2、中樞投予 bumetanide，於行為測試後杏仁核 內 ERK1/2 蛋白質表現量分析結果：(圖十六)

實 驗 大 鼠 中 樞 投 予 vehicle 或 ERK 磷 酸 化 抑 制 劑 bumetanide，經過高台曝露處理後立即給予五分鐘強迫游泳測 試，測定藥物對類憂鬱傾向之強迫游泳行為表現是否造成影響。

並利用西方墨點法分析杏仁核中 ERK 之磷酸化表現，以探討 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 對大鼠杏仁核中 ERK 磷酸化表 現量的影響。其結果顯示 DEX -vehicle 組之 ERK1 磷酸化表現 量(p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與實驗結 果 3-2 相符)、 control-bumetanide 組及 DEX-bumetanide 組 ( p<0.05， p<0.05， p<0.05 )。DEX -vehicle 組之 ERK2 磷酸化 表現量 (p-p42)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與 實驗結果3-2 相符)、 control-bumetanide 組及 DEX-bumetanide 組 ( p<0.05 ， p<0.01 ， p<0.05 ) 。 control-vehicle 組 與 control-bumetanide 組、DEX-bumetanide 組之 ERK1 磷酸化表現 量 (p-p44)佔總量之比例無顯著差異，而 p-ERK2 (p-p42)也無顯 著差異，顯示投予 bumetanide 能抑制 DEX 組之大鼠面對急性 壓力時杏仁核中 ERK 之磷酸化異常升高的情況。

第四章 討論

Dexamethasone (DEX)在臨床上之使用十分廣泛，最常使用在抗 發炎的反應上，因此市售的許多消炎藥膏的成分內都含有 DEX，市 售許多DEX 針劑也常用於風濕性關節炎的治療。 此外，過去二十年 來 DEX 也被使用在治療早產兒新生時期的發炎反應，或因肺部發育 不良而產生之肺部疾病 (Cummings et al., 1989；Sanders et al.,1994)。

但陸續有報導指出於新生時期接受 DEX 投藥治療的早產兒，在日後

雖然表徵上生長發育並不會造成永久性的不良影響，不過我們希 望更深入探討新生期投予 DEX 是否影響中樞神經中，對於 DEX 易 感性較高的核區功能是否造成長期甚至不可回復的影響。由於 DEX 是人工合成之醣皮質固醇激素，其在動物體內的作用機轉與壓力調節 相關之激素 glucocorticoid 類似，故可影響體內與調節情緒壓力有關 的下視丘-腦下腺-腎上腺壓力反應軸 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis , HPA axis)的恆定機制。由於新生鼠在出生後前兩週處於壓力刺 激低反應期（stress hyporesponsive period），其體內對壓力反應的機制 尚未成熟，無法調控中樞系統糖皮質固醇類激素的代謝與恆定。在中 樞神經系統中，許多參與調控急性壓力反應核區例如:下視丘旁室核 以及邊緣系統中的海馬迴與杏仁核等部位皆存在著大量的糖皮質固 醇類受器 (glucocorticoid receptor, GRs)，因此，於壓力刺激低反應期 前期使用 DEX 很有可能是藉由影響 HPA 軸的激素作用，對神經系

力激素之受器 GR 大量表現的核區，特別是下視丘與杏仁核這些參與

條件化恐懼之行為模式 (conditioned fear)中以非條件化之電刺激配 合 條 件 化 之 聲 光 刺 激 給 予 壓 力 ， 可 以 觀 察 動 物 恐 懼 記 憶 的 形 成 (Miserendino et al.,1990； Fanselow and LeDoux, 1999； LeDoux, 2000)。

而近期研究亦指出，於條件化恐懼形成的過程中，若投予GR 致效劑，

高於control 組，表現出類憂鬱 (depression-like behavior)的行為 (洪，

視 丘 投 射 至 側 杏 仁 核 的 神 經 投 射 路 徑 thalamic-lateral nucleus of amydala pathway (簡稱 thalamic-LA pathway)有密切的關係 (LeDoux, 2000)。如對動物投予 ERK 的抑制劑，可阻礙其條件化恐懼記憶的獲 刺激誘發 thalamus-LA pathway 的 LTP 後，DEX 組大鼠對於相同刺 激強度下比 control 組有更強的反應，於紀錄完畢後取下兩個核區的

