IкBα 是 NF-кB 訊息傳遞途徑裡非常重要的抑制蛋白，其主要的功能是捉住 NF-кB，使其無法遷移 (translocate) 至細胞核內並促使目標基因的轉錄。因此，
抑制 IкBα 的降解反應將是個不錯的藥物標靶目標。我們希望藉由西方墨點法觀 察各 aminofuran-linked-benzimidazole 系列衍生物抑制 IкBα 降解的能力，藉此比 較並分辨出能夠最有效地抑制 IкBα 進行降解反應的衍生物。在藥物篩選的過程 中，我們利用小鼠的胚胎纖維細胞株 NIH3T3 細胞做為篩選平台 (platform)。
NIH3T3 細胞在經過 24 小時的細胞飢餓 (cell starving) 動作後，加入 DMSO (控 制組) 或 20 M 的 aminofuran-linked-benzimidazole 系列衍生物 (#1410、#1411、
#1412、 #1413、 #1422 、 #1423 、#1424 、#1425 、 #1426 、 #1427) 至細胞並在 37.℃培養 2 小時。之後，加入 5 ng/ml 腫瘤壞死因子 TNF-α，並再培養 20 分鐘
以活化 NF-кB 活動。最後，利用西方墨點法偵測細胞內的 IкBα 與 α-tubulin 蛋白 質含量。圖 1B 的結果顯示，加入 5 ng/ml TNF-α 活化的細胞內的 IкBα (lanes 2、
4、6、8、10)因為會進行降解 (degradation) 反應，因此 IкBα 蛋白質含量會比沒 加入 5 ng/ml TNF-α 活化的細胞內的 IкBα (lanes 1、3、5、7、9) 蛋白質含量來得 少。但是同樣是在 TNF-α 活化的情況下，在加了 20 µM #1412 後的細胞內的 IкBα 蛋白質含量與控制組及其他衍生物 (#1410、 #1411、 #1413) 比較有顯著的較 多，這結果證明 #1412 能夠更有效地抑制 IкBα 進行降解反應。圖 1C、1D 的結 果與圖 1B 相似，證明了 20 μM 的 #1412 相較於其他相同濃度的同系列衍生物 (#1422、 #1423、 #1424、 #1425、 #1426、 #1427) 有較好的抑制 IкBα 降解 (degradation) 的能力。
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4.2 #1412 抑制 NF- кB 訊息傳遞途徑的主要分子作用機制:
4.2.1 #1412 抑制 NIH3T3 細胞內 TNF-α 活化之 p65 蛋白的細胞遷 移(translocation)活動
在初步篩選出 #1412 具有最好的抑制 IкBα 降解的能力後，我們希望能夠更 深入地探討 #1412 對於抑制 NF-кB 訊息傳遞途徑的分子作用機制。NF-кB 的細 胞核遷移 (translocation) 活動是 NF-кB 訊息傳遞途徑裡非常重要的過程。因此，
我們接下來的實驗便是要觀察 #1412 是否也能夠抑制 NF-кB 的細胞核遷移活動。
NIH3T3 細胞在經過 24 小時的細胞飢餓 (cell starving) 動作後，加入 DMSO (控 制組) 或 20 M 的 #1412 至細胞並在 37.℃培養 2 小時。之後，加入 5 ng/ml TNF-α 並培養 20 分鐘以活化 NF-кB 活動。為了證實 #1412 能夠抑制 NF-кB 從細胞質 遷移至細胞核內，我們藉由抽取細胞核內蛋白，之後再透過西方墨點法去鑑定加 了#1412 後細胞核內的 p65 蛋白質含量 (p65 為 NF-кB 的其中一個成員)。根據圖
2.1，加入 5 ng/ml TNF-α 活化的細胞內的 p65 蛋白 (lanes 2、4 ) 因為會進行細胞
核內遷移活動，因此收集到的核內的 p65 蛋白質含量會比沒加入 5 ng/ml TNF-α 活化的細胞核內的 p65 蛋白質含量 (lanes 1、3) 來得多。但是同樣是在加入 5 ng/ml TNF-α 活化的情況下，在加了 20 µM #1412 後的細胞核內蛋白的 p65 量 與控制組比較有顯著的減少，這結果證明了#1412 能夠有效的抑制 NF-кB 的細 胞核內遷移，使其無法從細胞質進入細胞核內，因此細胞核內的 p65 量會比控制 組的 p65 量來得少。30
