測為 H-3 之吸收訊號， H-3 受酯類取代基影響而往低磁場移動。另在 δ1.24(br)及δ2.26(2H, t, J=7.4 Hz)出現 fatty acid 的特徵訊號，推測 C-3 為 long-chain fatty acid ester 1. 取代。綜合以上資料推測，此結構為 lupeol long-chain fatty acid ester(108)，經與文獻光譜數據比對<90>，確認此化合物。 29 19. 30. 18 25 O CH3(CH2)nCO. 3 23. 26. 28 27. 24. lupeol long-chain fatty acid ester(108). Fig.6-1 lupeol long-chain fatty acid ester(108)之 IR 光譜 69.

(72) Fig.6-2 lupeol long-chain fatty acid ester(108)之 1H NMR 光譜. 70.

(73) 第七節 β-sitosterol(109)之構造研究以管柱層析得到一白色粉末，再以氯仿及甲醇再結晶得無色片狀結晶。UV 光譜於 220-800nm 無明顯吸收，IR 光譜(Fig.7-1)在 1379、1456、3355cm-1 出現雙鍵及羥基的吸收。薄層層析以硫酸為顯色劑加熱呈紅色點，推測可能是固醇類化合物。由 H NMR(400MHz, CDCl3)(Fig.7-2)顯示，在 0.67(3H, s, H-18) 1. 0.78 (3H, d , J=7.0 Hz H-27), 0.82(3H, d , J=7.0 HzH-26), 0.89(3H, t, J=7.2 Hz H-29), 0.96(3H, d , J=7.0 Hz H-21), 1.00(3H, s, H-19)有 6 根甲基的特徵吸收訊號，顯示本化合物應為固醇類。在δ5.34(1H, d, J= 5.2 Hz, H-5)出現 H-5 的烯類質子之吸收訊號。在δ3.52(1H, m, H-3 )出現 H-3 的特徵訊號，由其偶合常數值可推測 C-3 的羥基取代應為β型示。綜合以上資料推測，此結構為 β-sitosterol(109)，經與文獻光譜數據比對<91>，確認此化合物。 29 21. 26. 18 27. 19. HO. 3. H 5. H. β-sitosterol(109). Fig.7-1 β-sitosterol(109)之 IR 光譜. 71.

(74) Fig.7-2 β-sitosterol(109)之 1H NMR 光譜. 72.

(75) 第八節 mannitol(27)之構造研究反覆以氯仿及甲醇再結晶得無色針狀結晶。UV 光譜於 220-800nm 無明顯吸收。由 H NMR(400MHz,D2O)(Fig.8-1)顯示，因其結構對稱性，僅剩4組相互偶合之訊號，在δ3.72 (2H, dd, J=5.8,11.6 Hz)、δ3.80 (2H, ddd,J=2.5, 5.8, 8.4 Hz)、 δ3.85 (2H, d, J=8.4 Hz)及δ3.92 (2H, dd, J=2.5, 11.6 Hz)推測本化合物應為(CHOH-CHOH-CH2OH)2之結構。綜合以上資料推測，此結構為mannitol(27)，經與文獻光譜數據比對<97>，確認此化合物。 1. 。 OH 1 H H HO HO. OH. 2 3 4 6. 5. OH H H. OH. mannitol(27). Fig.8-1 mannitol(27)之 1H NMR 光譜 73.

(76) 第五章女貞子藥理活性研究之萃取及劃分在本研究將針對由女貞子植物所分離得到的成分，進行α-glucosidase抑制活性的篩選以及清除DPPH自由基活性活性測試。. 第一節降血糖活性測試實驗步驟: a、α-glucosidase：配製α-glucosidase 0.4U/ml b、 PNPG：配製 0.7 mM PNPG 溶液 c、待測樣品 100λ加入α-glucosidase 100λ，溫浴 10min d、加入 PNPG 溶液 100λ，繼續溫浴 20 min e、測量 400nm 之 OD 值【各劃分層之活性測試】利用α-glucosidase抑制活性進行實驗測定。如表所示，有氯仿層(LLC) 及氯仿層的第4個fraction(LLC-4) 、第5個fraction(LLC-5) 、第6個 fraction(LLC-6) 、第7個fraction(LLC-7)和第8個fraction(LLC-8)有良好的活性。利用此結果，再進一步作細部分離，取得有效化合物。. 74.

(77) 第二節清除DPPH藥理活性測試實驗步驟: a、配製 1mM DPPH 甲醇溶液 b、取 100λ之待測樣品，加入 100λDPPH 溶液，室溫下避光靜置 5 分鐘 c、使用光度計檢測 517nm 之吸光值 d、計算清除率【各劃分層之活性測試】利用清除DPPH進行實驗測定。如表所示，有氯仿層(LLC)及氯仿層的第10 個fraction(LLC-10)、第11個fraction(LLC-11)、第14個fraction(LLC-14)、和水層(LLW)有良好的活性。利用此結果，再進一步作細部分離，取得有效化合物。. 75.

