利用大白鼠模式探討新生期投予 Dexamethsone 對成年期憂鬱行為的影響

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 利用大白鼠模式探討新生期投予 Dexamethsone 對成年期憂鬱行為的影響 The effects of neonatal dexmethasone treatment on depressive-like behavior in adult rats. 研究生：許惠喻 Hui-Yu Hsu 指導教授：呂國棟博士 Kwok-Tung Lu, Ph.D.. 中華民國 102 年 1 月.

(2) . 摘要人類於新生期所面對的心理或生理壓力，會對成年期的情緒表達或生理狀況產生深遠的影響。 Dexamethasone ( DEX ) 是一種人工合成醣皮質激素，在臨床上常用於治療早產兒因肺部發育不良而引發的呼吸窘迫症現象，可提高早產兒的存活率，但近期的研究卻顯示高劑量以及長期的使用卻可能對其產生不良的影響。在動物模式中，大鼠新生期投予 DEX 可能導致其青少年期空間記憶產生障礙，亦會干擾海馬迴 ( hippocampus ) 中長期增益效應 (long-term potentiation, LTP) 的形成。而這些不良影響在成年時逐漸得到改善。然而先前本實驗室的研究卻顯示，新生時期投予 DEX 的成年大鼠在強迫游泳行為 (forced swimming test, FST )模式中會產生類憂鬱行為的反應。顯示新生期 DEX 的投予對動物面臨急性壓力時的反應具有長期影響。然而，此現象涉及哪些神經投射路徑的調控與分子路徑的活化，是值得深入探討的議題。因此，本研究利用 Wistar 大鼠，模擬臨床上投藥的方式，於出生後第一至第三天，以皮下注射的方式的投予遞減劑量的 DEX (0.5 mg/kg, 0.3 mg/kg and 0.1 mg/kg)，於動物八週齡時進行各項行為實驗，以西方墨點法 (western blotting)與中樞投予 ERK 抑制劑，釐清 DEX 投予對情緒記憶的分子機制所造成的改變。並利用胞外電生理探討其對相關神經投射路徑活性的影響。研究結果發現，在 FST I .

(3) . 行為模式中，新生期投予 DEX 的動物不游動的時間明顯較長，且杏仁核 ERK 磷酸化程度顯著的高於控制組動物。ERK 抑制劑的投予能有效降低 DEX 組動物不游動的時間，顯示 ERK 的磷酸化程度與動物不游動的時間具有高度的正相關性。胞外電生理記錄結果發現，以高頻電刺激誘發的 LTP 訊號，新生期 DEX 組大鼠在視丘投射至側杏仁核的神經訊號值明顯高於控制組大鼠，當利用 ERK 磷酸化抑制劑灌流後，能使神經路徑過度活化的現象回復，顯示此路徑中 ERK 磷酸化的程度在調控動物面臨急性壓力時的生理反應扮演重要角色。本研究結果有助於瞭解新生期 DEX 的投予對動物成年期時面臨急性壓力時，神經投射路徑與分子活性的影響，並提供研究急性壓力反應的調控機制與臨床治療藥物開發的參考。. 關鍵字：Dexamethasone、Extracellular signal-regulated kinases、HPA 軸、長期增益效應、高台暴露、強迫游泳、杏仁核。. II .

(4) . Abstract Numerous literatures indicate that stress exposed and medication experience in early postnatal can produce subtle changes in brain maturation, which will resulted in long-lasting behavioral changes when they were exposed to novelty stress in the later period of life. Synthetic glucocorticoid dexamethasone (DEX) is frequently used to lessen the progression of chronic lung disease in premature infants. Recent studies suggest that neonatal DEX treatment impair brain development and cognitive functions. In this study, forced swimming test (FST) were applied to evaluate the effect of neonatal DEX treatment on amygdale function in adulthood. Rats were subjected to receive subcutaneous injection of tapering doses of DEX (0.5 mg/kg, 0.3 mg/kg and 0.1mg/kg) from postnatal day 1 to 3 (PN1~PN3). Behavior test were took place at the age 8 weeks. Since previous studies shown that the immobility behavior during FST was regulated by MAPK signal pathway in amygdale,. the. MAPK/ERK. phosphorylation. in. amygdale. were. investigated. Several researches imply that thalamic paraventricular nucleus (PVN) is activated by acute stress and the project to forebrain structures such as amygdale implicated in processing stress-related information. Possibility of neonatal DEX treatment effect on neurocircuit participates in the depression-like behaviors was studied by extracellular recording. Our results showed increasing of the immobility time in neonatal DEX treatment rats comparing with control group. Western blot analysis also showed that the amygdala phospho-ERK level in neonatal DEX treatment III .

(5) . rats was higher than that in control rats. Intra-cerebroventricular infusion of ERK inhibitor PD98059 suppressed immobility time of neonatal DEX treatment rats during FST. No significant different in amygdale phospho-ERK level between each group which infused with PD98059. The high frequency stimulation induced LTP was significantly greater in neonatal DEX treatment rats than in control rats. These results suggest that DEX treatment in the neonatal period can induce a long-lasting synaptic plasticity effect in the circuit from the paraventricular thalamic nucleus to the lateral nucleus of amygdale, and ERK activation might be involved in the formation of depression-like behaviors.. Key words: amygdale; Dexamethasone; exposed of flat-top; forced swimming test; Extracellular signal-regulated kinases; hypothalamo–pituitary–adrenal axis (HPA axis); long-term potentiation. IV .

(6) . . 目次. 中文摘要-------------------------------------------------------------------. I. 英文摘要-------------------------------------------------------------------. III. 目次------------------------------------------------------------------------. V. 第一章. 緒論-------------------------------------------------------------. 1. 第二章. 研究方法-------------------------------------------------------. 13. 第三章. 結果-------------------------------------------------------------. 29. 第四章. 討論-------------------------------------------------------------. 59. 參考文獻------------------------------------------------------------------. 67. 附錄. 75. V .

(7) . 第一章緒論一、幼年期不良經驗 (adverse childhood experiences)與情緒疾病 (emotional illness)之關聯動物在胎兒時期與新生時期，其發育過程易受各種環境因素影響，而且這些影響對於動物通常會有長期性的效果。以人類的研究為例，生理上的影響可以看到，因胎兒時期營養不良或早產，可能會增加其成年罹患心血管疾病的風險 (Fanaro, 2010)。在心理學及精神醫學的研究上也發現，許多患有情緒性精神疾病病患回溯其成長過程中，多曾經歷母親於懷孕時期承受過重大壓力事件，或有不當使用藥物的記錄。此外，幼年期經歷的負面事件 (negative events)，例如遭受虐待 (severe physical abuse)、強迫性行為 (sexual contact)、嚴重忽視 (severe neglect)或不良的親子關係也會嚴重影響心理發展 (Meaney et al., 1996； Weaver et al., 2004； Noorlander et al., 2006； Varese et al., 2012)，不僅易罹患情緒性的精神疾病，得到肥胖症、心血管疾病及自體免疫疾病的機率也較高 (Felitti et al, 1998； Silva and Maia, 2007)，綜合上述的觀案結果，均顯示不良的幼年經驗，會造成極深遠的影響。但以人類為受試的個案研究(case study)常缺乏再現性，且易受其成年後的生活環境及經驗所影響。因此近年來的研究多以動物實驗為主，利用新生兒隔離 (neonatal isolation)、母子分離 (maternal separation)、 1 .

(8) . 或母親照顧不當的老鼠或靈長類動物模式進行實驗，也證實這些動物幼體成長至青春 (adolescence)和成年期 (adulthood)面臨壓力時，會產生異常的行為表現及生理反應 (Vanderschuren et al., 1997; Kamphuis et al., 2004)。正常情況下，動物在生理或心理上接受刺激所引起能自我覺察到的心理反應即為情緒 (emotion)。正常的情緒反應能夠使動物可因應環境變化而產生適當的行為反應，特別是當動物面臨生存壓力時，會使其產生出恐懼的情緒反應，因而能在「逃避或應對」間選擇適當的反應方式。但若動物面對環境變化而無法做出適當情緒反應，或其體內機能無法調節因情緒變化而造成的失衡現象時，就可能會造成心理狀態失調，進而產生異常行為表現，此類因各種壓力造成情緒反應異常而導致的精神疾病，可統稱為情感性精神疾病 (affective disorder)。通常情感性精神疾病的產生，是因為患者經歷重大壓力事件後，無法調節心理與生理狀態回復到正常狀態所致。造成壓力的來源很多，可能來自於不良的環境條件、工作過度勞累、具傷害性醫療行為、使用藥物之副作用或疾病。為評估動物經情緒壓力而導致的異常行為，科學家發展出許多評估用的實驗模式，1977 年科學家 Porsolt 提出強迫游泳行為測試 (forced swimming test)的動物實驗，利用老鼠懼水的特性，將老鼠放入水中游泳，並記錄過程中老鼠不掙扎游動的時間 2 .

(9) . (immobility time)，若不掙扎游動的時間發生越早或持續越久將可視為動物具有憂鬱傾向的反應 (Porsolt et al, 1997; Huang and Lin, 2006)。以此科學家可以探討各種幼年時期遭遇壓力的動物模式與憂鬱傾向的關聯性，以幼年期遭受母子分離或照顧不當的老鼠為例，於成年時期進行強迫游泳實驗的結果顯示，幼年期的處理會造成其產生憂鬱傾向 (Musazzi et al., 2010)。科學家更進一步的探討體內調節機制的變化，發現影響情緒壓力的調控與體內下視丘-腦下腺-腎上腺壓力反應軸 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis , HPA axis)密切相關 (Aisa et al., 2007) 。. 二、人工合成醣皮質素 (Dexamethasone, DEX)用於治療早產兒呼吸疾病依據世界衛生組織定義，早產兒 (preterm infant)為懷孕週數介於 20 - 37 週初生之新生兒。根據衛生署統計，早產兒發生機率約佔新生兒總數的 10 %。由於早產兒各種器官發育不成熟，因此致病率與死亡率特別高。相較足月的新生兒，早產兒較易罹患各種急、慢性早產兒合併症，其中急性併發症包括呼吸窘迫症 (respiratory distress syndrome； RDS)、腦室出血、周腦室白質軟化症、壞死性結腸炎、敗血症及開放性動脈導管等。長期併發症則包括腦性麻痺、智能遲緩 3 .