4.2.2 #1412 抑制 NIH3T3 細胞內 TNF-α 活化之 IкBα 蛋白的降解 (degradation)反應
為了進一步證實#1412 能夠直接參與 IкBα 的降解反應，所以我們利用不同 濃度的 #1412 進行了一個劑量相關 (dose-dependent) 的實驗，藉此觀察在不同 濃度 #1412 的影響下，NIH3T3 細胞內的 IкBα 表現差異。NIH3T3 細胞在經過 24 小時的細胞飢餓 (cell starving) 動作後，分別加入 DMSO (0 µM)或不同濃度的
#1412 (10 , 20 , 40 µM) 至細胞並在 37.℃培養 2 小時。之後，加入 5 ng/ml 腫瘤 壞死因子 TNF-α，並再培養 20 分鐘以活化 NF-кB 活動。最後，再利用西方墨點 法偵測細胞內的 IкBα 與 α-tubulin 蛋白質含量。圖 2.2 的結果顯示，在同樣加入 5 ng/ml TNF-α 活化的情況下 (lanes 2、4、6、8)，控制組的 IкBα (lanes 2) 會進 行磷酸化反應而被降解掉。但隨著#1412 的濃度增加 (lanes 4、6、8)，IкBα 降解 所受到的抑制越強，因此細胞內的 IкBα 蛋白質含量也越高。這個結果證明了
#1412 與 IкBα 降解反應有直接的抑制關係。
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4.2.3 #1412 抑制 NIH3T3 細胞內 TNF-α 活化之 IкBα 蛋白的磷酸 化(phosphorylation)反應
IкBα 的磷酸化反應在 NF-кB 訊息傳遞途徑裡扮演著非常重要的角色。IкBα 的磷酸化反應是構成 IкBα 進行泛素蛋白酶反應 (ubiquitination)，並進而導致 IкBα 被 26S 蛋白酶降解的主要原因。因此，我們接下來的實驗便是要觀察#1412 是 否 也 同 樣 能 夠 抑 制 IкBα 的 磷 酸 化 反 應 ， 所 以 進 行 了 一 個 時 間 相 關 (time-dependent) 的實驗。透過利用不同時間點的 TNF-α ( 0 , 5 , 10 , 20 min ) 去 誘導 NF-кB 活動的進行，並藉此來觀察磷酸化後的 IкBα 在 NIH3T3 細胞內的表 現量。NIH3T3 細胞在經過 24 小時的細胞飢餓 (cell starving) 動作後，加入 DMSO (控制組) 或 20 M 的#1412 至細胞並在 37.℃培養 2 小時。之後，分別加入 0 , 5 , 10, 20 min 的 5 ng/ml TNF-α 去活化 NF-кB 活動。最後，再利用西方墨點法偵測 細胞內 phospho-IкBα , IкBα 與 α-tubulin 蛋白質含量。根據圖 2.3，在還沒加入 20 µM #1412 前 (lanes 1、2、3、4)，在 5 分鐘的時候仍然還可以看到 IкBα 磷酸化 所產生的 phospho-IкBα，然後 phospho-IкBα 在 10、20 分鐘後就會開始被蛋白酶 降解掉而逐漸消失。但是在加上 20 µM #1412 後 (lanes 5、6、7、8)，可以發現 所產生的 phospho-IкBα 與加藥前比較明顯的減少了許多。這個結果證明了 #1412 能夠有效地抑制住 IкBα 的磷酸化反應。除此之外，隨著 TNF-α 的活化，會誘使 IкBα 開始進行降解反應並導致 IкBα 蛋白質含量逐漸減少 (lanes 1、2、3、4)，
但是在加入 20 µM 的 #1412 後，IкBα 蛋白質含量與加藥前比較卻沒有明顯的減 少 (lanes 5、6、7、8)。這個結果也進一步證實了 #1412 能夠藉由抑制 IкBα 的 磷酸化反應，並進而抑制 IкBα 進行降解反應。
結論：從以上的實驗結果來看，我們認為 #1412 可能是透過抑制 NF-кB 的抑制 蛋白--IкBα 的降解反應，進而達到影響 NF-кB 訊息傳遞途徑的效果。
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4.3 #1412 的抗癌效果:
4.3.1 #1412 對於不同類型腫瘤細胞生長的抑制能力比較
許多研究證實 NF-кB 的過度活化與很多癌症的引發有關，例如：子宮頸癌、
肺癌、淋巴癌等等。因此，為了證明#1412 具有抗癌的效果，我們接下來利用不 同的腫瘤細胞株來進行細胞存活檢測實驗 (cell viability assay)。在細胞存活檢測 實驗裡，我們總共使用了 HeLa、A549、H1299、以及 Jurkat 這四種不同的腫瘤 細胞株來進行 #1412 的抗癌測試。其中 HeLa 是子宮頸癌細胞、A549 與 H1299 皆是肺癌細胞、而 Jurkat 則是一種 T 淋巴癌細胞。在進行細胞治療 (cell treatment) 的時候，將不同濃度的#1412 (0 , 5 , 10 , 20 µM) 分別加入不同類型的腫瘤細胞株 內 ( HeLa , A549 , H1299, Jurkat ) 並在 37.℃培養二十四小時。二十四小時後，
利用 MTT 或 MTS 檢測各腫瘤細胞株的細胞存活率。其中 MTT 的檢測波長為 540 nm 而 MTS 的檢測波長為 490 nm。每個樣品皆重複測定 3 次以增加實驗準 確率。圖 3.1 的結果顯示在加了#1412 二十四小時後，不同濃度的 #1412 對於各 種癌細胞的生長所帶來的影響。#1412 並無法抑制 A549 細胞的生長，但卻能夠 十分有效地抑制 H1299 細胞以及 Jurkat 細胞的生長；而相較於 H1299 細胞以及 Jurkat 細胞，#1412 只能稍微抑制 HeLa 細胞的生長。 #1412 對於 HeLa 細胞的 IC50大約為 18 M；而對於 H1299 細胞的 IC50大約為 4 M 以及對於 Jurkat 細胞 的 IC50大約為 3.5 M。根據實驗結果，#1412 對於淋巴癌細胞的生長抑制能力最 為良好。
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4.3.2 #1412 有效地抑制淋巴癌細胞株 Jurkat 細胞的生長
由於#1412 對於淋巴癌細胞株 Jurkat 細胞的生長抑制效果最好，因此我們接 下來的實驗主要會集中在淋巴癌細胞上做更深入地探討。為了進一步探討 #1412 對於 Jurkat 細胞的抗癌效果，我們分別觀察 Jurkat 細胞在加入不同濃度的 #1412 ( 0, 2 , 4 , 8 µM) 十二小時、二十四小時、以及四十八小時後的生長情況。之後，
利用 MTS 檢測 Jurkat 細胞的細胞存活率。MTS 的檢測波長為 490 nm。每個樣 品皆重複測定 3 次以增加實驗準確率。根據圖 3.2，在加入 #1412 十二小時後 , Jurkat 細胞的生長在 4 µM 的濃度下便會開始受到抑制；並在 8 µM 的時候，其 細胞存活率只剩下大約 20%。在加入#1412 二十四小時後 , Jurkat 細胞的生長只 需在 2 µM 的濃度下便會開始受到抑制；並在 8 µM 的時候，其細胞存活率只剩 下大約 10%。在加入#1412 四十八小時後, 只需要 4 µM 的濃度，便能夠完全地 抑制住 Jurkat 細胞的生長。
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4.3.3 #1412 誘導 Jurkat 細胞進行細胞凋亡(apoptosis)活動
造成細胞停止生長並死亡的方式主要有兩種： 分別為細胞凋亡 (apoptosis) 以及細胞壞死 (necrosis)。細胞凋亡是生物體維持正常生理功能的一種行為，由 外接收死亡訊號，或由內自發性的死亡；而細胞壞死則是細胞遭受物理性或生物 毒物的剌激而導致細胞膜破裂，且通常會附隨引發發炎反應 (Kanduc et al., 2002;
