BA 純度之影響

已知 BA 於空氣中會漸漸氧化成 benzoic acid (BZA)，2003 年

Poliakoff⁶⁴團隊發表在高溫高壓之實驗條件下，o-PD 與 BZA 於純水中反 應，可以獲得單取代苯並咪唑化合物。當我們以 sVESI/MS 探討 o-PD 與 BA 反應的各項研究時，所使用的 BA 並未純化而可能帶有少量的 BZA，

為了確認我們所使用的實驗條件下 BZA 是否會與 o-PD 反應生成單取代

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產物，於是以 sVESI/MS 線上即時偵測 o-PD 與 BZA 之反應過程，以釐 清 BA 中的不純物 BZA 對我們已得實驗結果的影響程度。

o-PD 與 BZA 於純水中反應的實驗步驟同 o-PD 與 BA 之反應，當將

5 mL 的 0.02 M BZA 加入 10 mL 含有 5.98*10^-4 M o-PD 的水溶液後，

sVESI/MS 質譜圖立即顯現 m/z 123.1 [BZA + H]⁺訊號(圖 4-15 B)，但沒 有 m/z 197.3、m/z 195.3 和 m/z 285.3 的生成，反應 60 分鐘後 sVESI/MS 質譜圖(圖 4-15 C)並無明顯的改變。

圖 4-15 不同水溶液之 sVESI/MS 質譜圖: (A) o-PD；

(B) 加入 BZA 12 秒後；(C) 加入 BZA 80 分鐘後

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檢視 o-PD 與 BZA 於純水中反應之TIC 與 EIC 圖(圖 4-16)，發現[o-PD + H]⁺ (m/z 109.2)強度於反應 80 分鐘內呈現平穩狀態並沒有什麼變化，同 時也無中間產物和最終產物訊號的產生，這結果和o-PD 與 BA 於純水中 反應 5 分鐘就產生大量的中間產物和最終產物截然不同，證實在我們所 使用的實驗條件下，BA 化合物中的不純物 BZA 並不會與 o-PD 反應生成 單取代基產物而影響 sVESI/MS 線上即時偵測的結果，實驗中所觀察到 的最終產物完全是來自 o-PD 與 BA 之反應。不過由於 BZA 是弱酸，o-PD 與 BZA 於純水中反應之速率，可能會因為酸催化作用而加快。

圖 4-16 o-PD 與 BZA 於水溶液中反應之 TIC 圖(A)和 EIC 圖:

m/z 109.2 (B)；m/z 197.1 (C)；m/z 195.1 (D)

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4.2.2 不同條件下沖泡茶葉所釋放之化合物

sVESI/MS 除了可以長時間線上即時偵測有機反應中各個化合物之消 長，利用 sVESI 傳輸樣品液至 ESI 游離源所需的時間只需 10~20 秒的優 點，sVESI/MS 裝置很適合應用於觀察快速變化(數分鐘內)之系統。為了 檢視此項應用的可行性，我們模擬泡茶的過程，以 sVESI/MS 線上即時 偵測一分鐘內，不同茶品、沖泡溫度和沖泡次數之茶湯所含特定化合物 的變化。

茶葉含有多種化學成分，以 sVESI/MS 分析時依據分析物之物性選用 適當的 ESI 操作模式，茶氨酸 (L-theanine) 和咖啡因 (caffeine) 適合以 正電模式分析 (圖 4-17)，奎寧酸 (quinic acid) 及兒茶素則以負電模式分 析，兒茶素主要包含表兒茶素 (epicatechin, EC)、表沒食子兒茶素

(Epigallocatechin, EGC)、表兒茶素沒食子酸酯 (Epicatechin gallate, EGC) 及表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin gallate, EGCG) 等四 種化合物為主 (圖 4-18)。

圖 4-17 以正電模式分析之化合物

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圖 4-18 以負電模式分析之化合物

我們先用 sVESI/MS 線上即時偵測以 80^oC 熱水沖泡綠茶時之茶湯，

實驗步驟如圖 4-19，首先將 80^oC 熱水置入樣品瓶中記錄其質譜圖做為背 景值，再盡快放入已知重量的茶葉於熱水中，同時收集一分鐘內的 sVESI/MS 質譜圖