(10) . 及早產兒視網膜病變等。而統計資料顯示，約一半以上的極低體重早產兒需要靠呼吸器維持呼吸，文獻也指出妊娠少於 32 週出生的早產兒，日後罹患慢性肺部疾病 (chronic lung disease; CLD)的機率高達 40 - 50 % (Liggins and Howie, 1972; Chiswick, 1995) ，而呼吸窘迫症更是造成早產兒死亡的主因之一。1959 年， Avery 及 Mead 首先指出呼吸窘迫症的病因是由於第二型肺泡細胞 (alveolar type II pneumocyte) 發育不成熟，或早產時缺氧的狀況，使的肺泡表面張力素合成、儲存或釋放量減少，導致肺泡塌陷或擴張不全而造成換氣不足的情況。目前臨床上會使用人工合成醣皮質激素 dexamethasone (DEX) (圖一) 來治療肺呼吸窘迫症的早產兒。 DEX 是模擬體內分泌的醣皮質激素合成出來的藥物，與人體內部的皮質醇 (cortisol) 結構相似。在醫療上常做為消炎藥用以抑制許多疾病帶來的發炎反應。同時在臨床上也用來預防與治療早產兒的慢性肺部疾病。在早產兒出生後三天內的關鍵期給予治療，可以促進其肺泡細胞成熟，分泌足夠的表面張力素 (surfactant)，避免肺泡塌陷 (Lee et al., 2000; Lemons et al., 2001)，進而提高早產兒的存活率。然而，近年的研究顯示新生期給予 DEX 治療的早產兒有生長遲緩和神經發展落後的不良影響，而追蹤至學齡兒童時期則發現生長遲緩、神經運動功能不良、認知功能發育落後及顯著障礙比例上升等影 4 .

(11) . 響 (Sajaniemi et al., 2001; Stoelhorst et al., 2003)。在研究中常利用建立動物模式來評估新生期投予 DEX 對於腦部神經發育的影響。以大鼠模式為例，大鼠出生後 24 小時內定義為第一天 (postnatal day 1; P1)，其腦部發育相當於人類胎兒約懷孕期 22 - 24 週，出生後第二天 (postnatal day 2; P2)相當於人類胎兒約懷孕期 24 - 28 週，出生後第三天 (postnatal day 3; P3)相當於人類胎兒約懷孕期 29 週，至出生後第七天，大鼠的腦部發育趨近於成熟，相當足月出生 (38 - 40 週) 的胎兒大腦 (Dobbing and Sands, 1979)。這段期間為大鼠腦部發育重要階段，此時模擬臨床投藥的方式在大鼠出生後 P1 - P3 投予遞減劑量 (tapering dose)的 DEX，建立研究大鼠神經發育之模式。研究顯示，大鼠新生期投予 DEX 會影響其整體生長、神經發育、學習與記憶，以及面對外界壓力的耐受性，且被認為與學習及神經可塑性的調控有著密切關係 (Lin et al., 2006)。這些結果顯示新生時期投予 DEX，可能會長期的干擾動物體內壓力荷爾蒙調控，甚至會持續影響至成年後的行為與情緒反應。. 三、醣皮質激素 (glucocorticoid)與下視丘-腦下垂體-腎上腺機制 (hypothalamo-pituitary-adrenal axis; HPA axis) 當人體面對各種外在或內在環境因子影響，而感受到壓力時會使 5 .

(12) . 得身體做特定生理反應予以應對。壓力生理反應機制模式主要有「戰或逃」及「被動」兩種方式，前者由交感神經腎上腺髓質系統 (sympathetic adrenal medullary system) ，當面對緊急狀況時，透過活化腎上腺髓質系統能產生快速的動作反應，釋放大量腎上腺素和正腎上腺素進入循環系統，促進體內血糖濃度上升，使個體得以產生足夠的能量以對外進行「戰或逃」 (fight or flight)的反應。但當壓力長期存在時，則會活化人體內的邊緣系統 (limbic system)中的下視丘-腦下垂體-腎上腺機制予以應對，當危險狀況解決後亦須透過此機轉重建體內的恆定狀態. (Korte et al., 1995)。. 下視丘為腦部調節壓力反應的主要部位，當動物面對壓力時啟動 HPA 軸之機制，透過刺激下視丘 (hypothalamus)釋放促腎上腺皮質激素釋放激素 (corticotropin–releasing hormone； CRH)，作用於腦下垂體. (pituitary. gland) 使之釋放促醣皮質類固醇激素. (adrenocorticotropic hormone；ACTH)，因而促進腎上腺 (adrenal gland) 分泌醣皮質激素，主要為皮質醇 (cortisone)，可加速體內醣解作用速率，使血液中血糖濃度以及心跳速率增加，並暫時減弱免疫系統等方式，幫助動物應付外在壓力，為動物調節體內恆定的重要機制 (Nagano et al., 2008)。通常壓力源消失後， HPA 軸中負回饋機制會使生理功能回復原先的恆定狀態，不會對生理機能造成重大影響，但 6 .

(13) . 動物若長期處於壓力下，使調節壓力反應系統處於過度刺激活化，分泌過多醣皮質激素，則可能會對身體造成一定程度之傷害，可觀察到的負面影響包括容易肥胖、心血管疾病以及憂鬱等疾病的發生率。目前研究發現，在許多的器官和腦區中都存在皮質醇的接受器，其接受器可分為兩大類，一為醣皮質激素接受器 (glucocorticoid receptors; GRs)，另一種為礦物性皮質激素接受器 (mineralocorticoid receptors; MRs) (Reul and de Kloet, 1985)。在動物體內， MRs 對皮質醇的親和力約為 GRs 的 20 倍，一般認為正常情況下動物體內主要是由 MRs 偵測與維持體內皮質醇的基準濃度值。但當動物面臨突然的環境變化或壓力事件時，會增加皮質醇分泌量以進行壓力的調控，因而同時進一步活化 GRs，使 GRs 也同時參與壓力調控反應 (Weiser and Handa, 2009)。在許多情緒認知相關的腦區都可以觀察到有大量的 GRs 存在，例如：海馬迴 (hippocampus)、杏仁核 (amygdala)和前額葉皮質區 (prefrontal cortex；PFC)等，而這些腦區也都參與 HPA 軸機制之調控。當情緒認知腦區，如杏仁核、前額葉皮質區和腦幹之藍斑核 (locus coeruleus)受到皮質酮激素 (corticosteroids)過度刺激，將導致 HPA 軸機制活化失調，進而影響動物的情緒壓力反應 (Quirarte et al., 1997; Roozendaal, 2002; Fuchs et al., 2004)。而 DEX 由於結構與動物體內分泌之皮質醇類似，因此亦能參與 7 .

(14) . HPA 軸之機制。於早產兒腦部發育未成熟時期使用 DEX，會使早產兒體內壓力荷爾蒙調控受到干擾，而影響其正常發展，但 DEX 對 HPA 軸作用的詳細機制仍待探討。. 四、情緒記憶 (emotional memory)與杏仁核之長期增益現象 (long-term potentiation)的關聯情緒反應除了能讓動物在面對環境變化時，做出即時的適當反應，也與記憶息息相關。記憶是指對過去經驗的喚回和重現 (Tully et al., 2003)，透過獲得 (acquisition)、固化 (consolidation)、保留 (retention) 和提取 (retrieval)的步驟完成。情緒反應有助於記憶固化與保留 (McGaugh, 2005； Pelletier et al., 2005)，不同的情緒狀態能使動物更詳細的記憶當下情境細節，同時也因情緒而增強記憶的保留，在往後面對類似情境時，能更快速做出適當的行為反應。而情緒記憶的儲存也使動物在相同情緒下，容易回想起過往的經驗，甚至能更進一步的將不同情境與不同情緒的關聯性做編碼，使記憶網絡建立更為完善。在大腦中這些與情緒記憶相關的記憶工作主要是由杏仁核所負責，杏仁核被認為是大腦內調控情緒中樞之一，負責調節與壓力相關的情緒反應 (Ferry and McGaugh, 2000)，更與恐懼記憶的形成與削減關係密切 (Lin et al., 2001； Lin et al., 2003； Knapska et al., 2012)。在杏仁核中與恐懼記憶及壓力相關之神經投射路徑分別為：由視丘 8 .

(15) . (thalamus) 直接投射至側杏仁核. (lateral amygdala ，. LA) 的. thalamic-LA pathway (TH-LA)及聽覺皮質 (auditory cortex)間接投射至 LA 的 cortical-LA pathway，接受訊息傳入杏仁核，再由 LA 投射至基底外側核 (basolateral amygdala， BLA)進行記憶的調節與固化 (LeDoux, 2000)。為釐清記憶形成的機制，目前最常以1973年由 Bliss等人提出的長期增益效應 (long-term potentiation； LTP)的模式比擬記憶形成的過程。利用電生理實驗的方式，給予神經細胞高頻電刺激 (high-frequency stimulus； HFS)，誘發突觸可塑性，使原有的連結增強或產生新的連結，強化特定腦區接收新訊息或提取舊有記憶 (Bliss and Gardner-Medwin, 1973)。同時突觸前神經元 (presynaptic neuron) 釋放出興奮性神經傳導物質 (excitatory neurotransmitter)，如麩胺酸 (glutamate) ，與神經突觸後的. AMPA 接受器. (alpha-amino-3-hydroxy-5methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor)結合， AMPA接受器活化後開啟鈉離子通道使鈉離子流入突觸後神經元 (postsynaptic neuron)，使突觸後神經元膜電位上升，引發去極化 (depolarization)，並同時使突觸後神經元細胞膜上之另一種麩胺酸接受器 NMDA (N-methyl D-aspartate receptor)活化，使更多的鈉離子與鈣離子流入突觸後神經元內，其中鈣離子可與調鈣素 (calmodulin)結 9 .

