第三章 材料與方法
第二節 研究方法
五、 ABCA1 單基因多型性的基因型分析
本研究進行 ABCA1 基因中三個單核苷酸多型性(SNPs)的分析，其 一為ABCA1 基因中的第 1051 個核苷酸由 G 變異成 A 的單核苷酸多型
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性(G1051A)，其位於第七個外顯子區域(表現序列；exon 7)上;另外，還 有第2706 個核苷酸也同樣是由 G 轉變成 A 的單核苷酸多型性
(G2706A)，位於第十六個外顯子(表現序列；exon 16)的區域內；以及第 3044 個核苷酸是由 A 轉變成 G 的單核苷酸多型性(A3044G)，位於第十 八個外顯子(表現序列；exon 18)的區域內。
基因型鑑定的部份，是以聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain
reaction；PCR)將帶有遺傳訊息的雙股螺旋 DNA 在短時間內大量的複 製，再藉由限制酶片段長度多型性(restriction fragment length
polymorphism，RFLP)的方法來進行基因型的鑑定。此外，為進一步確 認基因型分析的結果，將隨機抽選DNA 擴增後的檢體，送至明欣生物 科技公司(Mission Biotech Co., Ltd)進行基因體定序的工作。
A. G1051A， exon 7 (rs2234884、R219K)
(1) 引子序列(primer) Forward Oligo:
5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAA-3’
Reverse Oligo: 5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGGAA -3’
(2) PCR 反應液的試劑量
(a.) DNA template (50 ng/μL) 2 μl
(b.) MgCl2 2 μl
(c.) 10X ProTaq Buffer 2.5 μl (d.) 去氧核苷三磷酸 (2.5 mM) 2 μl
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(e.) primer forward、reverse (10μM) 各1 μl (f.) ProTaq polymerase (2 unit/μl) (Pro Tech) O.5 μl
(g.) 滅菌蒸餾水(ddH2O) 14 μl
最終體積為 2 5μl
(3) PCR 反應步驟
將配置好之 PCR 反應液，採熱啟動(hot start)的方式，待溫度到達 94
℃後，將 PCR 反應液放入，並以 94℃加熱 5 分鐘使 DNA 雙股螺旋先進 行預變性 (pre-denature step)，接著以高溫 94℃維持 1 分鐘使 DNA 雙股 模板變性分離(denaturing)，再以 60℃維持 1 分鐘使引子與單股模板作配 對黏合(annealing)後，並再將溫度調整至 72℃進行延長反應(extension)1 分鐘。由94℃ 1 分鐘的變性(denaturing)至 72℃ 1 分鐘的延長反應 (extension)為一個循環週期，共重複進行 30 次循環反應。再以 72℃進行 最後7 分鐘的延長反應，最後維持以 4℃冷藏保存。產生的 177 base pairs(bp) PCR 產物片段，藉以 2% 溴化乙錠(EtBr)染色的瓊脂膠(agarose gel)維持在 100V 2A 下 進行電泳分析、判斷。
(4) RFLP (限制酵素，EcoN I)
將PCR 方法所擴增的 177bp 序列產物，取出 10μl 後，搭配 NEBuffer 4 號 1.2μl，並加入 0.3μl (共 3 units)的 EcoN I 限制酵素，以滅菌的蒸餾 水配置成最終體積 20μl 的 RFLP 反應液。再將配置好的 RFLP 反應液放 入 37℃水域槽中 5 小時，使其完全反應。最後以 3%瓊脂膠進行電泳分 析，並於紫外燈下照相觀察，其產生的片段如下。
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GG type (177bp，177bp)
GA type (177bp，107bp，70bp) AA type (107bp，70bp)
ABCA1 exon7 中 SNP G1051A，經由限制酵素(EcoN I)切割後可辨認出二 種對偶基因(G allele 與 A allele)。若為 1051G allele 者，只會產生一種片 段，177bp; 1051A allele，則會產生兩種片段，107bp、70bp。因此，主要 產生177bp 與 177bp 片段者為 GG 型，而產生 177bp、107bp、70bp 片段 者為GA 型，若產生 107bp 與 70bp 者則判定為 AA 型。
B. G2706A， exon 16 (V771M)
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(1) 引子序列(primer)
Forward Oligo: 5’-CAAGTGAGTGCTTGGGATTG-3’
Reverse Oligo: 5’-TGCTTTTATTCAGGGACTCCA -3’
(2) PCR 反應液的試劑量
a. DNA template (50 ng/μL) 2 μl b. MgCl2 2 μl c.10X ProTaq Buffer 2.5 μl d. 去氧核苷三磷酸 (2.5 mM) 2 μl e. primer forward、reverse (10μM) 各 1 μl f. ProTaq polymerase (2 unit/μl) (Pro Tech) 0.5 μl g. 滅菌蒸餾水(ddH2O) 14 μl 最終體積為 25 μl