圖 4-19 以 sVESI/MS 線上即時偵測茶湯中成分之實驗步驟:

(1) 將特定溫度的水置入樣品瓶；(2) 放入茶葉；(3) 記錄質譜圖

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圖 4-20 為沖泡一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(+)質譜圖，由於所分析的 茶湯並未經分離，質譜圖中有許多訊號的產生，其中可以辨識的有茶氨 酸(m/z 175.0)和咖啡因(m/z 194.9)，並進一步以 MS/MS 質譜圖確認這兩個 化合物之結構。以 5 eV 碰撞能對 m/z 175.4 離子進行撞誘導解離(collision induced dissociation, CID)，並無法讓其產生斷片，將碰撞能提升為 10 eV 時，就可以觀察到 m/z 158.4 斷片離子，繼續將能量到 12 eV 以上，則除 了 m/z 158.4 的斷片離子外，也出現了 m/z 130.4 斷片離子，隨著碰撞能量 越強有更多的離子斷片產生(圖 4-21)。

圖 4-20 以 80^oC 熱水沖泡綠茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(+)質譜圖

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圖 4-21 不同碰撞能下 m/z 175.4 之 CID 質譜圖:

(A) 5 eV；(B) 10 eV；(C) 12 eV；(D) 15 eV

m/z 175.4 之 CID 結果確認其為質子化茶氨酸，圖 4-22 為其斷裂之途

徑，m/z 175.4 斷裂時先失去 NH₃形成 m/z 158.4，更高的能量再失去 CH2=CH2產生 m/z 130.4。

圖 4-22 m/z 175.4 離子之斷裂途徑

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10 eV 的碰撞能不足以使 m/z 195.4 產生斷片(圖 4-23)，碰撞能達 12 eV 時有微量的 m/z 138.4 離子斷片產生，15 eV 碰撞能生成更多的 m/z 138.4，達 20 eV 時除了有 m/z 138.4 的斷片外也生成少量的 m/z 110.4 離 子斷片。m/z 195.4 之 CID 結果確認其為質子化咖啡因，而其於 CID 下之 斷裂途徑如圖 4-24，首先失去 C₂H3NO 後形成 m/z 138.4，更高的碰撞能 量再失去 CO 產生 m/z 110。

圖 4-23 不同碰撞能下 m/z 195.4 之 CID 質譜圖:

(A) 10 eV；(B) 12 eV；(C) 15 eV；(D) 20 eV

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圖 4-24 m/z 195.4 之斷裂途徑

無論是 m/z 175.4 及 m/z 195.4 的 CID 質譜圖皆吻合茶氨酸和咖啡因的 斷片途徑，由此確認以 80^oC 熱水沖泡一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(+)質譜 圖中 m/z 175.4 及 m/z 195.4 分別為茶氨酸及咖啡因，至於 m/z 104.0、m/z 212.9、m/z 343.9、m/z 350.6 及 m/z 380.5 等離子，其強度會隨著茶葉沖泡 時間的增長而上升 (圖 4-25)，顯示這些離子應來自於茶葉，目前無法判 定這些離子為何。

圖 4-25 以 80^oC 熱水沖泡綠茶一分鐘內，

茶湯中化合物離子強度與時間之關係圖

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改以檢視 sVESI/MS(-)質譜圖(圖 4-26)，可以發現多種吻合茶葉中已 知化合物的離子，分別有奎寧酸(m/z 191.4)、EC ( m/z 289.5)、EGC (m/z 305.4) 及 EGCG (m/z 457.4)，其中去質子化奎寧酸強度具有強烈的優勢，

兒茶素的訊號強度則不強，須將 m/z 280-480 區間之質譜圖放大後才能觀 測得到。圖 4-26 的 m/z 173.4 為去質子化的茶氨酸離子。

圖 4-26 以 80^oC 熱水沖泡綠茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(-)質譜圖