(16) . 合形成 Ca2+-calmodulin complex ，啟動 Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM kinaseII)與 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (Impey et al., 1999)、 cyclic AMP- dependent protein kinase (PKA)、 cAMP response element-binding protein (CREB) (Wikström et al., 2003)等下游分子機制作用。而 MAPKs中的 extracellular regulated kinase (ERK1/2)活化可調控神經傳遞物質進入細胞核內影響基因轉錄，進而改變神經突觸之聯結，或是影響新生蛋白質的合成，最終可能導致行為表現受到影響，因此 ERK之分子路徑的調控被認為與學習、記憶以及神經的可塑性息息相關 (Mazzucchelli and Brambilla, 2000； Rodrigues et al., 2004)。近年來的臨床上的證據顯示，造成憂鬱情緒的病因與杏仁核有關。在精神疾病學的研究中，利用核磁共振攝影觀察首次罹患憂鬱症的病患，發現這些病患腦中杏仁核的體積比控制組較為擴大 (Frodl et al., 2002)；而在動物模式的研究中則發現，利用母子分離的早期壓力經驗處理老鼠，在強迫游泳實驗的急性壓力刺激下，可以觀察到其產生類憂鬱的行為，並且分析其杏仁核中 ERK的變化，發現 ERK磷酸化的現象顯著的高於正常老鼠，且若投予抑制劑降低 ERK活化，則可使有類憂鬱傾向的老鼠在強迫游泳行為測試中不游動的時間縮短，改善其類憂鬱的行為表現 (Huang and Lin , 2006)。顯示杏仁核調控壓 10 .

(17) . 力的路徑參與憂鬱情緒形成的過程可能與下游分子 ERK的活化有關。綜合以上討論，目前研究發現新生期投予 DEX 會影響 HPA 軸的反應機制，干擾動物面對壓力時的情緒記憶表現及生理反應。前人的研究已知道，新生期投予 DEX 不僅會導致大鼠的海馬迴突觸可塑性改變，也影響青春期空間記憶的表現。而本實驗室先前研究利用同樣的動物模式則發現，新生期投予 DEX 之大鼠，在面對急性壓力時會產生出類憂鬱行為。由於情緒記憶與大腦杏仁核區域有高度相關，新生期投予 DEX，使大鼠在成年時期面對急性壓力時產生異常的行為表現是否與杏仁核調節壓力的神經的投射路徑相關？且相關的分子機制是否是透過改變 ERK 磷酸化表現量來調控？因此本研究中選用兩種 ERK 磷酸化抑制劑進行探討，這兩種抑制劑分別為： PD98059 與 bumetanide。在許多離體實驗或體內實驗的研究證實 PD98059 對 MAPK kinase (MAPKK)的活性有專一的抑制效果，可抑制 MAPKK 的活性，使的 MAPKK 無法活化下游分子 ERK，因此可當作 ERK 之抑制劑使用 (Alessi et al., 1995)。另外 bumetanide 為細胞上兩種鈉離子 / 鉀離子 / 氯離子 - 共同運送蛋白 (Na+/K+/Cl-cotransporter， NKCC)的抑制劑。其中 NKCC1 在各種細胞上均有表現，且研究發現 NKCC1 能透過 Ras/ Raf/ Mek/ ERK 訊息傳遞路徑 11 .

(18) . (Ras/ Raf/ Mek/ ERK signal transduction pathway)調控 ERK 磷酸化，因此 bumetanide 亦能做為 ERK 之抑制劑使用 (Panet et al., 2006)。本研究利用新生期投予 DEX 之大鼠模式，觀察其成年後各種行為表現，以及透過離體電生理記錄的方法及蛋白質表現量分析，欲探討新生期投予 DEX 對杏仁核中分子路徑的影響，本研究之結果除可增進吾人對情緒記憶與 HPA 軸之關聯性之暸解外，因 DEX 為臨床之用藥，也將能提供臨床用藥之參考。. 12 .

(19) . 第二章研究材料與方法一、實驗動物 (Animals) 實驗中使用 Wistar 品系的公鼠，是利用 Wistar 品系的母鼠 (於進行實驗前自樂斯科生物科技股份有限公司購入)自行配種，待母鼠受孕後三週左右產下幼鼠，飼養至四週幼鼠離乳，再於各實驗所需年齡時進行實驗。實驗期間，動物飼養於國立臺灣師範大學生命科學系動物房，每日提供充足飲水及飼料，且維持飼養空間溫度約 23-26℃，室內照明採循環光暗調控 12/12 小時(早上九點半亮燈，下午九點半熄燈)，維護動物房清潔與照料實驗動物皆由專屬工作人員負責，於動物光週期時進行所有行為實驗。本研究所採用的研究方法經由國立臺灣師範大學實驗動物管理委員會審核通過後進行，並符合農委會所訂定之實驗動物使用規章。. 二、實驗藥品 (Drugs) 1. Dexamethasone (DEX) 購自於南光化學製藥股份有限公司。 2. 血管緊張素 II (angiotensin II) 購自於 SIGMA 大藥廠。 3. PD98059 購自於 abcam。 4. Bumetanide 購自於 SIGMA 大藥廠。 13 .

(20) . 三、幼年期藥物投予方式 (Drug administration) 每胎幼鼠依照體重及隻數大致分為控制及實驗兩組。在幼鼠出生後 1-3 天 (P1-P3)以皮下注射 (subcutaneous injection; s.c.) 的方式投予生理食鹽水 (控制組)及 DEX (實驗組)。記錄每週體重變化用以驗證投藥是否成功。實驗組 DEX 的投藥劑量按照過去文獻中所使用的方式：P1 (0.5 mg/kg)、P2 (0.3 mg/kg)、P3 (0.1 mg/kg)遞減投予 (Lin et al.,2006)。而控制組則對照實驗組給予相等體積的生理實驗水。. 四、電生理學記錄法 (Electrophysiological recording) 杏仁核腦薄片製備 A. 試劑 10X 人工腦脊髓液 (Artificial cerebrospinal fluid , aCSF) Stock NaCl. 68.45 g. KCl. 3.5 g. CaCl2. 2.78 g. MgCl2‧6H2O. 2.44 g 1.66 g. NaH2PO4‧H2O 加 ddH2O 至體積為 1 L 保存於 4 ℃中，一週內使用完畢 14 .

(21) . 1X 人工腦脊髓液 (Artificial cerebrospinal fluid , aCSF) NaHCO3. 2.1 g. Glucose. 1.98 g. 10X aCSF. 100 mL. 加 ddH2O 至體積為 1 L. B. 方法將大鼠以不鏽鋼動物斷頭台 (guillotine)斷頭犧牲。用剪刀剪開頭皮，再以骨剪剪去其頭蓋骨，用小鑷子挑破腦膜後，以取腦扁平器分離腦與神經之連結將腦取出，迅速放入供給 95 % O2 與 5 % CO2 混合氣體之 4 ℃人工腦脊髓液 (artificial cerebrospinal fluid , aCSF)。準備好鋪有濾紙之培養皿，倒入 aCSF 並供給混合氣體，再將腦放置於培養皿上，用解剖刀切除小腦，並將大腦對切分為左右腦，用快乾膠貼於載物台上，放置於震動切片機 (vibrotome)槽內，持續供應混合氣體。以水平切法 (horizontal section)將大腦切為厚度約 400 μm 之腦薄片 (brain slice)。將腦薄片靜置於充有混合氣體之 aCSF 內至少 1 小時後，進行後續實驗。. 15 .

(22) . 胞外電生理學記錄法 (Extracellular recording) 將切好之杏仁核腦薄片移至記錄槽 (recording chamber)內，將腦薄片以槽內尼龍格網固定，過程中利用循環式加熱器將 aCSF 溫度維持約 32℃，接著持續注入記錄槽內，使之覆蓋腦薄片。aCSF 灌流覆蓋之流速約每分鐘 2 mL，可視情況調整。接著透過 Grass S 88 刺激器 (Grass S 88 stimulator)，產生刺激訊號頻率為 0.033 Hz 之單向固定電壓。將雙極刺激電極放置在視丘 (thalamus)區域，記錄電極放置於側杏仁核 (lateral amygdale； LA) 區域 (圖二)，誘發突觸後興奮性電位 (field excitatory postsynaptic potential；fEPSP)。待興奮電位呈現穩定，開始記錄突觸基礎訊號 (baseline)。持續記錄 20 分鐘後，誘發長期增益效應 (long-term potentiation, LTP)。其誘發的模式為：給予三次持續一秒鐘 100 Hz 之高頻電刺激。每次刺激間隔 20 秒，再持續記錄一小時以上的變化。最後利用 pCLAMP 軟體 (version 10.0：Axon Instruments) 計算 fEPSP 之斜率以分析突觸訊號強度變化。. 16 .