(78) ITEM. α-glucosidase. DPPH. Positive control. 25.0% (Acarbose). 30.0%(Vit C). LLC. 46.2%. 43.1 %. LLW. 4.8%. 58.8 %. LLC-1. 13.6%. -. LLC-2. 9.1%. -. LLC-3. 23.5%. -. LLC-4. 29.5%. -. LLC-5. 34.9%. -. LLC-6. 98.4%. -. LLC-7. 94.4%. -. LLC-8. 53.6%. -. LLC-9. 19.0%. -. LLC-10. -. 10.2%. LLC-11. -. 7.7%. LLC-12. 17.6%. -. LLC-13. 16.7%. -. LLC-14. 13.0%. 43.8%. LLC-15. 10.0%. 表各劃分層藥理活性測試數據. 76.

(79) 第六章結論女貞子氯仿層萃取物經矽膠管柱層析與TLC片檢測合併後，得到15個劃分層。將這15個劃分層，分別進行α-glucosidase抑制活性篩選、清除DPPH自由基活性測試。測試結果:第4、5、6、7、8劃分層有良好的α-glucosidase抑制活性;第10、11、14劃分層有不錯的DPPH自由基清除活性。再將對α-glucosidase抑制活性較好的第3、4、5、6、7、8劃分層先做細部的純化分離。共得到9個化合物，經結構鑑定後與文獻比對確認，分別為五環三萜類- oleanolic acid(100)、3-acetyl oleanolic acid(102)、ursolic acid(99)、ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)、lupeol(107)、 lupeol long-chain fatty acid ester(108)。及其它類-β-sitosterol(109)、 mannitol(27)及aliphatic alcohol(110)。. 77.

(80) 附錄一植物的萃取與分離將購自藥廠的女貞子果實1公斤以甲醇萃取5次，由甲醇萃取液經減壓濃縮除去溶劑後，得到初抽物(LLM)199.36克，再依序以氯仿和水進行分配萃取，得到氯仿層萃取物(CHCL3 Layer)101.8克及水層萃取物(H2O Layer) 56.98 克。其中於水層萃取物發現有沉澱物反覆以再結晶法處理後生成一針狀結晶，與文獻比對無誤後確認為mannitol(27)(0.51g)。再利用α-glucosidase抑制活性測定篩選適當的分配萃取層，選定氯仿層萃取物(α-glucosidase抑制率為46.2%; DPPH抑制率為43.1%)進行細部分離。以矽膠管柱層析分離，氯仿與甲醇(CM=29：1）為沖提液，再加入甲醇漸增極性沖提，經收集濃縮得到各劃分層(fractions)，再經以TLC片檢測合併後得到15個劃分層。第 3 個劃分層，以矽膠管柱層析分離，正己烷與乙酸乙酯(NE=9:1)為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 14 個劃分層。其中 3-2 劃分層，以矽膠管柱層析分離，正己烷與乙酸乙酯(NE=29:1)為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 9 個劃分層，於 3-2-2 劃分層得到一白色粉末為 lupeol long-chain fatty acid ester(108)(0.39g)。第 4 個劃分層，以矽膠管柱層析分離，氯仿為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 7 個劃分層。其中 4-2 劃分層經再結晶法得到一白色粉末為 lupeol(107)(13.89g)，為首次於女貞屬中發現之化合物。4-3 劃分層，以矽膠管柱層析分離，正己烷與乙酸乙酯(NE=4:1)為沖提液，再加入乙酸乙酯漸增極性沖提，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 5 個劃分層。其中 4-3-1 劃分層經再結晶法得到一白色粉末為 aliphatic alcohol(110)(0.69g)。4-5-1 劃分層經再結晶法得到一白色粉末為 3-acetyl oleanolic acid(102)(0.30g)。第 5 個劃分層，以矽膠管柱層析分離，氯仿為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 6 個劃分層。其中 5-2 劃分層經再結晶法得到一透明片狀結晶為 β-sitosterol(109)(0.58g)。5-5 分層經再結晶法得到一白色粉末為 ursolic acid long-chain fatty acid ester(106)(0.38g)。第 6 個劃分層，先以多次再結晶法、反覆抽氣過濾，得到一淡黃色粉末。剩餘母液以矽膠管柱層析分離，氯仿與甲醇(CM=29：1）為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以 TLC 片檢測合併後得到 12 個劃分層。其中 6-7 劃分層經再結晶法得到一透明片狀結晶，為 oleanolic acid(100)(0.39g)。第8個劃分層，先以多次再結晶法、反覆抽氣過濾，得到一白色粉末。剩餘母液以矽膠管柱層析分離，氯仿與丙酮(CA=4：1）為沖提液，經收集濃縮得到各劃分層，再經以TLC片檢測合併後得到6個劃分層。其中8-2劃分層經再結晶法得到一白色粉末為ursolic acid(99)(0.69g)。. 78.