Mullen, 2004)。因此，在證明了#1412 能夠有效地抑制 Jurkat 細胞生長後，接下 來我們想要觀察#1412 主要是透過哪個途徑而導致 Jurkat 細胞死亡的。在抽取細 胞內蛋白質前，將 8 µM #1412 加入淋巴癌細胞株 Jurkat 細胞內並在 37.℃培養 6 小時及 12 小時。之後，再利用西方墨點法偵測細胞內的 caspase-3、PARP-1 與 α-tubulin 蛋白質含量。當細胞進行凋亡時，procaspase-3 以及 PARP-1 便會裂解 產生 caspase-3 以及 PARP-1 cleavage。Procaspase-3 以及 PARP-1 的這種蛋白裂解 反應目前已被許多研究當作細胞凋亡時很重要的指標。根據圖 3.3，第一排 bands 顯示的是 procaspase-3 的位置，而第二以及第三排 bands 顯示的則是 procaspase-3 裂解產生的 caspase-3 p20 以及 caspase-3 p17 的位置。第四排 bands 為全部長度的 PARP-1，而在其下面的第五排 bands 則是 PARP 裂解產生的 PARP-1 cleavage。
最下面一排 bands 則是 α-tubulin 的位置。cycloheximide 為一種蛋白合成抑制劑，
已被證實能夠有效地造成細胞凋亡，故在這個實驗裡採用了 cycloheximide 作為 正極的對照組 (positive control) 來比較。根據結果，在加了#1412 六小時後，皆 可發現有 caspase-3 以及 PARP-1 cleavage 的產生；但在加了#1412 十二小時後，
由於#1412 的毒性過於強烈，procaspase-3 及 PARP-1 幾乎已經被切光了，只能偵 測到少許的 caspase-3 以及 PARP-1 cleavage。這個結果證明了#1412 能夠有效地 誘導 Jurkat 細胞進行細胞凋亡活動。
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4.3.4 #1412 抑制 Jurkat 細胞內 TNF-α 活化之 IкBα 蛋白的降解 (degradation)反應
NF-кB 在一些抑制凋亡蛋白 (anti-apoptotic proteins) 的調控上扮演著非常重 要的角色，因此透過抑制 NF-кB 的過度表現，已被證實能夠促使大部份的腫瘤 細胞進行細胞凋亡的動作。我們認為 #1412 誘使 Jurkat 細胞進行細胞凋亡的動 作，與 NF-кB 訊息傳導途徑受到抑制有關。因此，接下來的實驗主要是要證明
#1412 可能是藉由抑制 NF-кB 的活化，進而抑制其下游的抑制凋亡蛋白的表現，
並誘使 Jurkat 細胞進行細胞凋亡。Jurkat 細胞在經過 24 小時的細胞飢餓 (cell starving) 動作後，加入 DMSO (控制組) 或 20 µM #1412 至細胞並在 37.℃培養 2 小時。之後，加入 5 ng/ml 腫瘤壞死因子 TNF-α，並再培養 20 分鐘以活化 NF-кB 活動。最後，再利用西方墨點法偵測細胞內的 IкBα 與 α-tubulin 蛋白質含量。圖
3.4 的結果顯示，加入 5 ng/ml TNF-α 活化的細胞內的 IкBα (lanes 2、4) 因為會進
行降解 (degradation) 反應，因此 IкBα 蛋白質含量會比沒加入 5 ng/ml TNF-α 活 化的細胞內的 IкBα (lanes 1、3) 蛋白質含量來得少。但是同樣是在 TNF-α 活化 的情況下，在加了 20 µM #1412 後的細胞內的 IкBα 蛋白質含量與控制組比較卻 有顯著的較多。這個結果說明了#1412 同樣能夠抑制在 Jurkat 細胞內的 IкBα 降 解反應，並間接證明了#1412 能夠抑制 Jurkat 細胞內的 NF-кB 的活化。36
4.4 #21026 的抗癌效果:
4.4.1 #1412 與其進階衍生物 #21026 在 NIH3T3 細胞之 IкBα 降解 反應的抑制能力比較
#21026 為孫仲銘教授實驗室藉由修飾 #1412 的周邊官能基而所產生出來的 進階衍生物。為了比較出#21026 與 #1412 哪個化合物具有更好的 NF-кB 抑制能 力及生物活性，我們再次以 NIH3T3 細胞作為篩選的平台。NIH3T3 細胞在經過
#21026 為孫仲銘教授實驗室藉由修飾 #1412 的周邊官能基而所產生出來的 進階衍生物。為了比較出#21026 與 #1412 哪個化合物具有更好的 NF-кB 抑制能 力及生物活性，我們再次以 NIH3T3 細胞作為篩選的平台。NIH3T3 細胞在經過