(23) . 五、立體定位手術 (Stereotaxic surgery) 手術時利用 sodium pentobarbital (50 mg/kg, i.p.)麻醉動物，麻醉後剔除動物頭皮上方之毛髮，將其固定於立體定位儀上 (David Kopf instruments, Tujunga, CA)，並用酒精消毒頭皮。用刀片切開頭皮使頭蓋骨露出，以止血鉗將傷口擴張固定，在傷口處滴入數滴雙氧水，以消毒傷口並清除血污。接著確定座標 (bregma)位置後，於 bilateral ventricle (座標為 AP : - 0.4 mm ; DV : -4.2 mm ; LM : ± 1.5 mm from bregma)上方頭蓋骨鑽孔 (model C313G；Plastic Products, USA)，植入鋼釘於頭蓋骨上進行固定後，按照座標位置埋入鋼管，以牙科粉固定鋼管，最後將管蓋消毒後鎖入鋼管，以避免飼養時鋼管內部阻塞或感染。手術後的動物分開單獨飼養，動物於手術後一個禮拜確定其傷口癒合再進行後續行為實驗。. 六、中樞投藥方式 (central administration) 中樞給藥 (central administration)是利用立體定位手術配合微量注射針筒 (model 7105KH, Hamilton)及微量注射器 (model 102 microdialysis pump, CMA)投予藥物。投藥前先以毛巾包裹動物，防止其於注射期間掙扎逃走，並用 75 %的酒精消毒埋入鋼 17 .

(24) . 管周圍的頭皮。輕輕取下鋼管之管蓋，換插入消毒完的注射針，先靜候一分鐘後開始注射，利用微量注射器等速 (1 μL/min)注射，注射完畢後仍靜候一分鐘再緩慢取出注射針，並重新將消毒後的管蓋鎖回鋼管內，完成注射。. 七、注射位置之確定 (Verification of the injection site) A. 試劑 AngiotensinⅡ(1 μg /μL) AngiotensinⅡ. 10 mg. aCSF. 10 mL. 分裝後避光冷凍保存。. B. 方法動物於手術完後休養一個禮拜，在實驗前兩天利用上述之中樞給藥的方式，於兩側腦室分別投予血管張力素Ⅱ (angiotensin Ⅱ) 2 μL，若埋管位置正確植於側腦室內，會誘發實驗動物迅速產生喝水的反應。. 18 .

(25) . 八、行為測試 (Behavioral experiment) A. 自發性運動行為 (Locomotor activity) 為排除藥物投予後對動物之活動能力及自發性探索行為產生影響，進而改變大鼠的運動能力而影響後續行為的測試結果，故先進行此行為測試。方法如下：將老鼠置於長 42 公分、寬 42 公分，高 36 公分的黑色壓克力箱中，行為箱正上方裝置有小型直立式攝影機，以紀錄老鼠在箱內的活動，再利用 EthoVision video tracking system 設備 (EthoVision ; Noldus , NED)每秒鐘拍攝紀錄六次動物中心點位置變化，而其完整的活動軌跡則傳送到電腦，利用軟體運算分析動物水平移動距離 (distance of horizontal movement)。每 5 分鐘統計一次動物活動情形，連續記錄 15 分鐘。. B. 平衡桿測試 (Rota-rod) 此行為測試主要為測試動物的平衡感與運動功能協調性，藉以探討在投予藥物後，對動物之平衡感與運動功能協調能力是否受到影響。其操作為：將動物置於離地高 30 公分之平衡感測試儀 (Ugo Basile, Varese, Italy)上，控制其上轉動之橫桿，迫使動物須於橫桿上移動步伐，以保平衡。進行測試前，先給予動物 19 .

(26) . 600 秒低轉速(約 4 rpm)使其習得基本跑步能力。使動物經過休息，將儀器切換至加速模式，再將老鼠置於其上，同時啟動計時踏板，記錄動物在橫桿上停留的時間，依此程序測定三次，求其停留時間之平均值以進行分析。. C. 高台暴露 (Exposed of flat-top) 此實驗目的為探討給予動物急性壓力後，是否會影響後續憂鬱行為測試的結果。故於進行憂鬱行為測試前，將動物置於一個離地 1 公尺，邊長 14 公分的正方形平台上，並保持平台四周空曠，讓動物暴露在被置於高處的壓力下，在此平台待 15 分鐘後進行類憂鬱行為測試實驗。. D. 強迫游泳 (Forced swimming test；FST) 此測試利用老鼠天生懼水的特性來探討各種實驗處理是否會影響老鼠憂鬱傾向。正常情況下老鼠被放入水中，會因怕水而出現奮力掙扎的情況，但有憂鬱傾向的老鼠投入水中，其掙扎的情況會明顯下降，且漂浮於水面不動的時間 (immobility time)會顯著的增加 (Porsolt et al., 1977)。實驗流程分為兩天，方法如下：第一天，使用一個直徑 18 公分，高 38 公分的透明壓克力圓桶，裡面注入 25 ℃的清水至 30 公分高。將老鼠放入圓桶內，使其尾 20 .

(27) . 巴無法碰觸到圓桶底部，待老鼠漂浮在水面上 15 分鐘後撈出，放入壓克力箱內以 60 W 燈泡烘乾其毛髮，再送回飼養箱。第二天仍將老鼠以同樣的方式放入裝水的壓克力圓桶，以攝影機拍攝紀錄 5 分鐘內老鼠掙扎的情形。最後分析影片，以老鼠四肢沒有明顯划水動作定義為不掙扎，累計不掙扎的時間進行比較。. 九、西方墨點法 (Western blotting) 本研究欲探討的蛋白為各組實驗處理後，對動物腦內參與記憶形成過程之分子 MAPK ，其中的 ERK1/2 磷酸化表現量是否有差異。利用硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法 (Sodium dedecyl sulphatepolyacrylaminde gel electrophoresis, SDS PAGE)，依各種蛋白質具有不同分子量之特性進行蛋白質分離。. 製備膠體試劑 30 % acrylamide mix：30 g acrylamide，0.8 g bis acrylamide 加水至 100 mL Tris buffer A：12.1 g Tris 加水至 100 mL，pH6.8 Tris buffer B：12.1 g Tris 加水至 100 mL，pH8 10% SDS：10 g SDS 加水至 100 mL 10%ammonium persulfate：0.1 g ammonium persulfate 加水至 1 mL TEMED 21 .

(28) . 10 % separating gel ddH2O. 4.0 mL. 30% acrylamide mix. 3.3 mL. 1.5M Tris-HCl (pH 8). 2.5 mL. 10% SDS. 0.1 mL. 10% ammonium persulfate. 0.1 mL. TEMED. 0.004 mL. Stacking gel ddH2O. 2.1 mL. 30% acrylamide mix. 0.5 mL. 1.5M Tris-HCl (pH 6.8). 0.38 mL. 10% SDS. 0.03 mL. 10% ammonium persulfate. 0.03 mL. TEMED. 0.003 mL. A. 方法配置 10 % separating gel 溶液，在其未凝固之前迅速注入裝設好之鑄膠玻璃片內，至適當高度，再於膠體上面徐徐加入二次水，使膠體凝固後上端能保持平整，靜置鑄膠器於室溫環境至凝膠凝固，除去二次水，接著配製 stacking gel 溶液注入鑄膠玻璃片內，並插上梳狀模版 (comb)，待其凝結後，取出模板，以二次水清洗玻璃片外之殘膠，即完成 SDS – PAGE gel 的製備。. 22 .

(29) . 細胞均質化 (Homogenization) A. 試劑 1 ml Lysis Buffer 100X RIPA buffer. 100 μL. Proteinase inhibitor. 10 μL. ddH2O. 900 μL. B. 方法於冰上取下之 amygdala 組織裝入 1.5 mL eppendorf tube 內，依據組織之重量加入適量 lysis buffer，內含之蛋白分解酶及蛋白磷酸酶抑制劑可避免蛋白降解及去磷酸化。將 eppendorf tube 置於在冰上，利用 pellet pestle (Kontes Glassware, Vineland, NJ) 將組織均質化，放入微量離心機，以 4 ℃，13500 rpm 離心 15 分鐘，分離蛋白與細胞殘骸，取出上清液置入新的 eppendorf 內，貯存於-80 ℃冰箱備用。. 蛋白質定量 (quantitation) 利用 Bradford 反應，以牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)配置五種不同濃度：0，2，4，8，16，32 μg/mL 作為參考標準品，繪製標準曲線，並確認其相關係數大於 0.995 方可使用。取組織上清液製成 1 μg/mL 之檢體樣品，以紫外光-可見光分光光度計 (spectrophotometer)偵測標準品與檢體在 595 nm 波長吸 23 .

(30) . 光值變化，利用檢體吸光值與標準曲線進行迴歸運算，檢測檢體蛋白質的濃度。. 電泳 (electrophoresis) A. 試劑 5X Running buffer Tris. 15.1 g. Glycine. 94 g. SDS. 5g. 加 ddH2O 至體積為 1 L 備用，使用時用 ddH2O 稀釋成 1X. 2X Sample buffer 1M Tris-HCl (pH6.8). 1.25 mL. 20% SDS. 2.0 mL. Glycerol. 2.0 mL. β-mercaptoethanol. 0.2 mL. Bromphenol Blue. 1～2 mg. 加 ddH2O 使體積至 10 mL. B. 方法依照 Laemmali 法進行 SDS-PAGE，將蛋白質分離。將凝好的膠體置於電泳槽中 (Hoefer)，並於槽中注入 running buffer。將 24 .