(81) 附錄二光譜數據 oleanolic acid(100) Colorless powder. MP: Formula: C30H48O3 IR(KBr)νmax :1456、1558、1686、2938cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 300 MHz）δ： 0.75,0.77,0.91,0.92,0.95,0.98,1.13(7XCH3) 2.80(1H, d, J=9.4 Hz, H-18) 3.19(1H, dd, J=4.8,11.2 Hz, H-3) 5.24(1H, br, H-12) 3-acetyl oleanolic acid(102) Colorless powder. MP: Formula: C32H50O4 IR(KBr)νmax :1245、1365、1463、1696、1704、2945 cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 300 MHz）δ： 0.71, 0.82, 0.83, 0.90, 0.91, 0.96, 1.07 (7XCH3) 2.02(3H, s ) 2.80(m, H-18) 4.44 (1H, t, J=7.8 Hz, H-3) 5.21 (1H, br, H-12) ursolic acid(99) Colorless powder. MP: Formula: C30H48O3 IR(KBr)νmax :1461、1690、2928、3580 cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ： δ0.71,0.74, 0.78(3H,d , J=4.1 Hz, H29),0.79, 0.85(3H, d , J=4.4 Hz, H-30),0.93,0.99(7XCH3) 2.17(1H, d, J=10.9 Hz, H-18) 3.21(1H, brd, J=10.7 Hz, H-3) 5.25(1H, br, H-12). 79.

(82) ursolic acid long-chain fatty acid ester(106) Colorless powder. MP: IR(KBr)νmax :1215、1462、1702、2848、2916、3355cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 300 MHz）δ： 0.73,0.78, 0.85(3H,d , J=3.4 Hz, H29), 0.94(3H, d , J=5.7 Hz, H-30),1.02, 1.05, 1.13 (7XCH3) 1.25( br ) 2.31(1H, t, J=7.4 Hz, H-18) 2.49(2H, t, J=10.7 Hz) 4.47(1H, t, J=7.2, Hz, H-3) 5.34(1H, br, H-12) lupeol(107) Colorless powder. MP: Formula: C30H50O IR(KBr)νmax : 1379、1456、2849、2916、3355cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 300 MHz）δ： 0.76, 0.78, 0.82, 0.94, 0.96, 1.02, 1.63(3H, s, H-30)(7XCH3) 2.35(1H, td,J=5.6, 11.2 Hz, H-19) 3.16(1H, dd,J=5.2, 10.9 Hz, H-3) 4.56(1H, s, H-29b) 4.60(1H, s, H-29a) lupeol long-chain fatty acid ester(108) Colorless powder. MP: IR(KBr)νmax : 1174、1380、1456、1732、2853、2925cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ： 0.76,0.80,0.84,0.95,0.97,1.05,1.67(7XCH3) 1.24(br) 2.26(2H, t, J=7.4 Hz) 2.33(1H, td,J=5.9, 16.7 Hz, H-19) 4.44(1H, dd, J=5.7, 10.7 Hz H-3) 4.56(1H, s, H-29b) 4.67(1H, s, H-29a). 80.

(83) β-sitosterol(109) Colorless powder. MP: Formula:C29H56O IR(KBr)νmax : 1379、1456、1637、2849、2916、3355 cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ： 0.67(3H, s, H-18) 0.78(3H, d , J=7.0 Hz H-27) 0.82(3H, d , J=7.0 HzH-26) 0.89(3H, t, J=7.2 Hz H-29) 0.96(3H, d , J=7.0 Hz H-21) 1.00(3H, s, H-19) 3.52(1H, m, H-3) 5.34(1H, d,J=5.2 Hz H-5) mannitol (27) Colorless needle. MP: Formula: C6H14O6 1 H-NMR（D2O, 400MHz）δ： 3.72 (2H, dd, J=5.8, 11.6 Hz) 3.80 (2H, ddd, J=2.5, 5.8, 8.4 Hz) 3.85 (2H, d, J=8.4 Hz) 3.92 (2H, dd, J=2.5, 11.6 Hz, H-1, H-6 ) aliphatic alcohol(110) Colorless powder. MP: Formula: CH3(CH2)nCH2OH IR(KBr)νmax : 1215、1462、2848、2916 cm-1 1 H-NMR（CDCl3, 400 MHz）δ： 0.86(3H, t, J=7.0 Hz) 1.25(br) 1.53(4H, m) 3.62(2H, t, J=6.6 Hz). 81.

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