(3) PCR 反應步驟
將配置好之 PCR 反應液，採熱啟動(hot start)的方式，待溫度到達 94
℃後，將 PCR 反應液放入，並以 94℃加熱 5 分鐘使 DNA 雙股螺旋先進 行預變性 (pre-denature step)，接著以高溫 94℃維持 50 秒使 DNA 雙股模 板變性分離(denaturing)，再以 62℃維持 40 秒使引子與單股模板作配對黏 合(annealing)後，並再將溫度調整至 72℃進行延長反應(extension)30 秒。
由94℃ 50 秒的變性(denaturing)至 72℃ 30 秒的延長反應(extension)為一 個循環週期，共重複進行34 次循環反應。再以 72℃進行最後 5 分鐘的延 長反應，最後維持以4℃冷藏保存。產生的 350 base pairs(bp) PCR 產物
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片段，藉以2% 溴化乙錠(EtBr)染色的瓊脂膠(agarose gel)維持在 100V 2A 下 進行電泳分析、判斷。
(4) RFLP (限制酵素，BsaA I)
將PCR 方法所擴增的 350bp 序列產物，取出 10μl 後，搭配 NEBuffer 3 號 1.5μl，並加入 0.3μl (共 3 units)的 BsaA I 限制酵素，以滅菌的蒸餾 水配置成最終體積 20μl 的 RFLP 反應液。再將配置好的 RFLP 反應液放 入 37℃水域槽中 5 小時，使其完全反應。最後以 3%瓊脂膠進行電泳分 析，並於紫外燈下照相觀察，其產生的片段如下。
GG type (252bp，98bp)
GA type (350bp，252bp，98bp) AA type (350bp，350bp)
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ABCA1 exon16 中 SNP G2706A，經由限制酵素(BsaA I)切割後可辨認出 二種對偶基因(G allele 與 A allele)。若為 2706G allele 者，只會產生兩種 片段，252bp 和 98bp; 2706A allele，則只產生一種片段，350bp。因此，
主要產生252bp 和 98bp 片段者為 GG 型，而產生 350bp、252bp、98bp 片段者為GA 型，若產生 350bp 與 350bp 者則判定為 AA 型。
C. A3044G， exon 18 (I883M)
(1) 引子序列(primer) Forward Oligo:
5’-GAGAAGAGCCACCCTGGTTCCAACCAGAAGAGGAT-3’
Reverse Oligo: 5’-AAGGCAGGAGACATCGCTT -3’
(2) PCR 反應液的試劑量
a. DNA template (50 ng/μL) 2 μl
b. MgCl2 2 μl
c.10X ProTaq Buffer 2.5 μl
d. 去氧核苷三磷酸 (2.5 mM) 2 μl
e. primer forward、reverse (10μM) 各1 μl f. ProTaq polymerase (2 unit/μl) (Pro Tech) 0.5 μl
g. 滅菌蒸餾水(ddH2O) 14 μl
最終體積為 25 μl
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(3) PCR 反應步驟
將配置好之 PCR 反應液，採熱啟動(hot start)的方式，待溫度到達 94
℃後，將 PCR 反應液放入，並以 94℃加熱 5 分鐘使 DNA 雙股螺旋先進 行預變性 (pre-denature step)，接著以高溫 94℃維持 50 秒使 DNA 雙股模 板變性分離(denaturing)，再以 62℃維持 35 秒使引子與單股模板作配對黏 合(annealing)後，並再將溫度調整至 72℃進行延長反應(extension)45 秒。
由94℃ 50 秒的變性(denaturing)至 72℃ 45 秒的延長反應(extension)為一 個循環週期，共重複進行32 次循環反應。再以 72℃進行最後 5 分鐘的延 長反應，最後維持以4℃冷藏保存。產生的 129 base pairs(bp) PCR 產物 片段，藉以2% 溴化乙錠(EtBr)染色的瓊脂膠(agarose gel)維持在 100V 2A 下 進行電泳分析、判斷。
(4) RFLP (限制酵素，EcoR V)
將PCR 方法所擴增的 129bp 序列產物，取出 10μl 後，搭配 NEBuffer 3 號 1.6μl 及 BSA 0.2μl，並加入 0.3μl (共 3 units)的 EcoR V 限制酵素，
以滅菌的蒸餾水配置成最終體積20μl 的 RFLP 反應液。再將配置好的 RFLP 反應液放入 37℃水域槽中 7 小時，使其完全反應。最後以 3%瓊脂 膠進行電泳分析，並於紫外燈下照相觀察，其產生的片段如下。
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AA type (94bp，35bp)
GA type (129bp，94bp，35bp) GG type (129bp，129bp)
ABCA1 exon18 中 SNP A3044G，經由限制酵素(EcoN I)切割後可辨認出 二種對偶基因(G allele 與 A allele)。若為 3044A allele 者，會產生兩種片 段，94bp 與 35bp; 3044G allele，則只會產生一種片段，129bp。因此，主 要產生 94bp 與 35bp 片段者為 AA 型，而產生 129bp、94bp、35bp 片段 者為GA 型，若產生 129bp 與 129bp 者則判定為 GG 型。