(31) . 定量完畢蛋白質樣本與 sample buffer 充分混合，置於 100 ℃乾浴槽加熱 5 分鐘使蛋白質變性，待其冷卻至室溫後，注入膠內之空格 (well)中，以 70 伏特作為電泳之起始電壓，於 stacking gel 進行約 0.3 小時，當色帶進入分離區 (separating gel)時，再以 150 伏特之電壓進行 1.3 小時。電泳結束後，取出膠體，進行轉印 (transfer)的步驟。. 蛋白質電泳轉印法 (Blotting) A. 試劑 1X Transfer buffer (Blotting buffer) Tris. 3.03 g. Glycine. 14.41 g. Methanol. 200 mL. 加 ddH2O 至體積為 1 L. B. 方法剪裁適當大小之 PVDF membrane 先以甲醇浸泡 5 分鐘，再用 ddH2O 清洗三次 1 分鐘，接著浸泡於 transfer buffer 中 15 分鐘，作為前處理。在半乾轉漬槽 (Semi-Dry Transfer Unit)內預鋪兩張經 transfer buffer 浸潤的 3M 濾紙，於其上舖上已預處理完全的 PVDF membrane。把跑完電泳的 SDS-PAGE 凝膠取出，平鋪在 25 .

(32) . PVDF membrane 上，確認 membrane 與凝膠間無氣泡，接著於凝膠上方再鋪上一層經 transfer buffer 浸潤的 3M 濾紙。完成裝置後，以 10 伏特 300 毫安培轉漬 1 小時。. 封阻步驟 (blocking) A. 試劑 10X TBS (Tris-buffed-slaine), pH7.4 Tris. 30 g. NaCl. 80 g. KCl. 2g. 用 37%. HCl 調整酸鹼值至 pH7.4. 加 ddH2O 至體積為 1 L. Washing buffer (TBST) 10X TBS. 100 mL. Tween 20. 500 μL. 加 ddH2O 至體積為 1 L. Blocking buffer Non-fat milk powder. 2.5 g. 加 Washing buffer 至 50 mL 26 .

(33) . B.方法將轉漬完成的 PVDF membrane 放入 5 %脫脂牛奶／TBST 中，在室溫下震搖 1~ 2 小時，以阻斷非特異性結合。. 免疫呈色法 (color developing) A. 抗體配製抗體. 濃度. p-Erk. 10 Ab. 1：1000. total-Erk. 10 Ab. 1：1000. GAPDH. 10 Ab. 1：10000. Goat anti-Rabbit IgG. 20 Ab. 1：10000. 抗體皆溶於 Washing buffer 中。. B. 方法將 blocking 完之 PVDF membrane 以 washing buffer 清洗 5 次，每次 5 分鐘，加入以 TBST 稀釋的一級抗體 (primary antibodies)在 4 ℃下反應過夜。隔日反應完成後，以 washing buffer 洗 5 次，每次 5 分鐘，換以 TBS 稀釋的 HRP conjugated secondary antibodies 浸泡搖晃，於室溫下反應一個小時。待反應完後以 27 .

(34) . washing buffer 洗 5 次，每次 5 分鐘。最後將 ECL 套組之 luminol 和反應促進劑混合液，均勻滴在 PVDF membrane 上使反應。 Luminol 和 second antibody 上的 HRP 於溫室下反應 30 秒至 1 分鐘，產生的螢光物質，再以冷光螢光影像擷取系統 (Luminescence/Fluorescence Imaging System)進行掃描分析結果。最後利用密度測定軟體 Image J 來量化結果。. 十、統計方法所有結果數值以 Mean ± S.E.M之方法表示，再以 modified t-test進行組間分析，以 probability value (P ≤ 0.05)被認定具有統計上的顯著差異。. 28 .

(35) . 第三章實驗結果實驗 1、實驗動物體重記錄實驗目的：透過記錄實驗大鼠各週齡的體重變化，並比較各組動物體重之變化趨勢，以了解投予 DEX 是否改變大鼠之代謝速率，且影響其成長發育，進而確認藥物是否投予成功。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。並記錄出後前三天，以及成長至四週、六週和八週的體重，以進行體重變化趨勢的比較。流程圖如下： DEX / Saline Body weight recording Age P1 . P2 . P3 . P28 . 29 . P42 . P56 .

(36) . 實驗結果 1、體重計錄結果：(圖三) Control 組與 DEX 組大鼠體重記錄顯示，新生時期投予 DEX 的大鼠體重從出生後第二天 (P2)開始，即顯著的低於 control 組 ( p<0.01 )，且持續由出生後第三天 (P3) ( p<0.01 )、第四週 (P28) ( p<0.01 )至第六週 (P42) ( p<0.05 )兩組動物的體重在統計上仍然有顯著的差異。但當 DEX 大鼠成長至八週時，體重上的差異獲得改善，在統計上相較於 control 組已無顯著差異 (圖三)。新生時期施打 DEX 之大鼠，其平均體重顯著低於正常大鼠是由於 DEX 能模擬體內醣皮質激素作用，促進肝臟內合成蛋白質以及醣質新生作用 (gluconeogenesis)，但在周邊組織，醣皮質激素則是抑制蛋白質的合成，且同時影響周邊脂質合成 (lipogenesis)，進而造成 DEX 組之大鼠生長發育遲緩，並反應在體重變化上，因此可用此現象已確認藥物投予是否成功。待大鼠成年之後，即成長至八週，其體內之內分泌系統發育完整後，藥物對體重之影響得到改善，因此體重相較正常大鼠已無顯著差異。由於動物體重之變化量為實驗上相當容易觀察記錄的外顯特徵，因此列為本研究篩選動物投藥成功與否的重要指標。證實藥物投予確實能影響實驗大鼠之發育後，方可進行後 30 .

(37) . 續實驗，以釐清投予 DEX 對腦部杏仁核功能及憂鬱行為的影響。. 31 .

(38) . 實驗 2、新生期投予 DEX 對大鼠成年期活動能力之影響實驗目的：透過自發性運動行為測試、平衡桿測試兩種行為測試，了解在大鼠新生期投予 DEX 是否會影響其成年期活動能力、自發性探索行為、平衡感與及運動協調性，藉以排除後續行為實驗可能受到干擾的變因。. 實驗流程：新生期投予生理食鹽水之 control 組大鼠與新生期投予 DEX 之 DEX 組大鼠，由實驗 1 結果確認投藥成功。待其成長至八週時分別進行自發性運動行為測試與平衡感行為測試。流程圖如下：. Locomotor activity . DEX / Saline . Rota‐rod Age P1 . P2 . P3 . P56 . 32 .

(39) . 實驗結果 2-1、自發性行為測試結果：(圖四) 將動物置於一個陌生空間會引發其本能對環境探索的行為，但動物可能會受到本身的情緒、健康狀態或是接受藥物投予而影響其移動路徑及探索行為。本實驗結果顯示新生期投予 DEX 之大鼠在行為箱內水平移動距離累計與 control 組相比較，兩者在統計上並無顯著差異 (圖四)。兩組動物在行為箱內移動的軌跡也十分相似。由此可知，新生期投予 DEX 並不會干擾大鼠在成年時期的運動功能及自發性探索行為，因此能夠排除藥物影響大鼠的活動能力而造成後續實驗結果受到影響的可能性。. 33 .

(40) . 實驗結果 2-2、平衡桿測試結果：(圖五) 若藥物的投予造成動物運動功能受損，會因而影響行為測試實驗結果。因此本實驗藉由平衡桿測試，觀察動物平衡感與運動協調能力是否正常。本實驗結果顯示新生期投予 DEX 之大鼠與正常大鼠在平衡桿上停留時間並無統計上顯著差異 (圖五)，顯示新生期投予 DEX 並不會影響實驗大鼠平衡感與運動協調能力，因此能排除藥物投予造成大鼠運動功能受損而干擾後續行為實驗結果的可能性。. 34 .

(41) . 實驗 3、新生期投予 DEX 之大鼠，對其成年期面對急性壓力之影響實驗目的：探討新生時期投予 DEX 之大鼠成長至成年期時，面對高台曝露之急性壓力後，對測定類憂鬱傾向之強迫游泳行為表現是否造成影響。並於強迫游泳行為測試結束後，利用西方墨點法分析杏仁核中 ERK 之磷酸化表現，以探討大鼠類憂鬱行為與杏仁核中 ERK 磷酸化表現量的關連性。. 實驗流程：新生期投予生理食鹽水之 control 組大鼠與投予 DEX 之 DEX 組大鼠，在確認投藥成功 (實驗 1)，並排除本能行為與運動功能受干擾 (實驗 2)後，開始進行強迫游泳行為測試。行為測試分為兩天，行為測試第一天給予 15 分鐘強迫游泳訓練，第二天於行為測試前使大鼠處於高台曝露環境之急性壓力 15 分鐘，誘發其急性壓力反應，接著立即進行 5 分鐘強迫游泳行為測試，並且記錄行為過程之影像進行分析。大鼠於行為結束後立即犧牲，取下杏仁核組織進行蛋白質表現量分析。流程圖如下：. 35 .

(42) . DEX / Saline . Behavior FST Exposed of FST test Sacrifice test training flat‐top 15 min. Age P1 . P2 . P3 . 15 min. P56 Day 1. Day 2 . 36 . 5 min . Western blotting.

(43) . 實驗結果 3-1、高台壓力處理後，強迫游泳行為測試結果： (圖六) 實驗大鼠經過高台曝露處理後，立即給予五分鐘強迫游泳測試，同時錄影進行分析，觀察實驗大鼠在水中不掙扎的情形，累計時間後進行分析，分析結果後發現新生期投予 DEX 之大鼠在強迫游泳實驗中不掙扎、不游動的時間佔總時間之 37%，而 control 組不掙扎、不游動則佔總時間之 7%。兩個組別在統計上達到顯著差異 ( p<0.05)， DEX 組不游動之時間顯著的高於 control 組的大鼠 (圖六)，顯示經過急性的高台曝露處理後， DEX 組的大鼠在強迫游泳行為測試中較容易產生放棄掙扎的情況，顯示在面臨急性壓力時，其情緒反應確實會受到新生期投予 DEX 的影響，因而較正常老鼠易產生類憂鬱的反應。. 37 .