利用ERK 磷酸化抑制劑 PD98059，在電生理中對腦片進行表面灌流 後，以進一步確認 ERK 的磷酸化表現量對 thalamus-LA pathway 神 經活性的影響。結果顯示在低劑量的 PD98059 灌流下，兩個組別同

理的方式觀察在低劑量 bumetanide 灌流下對兩組動物 thalamus-LA pathway LTP 的影響。由結果發現低劑量 bumetanide 灌流下，其效果 與 PD98059 之效用相類，顯示 bumetanide 對 ERK 磷酸化表現的抑 量下 (subthreshold dose)的 PD98059 並不會影響正常老鼠的行為表

現，但能使新生期投予 DEX 大鼠的類憂鬱行為明顯减少，且杏仁核 中 ERK 磷酸化表現量與 control 組相較也沒有顯著的差異，此結果 符合利用胞外電生理測試所做的推論相符。由於 PD98059 不能作為 臨床上的治療藥物使用。因此我們才選用另一種 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 進行相同的實驗。雖然 bumetanide 的藥理作用並非專一的 影響 ERK 的磷酸化表現量，但是，臨床用藥已經過長期試驗，對於 人體使用的安全劑量與有效劑量有完整的參考量表，能更安全的使用 於臨床治療用途。然而，我們利用尾靜脈注射的方式從周邊投藥的方 式給予實驗大鼠 bumetanide，卻發現在能有效抑制 ERK 磷酸化的致 效劑量下，對大鼠可能有生理毒性，大鼠於施打後會出現血尿的情形，

甚至嚴重影響其運動功能。由於bumetanide 除了能調控 ERK 活化之 分子路徑，亦能作用於腎絲球遠端腎小管的 NKCC1 channel，因此周 邊投予 bumetanide 也可能對動物體內水分調節、腎小管通透性等其 他 生 理 功 能 造 成 影 響 ， 增 加 行 為 實 驗 不 可 掌 握 的 變 因 。 為 釐 清 bumetanide 與類憂鬱行為之分子路徑作用的關係，我們改用中樞投予 藥物的方式，排除 bumetanide 可對周邊投藥可能產生之其他副作用。

結果顯示， bumetanide 對行為的影響也可以改善 DEX 組大鼠之類 憂鬱的行為，DEX 組大鼠於強迫游泳的行為測試中，不游動的時間 比例明顯降低，與 control 組大鼠在統計上無顯著差異。蛋白質表現

量 分 析 結 果 也 同 樣 顯 示 ERK 磷 酸 化 表 現 量 受 到 抑 制 ， 投 予 bumetanide 的 DEX 組大鼠與 control 組 ERK 磷酸化表現量無明顯差 異。此結果能提供臨床上治療憂鬱症新的用藥參考，然而其非專一性 與副作用的問題仍有待進一步的檢測。

總結本研究結果可以歸納出以下結論：行為上可看到新生期投予 DEX 對大鼠面臨急性壓力時的行為反應有持續性的長遠影響，大鼠 憂鬱行為表現與杏仁核 ERK 磷酸化表現量有密切的關聯性。腦中視 丘投射至側杏仁核之路徑在動物因應急性壓力反應時，扮演重要的調 控功能。透過 ERK 磷酸化抑制劑的投予，可以部份的改善憂鬱行為 表現。然而，為何新生期經短期藥物，其藥效對動物之影響能持續這 麼長的時間，其中作用的機轉尚未釐清，且 DEX 的投予可能改變動 物醣類代謝、壓力激素恆定性等多重變因的影響，非單一因素所造成，

因此相關的機制仍值得深入探討。而本研究所發現的相關分子路徑與 神經投射路徑，對於幼年時期遭受不良經驗影響產生之情緒疾病，能 提供為研究造成情緒性疾病的機轉與臨床上治療情緒性疾病時參考 的依據。