(44) . 實驗結果 3-2、行為測試後，杏仁核內 ERK1/2 蛋白質表現量分析結果：(圖七) Control 組與 DEX 組之大鼠經過高台曝露之急性壓力後，再進行五分鐘之強迫游泳行為測試，行為結束後立即犧牲取下大腦杏仁核組織，並將組織存放於-80℃環境下保存，以待後續分析。由於杏仁核為負責情緒調控的中樞，DEX 組不掙扎時間高於 control 組可能源於杏仁核調控的分子機轉作用異常所致。故本實驗利用西方墨點法針對其調控路徑下游分子 ERK1/2 的蛋白質表現量進行分析。其結果顯示，新生期投予 DEX 之大鼠在面對急性壓力環境後出現的類憂鬱情緒反應，對其大腦杏仁核中 ERK1/2 之總量與 control 組相比並無顯著差異，但 DEX 組的 ERK1 磷酸化表現量 (p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control 組 ( p<0.01 )， ERK2 磷酸化表現量 (p-p42)佔總量之比例也顯著的高於 control 組 ( p<0.05 ) (圖七)，顯示當新生期投予 DEX 影響大鼠產生類憂鬱行為與杏仁核中 ERK 磷酸化表現量上升有關係密切。. 38 .

(45) . 實驗 4、新生期投予 DEX 之大鼠，對參與壓力反應相關核區間神經投射路徑活性之影響實驗目的：利用電生理記錄法，探討新生時期投予 DEX 對大鼠成年期時，其壓力反應相關的神經投射路徑活性變化。本實驗特別針對參與急性壓力反應之視丘投射至側杏仁核神經投射路徑給予刺激，藉以了解新生期投予 DEX 對視丘投射至側杏仁核 LTP 神經電訊號強度的影響。並且同時分析視丘與杏仁核 ERK 磷酸化表現量的變化。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。確認投藥成功後，待大鼠成長至八週時犧牲進行胞外電生理誘發 LTP 記錄。實驗前製備各組大鼠腦薄片，以三次間隔 20 秒 100Hz 的高頻電刺激誘發 LTP，持續記錄一小時。 39 .

(46) . LTP 記錄結束後將腦片區分成： 1.Control 組 thalamus 部位之組織 2.DEX 組 thalamus 部位之組織 3.Control 組 amygdala 部位之組織 4.DEX 組 amygdala 部位之組織利用西方墨點法，對這四組進行 ERK 總量與磷酸化蛋白質表現量分析。. 40 .

(47) . 實驗結果 4-1、胞外電生理誘發視丘至側杏仁核 LTP 結果： (圖八) 利用胞外電生理記錄視丘投射至側杏仁核誘發 LTP 的結果發現， control 組經高頻電刺激之後，其 fEPSP 的斜率增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 170±11%，而新生期投予 DEX 的大鼠，在高頻電刺激後其 fEPSP 的斜率則增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 200±13%。顯示兩組在視丘至側杏仁核的投射路徑皆能成功誘發 LTP。且 DEX 組的大鼠於 LTP 誘發後第 16 分鐘開始其對刺激的反應顯著的高於 control 組 ( p<0.01 ) (圖八)。因此與 control 組相較，新生期投予 DEX 之大鼠對於相同條件的高頻電刺激有較強的神經電訊號反應。顯示在相同強度的刺激下，DEX 組在視丘至側杏仁核的投射路徑具有較高的神經活性反應。. 41 .

(48) . 實驗結果 4-2、胞外電生理誘發視丘至側杏仁核 LTP 後， ERK1/2 蛋白質表現量分析結果：(圖九) 胞外電生理紀錄完成後，將腦薄片視丘與杏仁核兩部位的組織取下，利用西方墨點法分析兩個部位 ERK1/2 的蛋白質表現量。結果顯示新生期投予 DEX 大鼠，其視丘與杏仁核中 ERK1/2 總量與 control 組並無顯著的差異。但在視丘中 DEX 組的 ERK1 磷酸化表現量 (p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control 組 ( p<0.05 )， ERK2 磷酸化表現量 (p-p42)佔總量之比例也顯著的高於 control 組 ( p<0.01 ) (圖九)。而在杏仁核中 DEX 組的 ERK1 磷酸化表現量 (p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control 組 ( p<0.05 )， ERK2 磷酸化表現量 (p-p42)佔總量之比例也顯著的高於 control 組 ( p<0.01 ) (圖九)。顯示新生期投予 DEX 之大鼠在視丘投射至側杏仁核之路徑誘發 LTP 之反應強度高於 control 組 (實驗結果 4-1)的現象，可能與視丘及杏仁核中 ERK 磷酸化表現量顯著增加有關。. 42 .

(49) . 實驗 5、胞外電生理中給予 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 及 bumetanide，對杏仁核中與壓力反應相關之神經投射路徑之影響實驗目的：由實驗 4 之結果顯示，新生期投予 DEX 會使視丘投射至側杏仁核的 LTP 反應強度顯著高於 control 組，且與 ERK 磷酸化顯著上升有關。為了更進一步驗證 ERK 磷酸化表現量不同是否為造成兩組動物行為表現與神經活性顯著差異的主因，本實驗利用 PD98059 與 bumetanide 兩種 ERK 磷酸化抑制劑，以探討 ERK 磷酸化表現量的變化，對行為表現與神經活性的影響。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。確認投藥成功後，待大鼠成長至八週時犧牲進行胞外電生理誘 43 .

(50) . 發 LTP 記錄。實驗前製備各組大鼠腦薄片，先以含有 10μM PD98059 或 2.5μM bumetanide 之 aCSF 灌流 20 分鐘後，再以三次間隔 20 秒 100Hz 的高頻電刺激誘發 LTP，持續記錄一小時。. 44 .

(51) . 實驗結果 5-1、PD98059 處理後，胞外電生理誘發視丘至側杏仁核 LTP 結果：(圖十) 利用胞外電生理記錄視丘投射至側杏仁核的基礎神經電訊號 10 分鐘後，再以含有 10μM PD98059 之 aCSF 灌流 20 分鐘後，其間利用高頻電刺激誘發視丘投射至側杏仁核的 LTP。結果發現， control 組經高頻電刺激之後，其 fEPSP 的斜率增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 160±8%，而新生期投予 DEX 的大鼠，在高頻電刺激後其 fEPSP 的斜率則增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 155±7%。顯示兩組在含有 10μM PD98059 之 aCSF 灌流下，視丘至側杏仁核的投射路徑皆能成功誘發 LTP，但兩組對 LTP 之反應強度並無顯著差異 (圖十)。顯示低劑量的 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 灌流下，高頻電刺激仍能誘發視丘投射至側杏仁核的 LTP，但對於誘發 LTP 後的神經電訊號強度具有些微的抑制效果。此外，在此劑量下，能明顯抑制 DEX 組的電訊號強度，使其降低至與 control 組沒有顯著差異。. 45 .

(52) . 實驗結果 5-2、bumetanide 處理後，胞外電生理誘發視丘至側杏仁核 LTP 結果：(圖十一) 利用胞外電生理記錄視丘投射至側杏仁核的基礎神經電訊號 10 分鐘後，再以含有 2.5μM bumetanide 之 aCSF 灌流 20 分鐘後，其間利用高頻電刺激誘發視丘投射至側杏仁核的 LTP。結果發現， control 組經高頻電刺激之後，其 fEPSP 的斜率增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 164±12%，而新生期投予 DEX 的大鼠，在高頻電刺激後其 fEPSP 的斜率則增加為刺激前記錄之基礎訊號值的 161±12%。顯示兩組在視丘至側杏仁核的投射路徑皆能成功誘發 LTP，但兩組對 LTP 之反應強度並無顯著差異 (圖十一)。綜合實驗 5 的結果， DEX 組在視丘至側杏仁核的投射路徑具有較高的神經活性反應的現象，可透過低劑量 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 或 bumetanide 的灌流，達到明顯的抑制效果，使其與 control 組的神經電訊號活性相近。顯示 ERK 磷酸化為此投射路徑 LTP 形成的必要條件，且調控 ERK 磷酸化的表現量，能影響 LTP 形成後神經電訊號的強度。. 46 .

(53) . 實驗 6、投予 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 對新生期投予 DEX 之大鼠之影響實驗目的：由實驗 5-1 之結果顯示，在胞外電生理實驗中使用 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 會影響 LTP 形成後神經電訊號的強度。本實驗欲更進一步了解中樞投予 PD98059 是否能抑制杏仁核中 ERK 磷酸化表現量，並且顯著的改善新生期投予 DEX 之大鼠類憂鬱行為表現。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。待其成長至七週時，接受立體定位手術，於大鼠兩側腦室內埋入中樞投藥之鋼管，並休息一個禮拜使傷口癒合。所有大鼠於八週時進行埋管測試，確定投藥之鋼管正確埋入兩側腦室內，即可進行行為實驗。 47 .

(54) . 行為測試第一天給予 15 分鐘強迫游泳訓練。行為測試第二天，於行為實驗開始時，將動物分成四組分別進行投藥： Control-vehicle. 組：新生期投予 saline 之大鼠，中樞投予 vehicle (2 μL aCSF each contained with 50 % DMSO). DEX-vehicle. 組：新生期投予 DEX 之大鼠，中樞投予 vehicle (2 μL aCSF each contained with 50 % DMSO). Control-PD98059 組：新生期投予 saline 之大鼠，中樞投予 PD98059 2 μg / 4 μL DEX- PD98059. 組：新生期投予 DEX 之大鼠，中樞投予 PD98059 2 μg / 4 μL. 於行為進行前 15 分鐘投藥，接著使大鼠處於高台曝露環境之急性壓力 15 分鐘，接著立即進行 5 分鐘強迫游泳行為測試，並且記錄行為過程之影像進行分析。大鼠於行為結束後立即犧牲，取下杏仁核組織進行蛋白質表現量分析。流程圖如下： PD98059/vehicle DEX / Saline . Exposed of FST flat‐top test Sacrifice . Behavior FST test training 15 min. Age . P1 P2 P3 . 15 min. P56 Day 1. Day 2 48 . . 5 min . Western blotting .

(55) . 實驗結果 6-1、中樞投予 PD98059，並以高台壓力處理後，強迫游泳行為測試結果：(圖十二) 實驗大鼠中樞投予 vehicle 或 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059，再經過高台曝露處理後，立即給予五分鐘強迫游泳測試，同時錄影觀察記錄大鼠在水中不掙扎的情形，累計後進行分析。分析結果發現各組不掙扎、不游動則佔總時間的百分比分別為： control-vehicle 組佔總時間之 6%。 DEX-vehicle 組佔總時間之 31%，而 control-PD98059 組佔總時間之 6%， DEX-PD98059 組佔總時間之 5% ( 圖十二 ) 。比較 control-vehicle 組與 control-PD98059 組，兩組在統計上並無顯著差異，顯示中樞投予 PD98059 不會影響動物之正常行為表現。比較 DEX -vehicle 組與 control-vehicle 組以及 control- PD98059 組，在統計上均有顯著的差異 ( p<0.05，p<0.05 )，其結果與實驗 3-1 結果相符，顯示 DEX 組老鼠面對急性壓力時會產生類憂鬱的傾向。比較 DEX-vehicle 組與 DEX-PD98059 組，結果顯示 DEX-vehicle 組顯著高於 DEX-PD98059 組 ( p<0.05 )，亦即投予 PD98059 能使 DEX 的老鼠類憂鬱傾向下降。且 DEX-PD98059 組相較投予 vehicle 或 PD98059 之 control 大鼠，均無顯著差異。. 49 .

(56) . 實驗結果 6-2、中樞投予 PD98059，於行為測試後杏仁核內 ERK1/2 蛋白質表現量分析結果：(圖十三) 實驗大鼠中樞投予 vehicle 或 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059，經過高台曝露處理後立即給予五分鐘強迫游泳測試，測定藥物對類憂鬱傾向之強迫游泳行為表現是否造成影響。並利用西方墨點法分析杏仁核中 ERK 之磷酸化表現，以探討 ERK 磷酸化抑制劑 PD98059 對大鼠杏仁核中 ERK 磷酸化表現量的影響。其結果顯示 DEX -vehicle 組之 ERK1 磷酸化表現量(p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與實驗結果 3-2 相符)、 control-PD98059 組及 DEX-PD98059 組 ( p<0.05， p<0.01， p<0.05 )。DEX -vehicle 組之 ERK2 磷酸化表現量 (p-p42)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與實驗結果 3-2 相符)、 control -PD98059 組及 DEX-PD98059 組 ( p<0.05， p<0.05， p<0.05 )。control-vehicle 組與 control-PD98059 組、DEX-PD98059 組之 ERK1 磷酸化表現量 (p-p44)佔總量之比例無顯著差異，而 p-ERK2 (p-p42)也無顯著差異，顯示投予 PD98059 能抑制 DEX 組之大鼠面對急性壓力時杏仁核中 ERK 之磷酸化異常升高的情況。. 50 .

(57) . 實驗 7、周邊投予 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 對新生期投予 DEX 之大鼠之影響實驗目的：由實驗 5-2 之結果顯示，在胞外電生理實驗中使用 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 會影響 LTP 形成後神經電訊號的強度。本實驗欲更進一步了解周邊投予 bumetanide 是否能顯著的改善新生期投予 DEX 之大鼠類憂鬱行為表現。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。待其成長八週即可進行行為實驗。行為測試第一天給予 15 分鐘強迫游泳訓練。行為測試第二天，於行為實驗開始時，將動物分成四組分別進行投藥：. 51 .

(58) . Control-vehicle. 組：新生期投予 saline 之大鼠，周邊投予 saline. DEX-vehicle. 15 mg/kg. 組：新生期投予 DEX 之大鼠，周邊投予 saline. 15 mg/kg. Control-bumetanide 組：新生期投予 saline 之大鼠，周邊投予 bumetanide 15 mg/kg DEX- bumetanide 組：新生期投予 DEX 之大鼠，周邊投予 bumetanide. 15 mg/kg. 於行為進行前 15 分鐘投藥，接著使大鼠處於高台曝露環境之急性壓力 15 分鐘，接著立即進行 5 分鐘強迫游泳行為測試，並且記錄行為過程之影像進行分析。流程圖如下： bumetanide/saline DEX / Saline . Behavior FST test training 15 min. Age . P1 P2 P3 . 15 min. P56 Day 1. 52 . Exposed of FST flat‐top test . Day 2 . 5 min .

(59) . 實驗結果 7、周邊投予 bumetanide，並以高台壓力處理後，強迫游泳行為測試結果：(圖十四) 實驗大鼠周邊投予 vehicle 或 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide，再經過高台曝露處理後，立即給予五分鐘強迫游泳測試，同時錄影觀察記錄大鼠在水中不掙扎的情形，累計後進行分析。分析結果發現各組不掙扎、不游動則佔總時間的百分比分別為：control-vehicle 組佔總時間之 11%。 DEX-vehicle 組佔總時間之 36%，而 control-bumetanide 組佔總時間之 21%， DEX-bumetanide 組佔總時間之 31% ( 圖十四 ) 。比較 control-vehicle 組與 DEX-vehicle 組及 DEX-bumetanide 組，在統計上均有顯著差異 ( p<0.05 ， p<0.05 ) ，顯示周邊投予 bumetanide 無法使 DEX 組之大鼠動物回復正常行為表現。再比較. DEX-vehicle. 組與. control-bumetanide. 組及. DEX-bumetanide 組，在統計上均無顯著差異，顯示周邊投予 bumetanide 可能會使 control 組行為表現出現異常。雖然比較 control-vehicle 組與 control-bumetanide 組，在統計上並無差異，但從圖十四中可以觀察到 control-bumetanide 組不游動的時間佔總時間之百分比有升高的趨勢。因此在無法排除 bumetanide 是否會對老鼠的運動功能產生不良影響的情況下，也無法推測 53 .

(60) . bumetanide 是否具有回復動物異常行為之功能。. 54 .

(61) . 實驗 8、中樞投予 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 對新生期投予 DEX 之大鼠之影響實驗目的：由實驗 7 之結果顯示，從周邊投予 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 無法判斷是否能改善新生期投予 DEX 之大鼠類憂鬱行為表現，因此本實驗中改用中樞投藥的方式，探討 bumetanide 是否能抑制杏仁核中 ERK 磷酸化表現量，並且顯著的改善新生期投予 DEX 之大鼠類憂鬱行為表現。. 實驗流程：大鼠出生後被分為兩組： Control 組：皮下注射生理食鹽水。 DEX. 組：皮下注射方式，遞減投予 DEX。. 利用皮下注射，在大鼠出後前三天 ( P1~P3 ) 對照臨床用藥連續給予 DEX 組遞減劑量的藥物 ( P1：0.5 mg/mL；P2：0.3 mg/mL；P3：0.1 mg/mL )，而 control 組給予等體積生理食鹽水。待其成長至七週時，接受立體定位手術，於大鼠兩側腦室內埋入中樞投藥之鋼管，並休息一個禮拜使傷口癒合。所有大鼠於八週時進行埋管測試，確定投藥之鋼管正確埋入兩側腦室內，即可進行行為實驗。 55 .

(62) . 行為測試第一天給予 15 分鐘強迫游泳訓練。行為測試第二天，於行為實驗開始時，將動物分成兩組分別進行投藥： Control-bumetanide 組：新生期投予 saline 之大鼠，中樞投予 bumetanide 2.5 μM / 4 μL DEX- bumetanide 組：新生期投予 DEX 之大鼠，中樞投予 bumetanide. 2.5 μM / 4μL. 於行為進行前 15 分鐘投藥，接著使大鼠處於高台曝露環境之急性壓力 15 分鐘，接著立即進行 5 分鐘強迫游泳行為測試，並且記錄行為過程之影像進行分析。大鼠於行為結束後立即犧牲，取下杏仁核組織進行蛋白質表現量分析。流程圖如下：. bumetanide/vehicle DEX / Saline . Exposed of FST flat‐top test Sacrifice . Behavior FST test training 15 min. Age . P1 P2 P3 . 15 min. P56 Day 1. Day 2 . 56 . 5 min . Western blotting .

(63) . 實驗結果 8-1、中樞投予 bumetanide，並以高台壓力處理後，強迫游泳行為測試結果：(圖十五) 實驗大鼠中樞投予 vehicle 或 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide，經過高台曝露處理後，立即給予五分鐘強迫游泳測試，觀察記錄大鼠在水中不掙扎的情形進行分析。分析結果發現各組不掙扎、不游動則佔總時間的百分比分別為： control-vehicle 組佔總時間之 5%。 DEX-vehicle 組佔總時間之 29% ，而. control-bumetanide 組佔總時間之 5% ，. DEX-bumetanide 組佔總時間之 7% ( 圖十五 ) 。比較 control-vehicle 組與 control-bumetanide 組，在統計上並無顯著差異，顯示中樞投予 bumetanide 不會影響動物正常行為表現。比較 DEX-vehicle 組與 control-vehicle 組、 control-bumetanide 組，在統計上均有顯著的差異 ( p<0.01，p<0.01 )，顯示 DEX 組老鼠面對急性壓力時會產生類憂鬱的傾向。比較 DEX-vehicle 組與 DEX-bumetanide 組，結果顯示 DEX-vehicle 組顯著高於 DEX-bumetanide 組 ( p<0.01 ) ，亦即投予 bumetanide 能使. DEX 的老鼠類憂鬱傾向下降。且. DEX-bumetanide 組相較投予 vehicle 或 bumetanide 之 control 大鼠，均無顯著差異。 57 .

(64) . 實驗結果 8-2、中樞投予 bumetanide，於行為測試後杏仁核內 ERK1/2 蛋白質表現量分析結果：(圖十六) 實驗大鼠中樞投予 vehicle 或 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide，經過高台曝露處理後立即給予五分鐘強迫游泳測試，測定藥物對類憂鬱傾向之強迫游泳行為表現是否造成影響。並利用西方墨點法分析杏仁核中 ERK 之磷酸化表現，以探討 ERK 磷酸化抑制劑 bumetanide 對大鼠杏仁核中 ERK 磷酸化表現量的影響。其結果顯示 DEX -vehicle 組之 ERK1 磷酸化表現量(p-p44)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與實驗結果 3-2 相符)、 control-bumetanide 組及 DEX-bumetanide 組 ( p<0.05， p<0.05， p<0.05 )。DEX -vehicle 組之 ERK2 磷酸化表現量 (p-p42)佔總量之比例顯著的高於 control-vehicle 組 (與實驗結果 3-2 相符)、 control-bumetanide 組及 DEX-bumetanide 組 ( p<0.05 ， p<0.01 ， p<0.05 ) 。 control-vehicle 組與 control-bumetanide 組、DEX-bumetanide 組之 ERK1 磷酸化表現量 (p-p44)佔總量之比例無顯著差異，而 p-ERK2 (p-p42)也無顯著差異，顯示投予 bumetanide 能抑制 DEX 組之大鼠面對急性壓力時杏仁核中 ERK 之磷酸化異常升高的情況。. 58 .

(65) . 第四章討論 Dexamethasone (DEX)在臨床上之使用十分廣泛，最常使用在抗發炎的反應上，因此市售的許多消炎藥膏的成分內都含有 DEX，市售許多 DEX 針劑也常用於風濕性關節炎的治療。此外，過去二十年來 DEX 也被使用在治療早產兒新生時期的發炎反應，或因肺部發育不良而產生之肺部疾病 (Cummings et al., 1989；Sanders et al.,1994)。但陸續有報導指出於新生時期接受 DEX 投藥治療的早產兒，在日後的成長過程中，會出現發育遲緩，肢體運動功能協調能力低於同齡兒童 (Stoelhorst et al., 2003)，甚至會對其神經發育產生不良影響 (Flagel et al., 2002)。即便 DEX 在新生兒時期臨床用藥策略與安全劑量控制上仍存有許多爭議，本研究重點著重於 DEX 對腦部參與壓力調控相關核區的影響，並藉此釐清這些核區的投射路徑與調控的分子機制。在本實驗模式動物身上，我們模擬早產兒用藥之時間及劑量，也同樣觀察到經過 DEX 處理之大鼠在幼年期會受到藥物的影響，出現發展遲緩的現象，表徵上可從體重上的變化看到 DEX 組的大鼠體重於用藥第二天開始即顯著低於 control 組的大鼠，不過，體重發育遲緩的現象在其六週後才漸漸恢復至與 control 組相同的水平。此結果指向新生期 DEX 的投予對於動物體重變化的影響於成年期後能獲得改善，並不會造成永久性的影響。 59 .

(66) . 雖然表徵上生長發育並不會造成永久性的不良影響，不過我們希望更深入探討新生期投予 DEX 是否影響中樞神經中，對於 DEX 易感性較高的核區功能是否造成長期甚至不可回復的影響。由於 DEX 是人工合成之醣皮質固醇激素，其在動物體內的作用機轉與壓力調節相關之激素 glucocorticoid 類似，故可影響體內與調節情緒壓力有關的下視丘-腦下腺-腎上腺壓力反應軸 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis , HPA axis)的恆定機制。由於新生鼠在出生後前兩週處於壓力刺激低反應期（stress hyporesponsive period），其體內對壓力反應的機制尚未成熟，無法調控中樞系統糖皮質固醇類激素的代謝與恆定。在中樞神經系統中，許多參與調控急性壓力反應核區例如:下視丘旁室核以及邊緣系統中的海馬迴與杏仁核等部位皆存在著大量的糖皮質固醇類受器 (glucocorticoid receptor, GRs)，因此，於壓力刺激低反應期前期使用 DEX 很有可能是藉由影響 HPA 軸的激素作用，對神經系统的發育過程與壓力激素的分泌造成干擾。，導致動物在面臨急性壓力時反應有異於正常動物的行為表現。前人研究發現，測定 DEX 治療過之早產兒血液內壓力激素濃度低於正常值 (Rizvi et al., 1992)。另外也有研究以新生期投予 DEX 之動物模式，觀察接受壓力刺激後 DEX 之大鼠，其壓力激素之分泌也較正常老鼠為低，但他們認為此差異並不會持續至成年時期 (Lin et al.,2006)。然而，在大腦中其他壓 60 .

(67) . 力激素之受器 GR 大量表現的核區，特別是下視丘與杏仁核這些參與急性壓力反應調控的核團，可能因為對於 DEX 的易感性較強，而造成更長期甚至永久性的影響。目前已有許多研究致力於探討腦內杏仁核對情緒調壓力調節的神經路徑及分子機制，並發展出許多模擬各種壓力反應的動物模式來進行探討，其中以杏仁核調控恐懼記憶的形成過程，最受到科學家們所關注，因為許多壓力事件多會伴隨著恐懼記憶的形成。舉例而言，條件化恐懼之行為模式 (conditioned fear)中以非條件化之電刺激配合條件化之聲光刺激給予壓力，可以觀察動物恐懼記憶的形成 (Miserendino et al.,1990； Fanselow and LeDoux, 1999； LeDoux, 2000)。而近期研究亦指出，於條件化恐懼形成的過程中，若投予 GR 致效劑，例如 RU38486 與 DEX 等，會增強條件化恐懼的形成，意指體內壓力激素受器的活化，在恐懼記憶的形成過程中扮演重要的角色。然而，本實驗室先前之研究卻發現，新生期投予 DEX 之大鼠，於成年時期無法建立條件化恐懼記憶，顯示新生期接受 DEX 的藥物處理，可能干擾 GR 的活化過程，因而造成條件化恐懼形成的障礙。新生期投予 DEX 大鼠在正常情況下進行強迫游泳行為訓練及測試，其不游動時間雖然略高於 control 組，但統計上並無差異。但在強迫游泳行為測試前給予更強烈之高台曝露的急性壓力時，其靜止不游動時間顯著的 61 .

(68) . 高於 control 組，表現出類憂鬱 (depression-like behavior)的行為 (洪， 2008)。顯示這些動物在一般情況下行為表現正常，但在面臨急性壓力時，其體內壓力激素調控機制的失調，便會明顯的影響動物對急性壓力的反應，凸顯出易憂鬱的異常行為。然而，造成此現象的主要原因是源自於體內壓力激素分泌量的異常?還是受器的表現量改變?抑或相關的受器運送蛋白功能異常?是值得更深入探討的問題。前人研究中發現條件化恐懼的形成與強迫游泳中憂鬱傾向的產生，皆與 ERK 磷酸化活化路徑有關 (Lin et al.,2001；Huang and Lin , 2006)。因此本研究也更進一步的探討新生期投予 DEX 之動物所造成的藥物不良反應，是否也影響了杏仁核中 ERK 磷酸化的表現，結果顯示 DEX 組大鼠杏仁核中 ERK 磷酸化的比例顯著高於 control 組。這個結果也呼應前人以幼年期經母子分離模式之大鼠，成年後給予急性強迫游泳測試後，發現杏仁核中 ERK 磷酸化有異常上升的研究結果 (Huang and Lin , 2006)。過去許多文獻皆報導新生期遭遇不同的壓力事件，對於動物成年後會的情緒反應有長期而深遠的影響。雖然不同的壓力來源與成年後產生的病徵不完全相同，不過對照前人的實驗，本研究結果暗示這些不良影響，可能與杏仁核的 ERK 磷酸化表現量異常有高度相關。許多文獻認為，在動物面臨急性壓力以及條件化恐懼形成過程與 62 .

(69) . 視丘投射至側杏仁核的神經投射路徑 thalamic-lateral nucleus of amydala pathway (簡稱 thalamic-LA pathway)有密切的關係 (LeDoux, 2000)。如對動物投予 ERK 的抑制劑，可阻礙其條件化恐懼記憶的獲取、固化及消減 (Yang et al., 2007)。但多數研究皆是利用免疫組織染色法或蛋白質表現量分析個別部位的變化情形，鮮少直接觀察不同核區之間神經投射路徑的變異。因此，我們利用胞外電生理記錄的方法，探討相關核區投射路徑的變化，除了能避開活體電生理實驗執行的難度，以及紀錄並比較不同核區之間神經投射路徑的活性變化，亦可快速的對相關藥物可能造成的影響進行初步評估。結果顯示利用高頻電刺激誘發 thalamus-LA pathway 的 LTP 後，DEX 組大鼠對於相同刺激強度下比 control 組有更強的反應，於紀錄完畢後取下兩個核區的組織進一步進行 ERK 磷酸化的表現分析，亦發現 DEX 組在整條刺激路徑上的 ERK 磷酸化程度也都高於 control 組，與前述的動物活體實驗結果相互呼應。此結果也再度證明 ERK 參與情緒壓力調節的過程，更重要的是下視丘投射至側杏仁核的投射路徑在動物調控急性壓力反應過程中扮演重要的角色。由於本論文的實驗結果顯示杏仁核 ERK 過度的磷酸化為神經投射路徑過度活化與行為表現異常的主因之一，而前人研究中發現給予 ERK 抑制劑能改善動物之憂鬱行為 (Huang and Lin , 2006)，我們也 63 .